Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

ברצוננו להודות לד"ר ג'וליה פיין על רעיונותיה ודיון בה במהלך תהליך יצירת הפרוטוקול, כמו גם לד"ר קסנדרה ורנייה על הערותיה המועילות במהלך העריכה. חומרים אלה תרמו לפרויקטים שנתמכו בחלקם על ידי הקרן לחקר המזון והחקלאות, תחת מענק ID 549025.

1. אפשרות מיצוי דבורים המונית 1: הסרה עצמית של הזחל
<ol><li>כלבו מלכת דבורי דבש על מסגרת לנגסטרות' ריקה ומצוירת והחזירו אותה למושבה שלה. אפשרו למלכה להטיל ביצים על מסגרת זו במשך 24 שעות.<ol>
<li>בדקו את המסגרת לאחר 24 שעות כדי לוודא שרוב תאי המסרק מכילים ביצים שהוטלו לאחרונה. בהתאם למלכה ולמושבה, ביצי...

כאן תיארנו שיטות המפרטות כל שלב בתהליך ההגברה והכנת מלאי האינוקולום של הנגיף, כולל איסוף זחלים והתפשטות הנגיף, מיצוי וריכוז הנגיף, כמו גם טיפול נגיפי בצורה של ניסויי האכלה בכלובים. שיטות אלה מאפשרות ייצור של חלקיקי נגיף טהורים למחצה (איור 4), שיעילותם ניתנת לכימות באופן עקב?...

דבורי הדבש (Apis mellifera) ממלאות תפקיד קריטי בנוף החקלאי העולמי המודרני, אך כיום הן סובלות משילוב של גורמי עקה ביוטיים וא-ביוטיים, כולל חשיפה לחומרי הדברה, מספוא לקוי, טפילים ופתוגנים 1,2. אחד הפתוגנים החשובים ביותר לדאגה הם וירוסים, שרבים מהם מווסתים על ידי עוד אחד מגורמי העקה העיקריים של דבורת הדבש, קרדית Varroa הטפילית (Varroa destructor). נגיפים אלה יכולים לגרום למגוון של השפעות שליליות בדבורי הדבש, כולל ירידה בהישרדות גזעית, פגמים התפתחותיים ושיתוק שיכולים להוביל לקריסת כוורת מוחלטת הן לפני תקופות החורף והן לאחריהן 3,4,5. למרות שחלה התקדמות מבטיחה בפיתוח טכנולוגיות המשמשות למאבק בהדבקה בנגיף 6,7,8,9, הדינמיקה שבה וירוסים רבים מתפשטים, מתפשטים ומתקשרים בתוך דבורת דבש או מושבה עדיין לא מובנת היטב 5,10 . הבנת הביולוגיה הבסיסית של אינטראקציות בין דבורי דבש ונגיפים והקשרים שלהן עם גורמים סביבתיים אחרים היא קריטית לפיתוח טכניקות יעילות לניהול וירוסים.
עם זאת, חקר האינטראקציות בין דבורי הדבש לנגיף מציב אתגרים עם גורמים ידועים ובלתי ידועים רבים המסבכים את התהליך. אלה כוללים אינטראקציות עם תזונה11,12, חשיפה לחומרי הדברה13 ורקע גנטי לדבורים14,15. גם כאשר מתמקדים בהדבקה בנגיף בלבד, סיבוכים נפוצים משום שלאוכלוסיות דבורי הדבש, המנוהלות והפראיות כאחד, יש תמיד מידה מסוימת של זיהום בנגיף הרקע, אם כי לעתים קרובות מבלי לבטא תסמינים חריפים 16,17, וההשפעות של הדבקה בנגיף אינן מובנות היטב18. זה הפך את המחקר של השפעות וירוס דבורת הדבש קשה להתנתק.
מחקרים רבים על נגיף דבורי הדבש השתמשו בזיהומים נסיבתיים של הנגיף כדי לחפש אינטראקציות עם גורמי עקה אחרים, וראו כיצד זיהומי הרקע משתנים עם טיפולים אחרים 12,19,20,21. בעוד שגישה זו הצליחה לזהות השפעות חשובות, במיוחד לגלות כיצד חומרי הדברה או טיפולים תזונתיים משפיעים על רמות הנגיף ועל שכפולם, חיסון באמצעות טיפול בנגיף של תוכן וריכוז ידועים הוא קריטי לבדיקה ניסיונית של דינמיקת זיהום בנגיף. עם זאת, הפרדת הטיפול הניסיוני מזיהום הרקע עלולה גם היא להציב אתגרים. במחקרי שדה, חוקרים הבחינו בין זנים של נגיף כנף מעוות (DWV) כדי לספק ראיות להעברת הנגיף מדבורי דבש לדבורי בומבוס22, אך שימוש בגישה זו יהיה קשה בקרב דבורי הדבש בלבד. שיבוטים זיהומיים של וירוסים הם כלי רב עוצמה, לא רק למעקב אחר זיהום 23,24,25 אלא למחקרי גנטיקה הפוכה של נגיפי דבורי דבש ולמחקר אינטראקציה בין וירוסים למארח 26,27,28. עם זאת, ברוב המקרים, שיבוטים זיהומיים עדיין נדרשים כדי למלא את מחזור ההדבקה בתוך התאים כדי לייצר חלקיקים. חלקיקים כאלה מועדפים כאנוקולה לטיפולים ניסיוניים מכיוון שהזיהום שלהם גבוה יותר מהרנ"א הנגיפי העירום והחיסון בגנומים עטוף מחקה זיהום טבעי.
גם הייצור של אינוקולה של נגיף דבורת הדבש הטהור והלא מזוהם (זני וירוסים מסוג בר או כאלה שמקורם בשיבוטים זיהומיים) מציב אתגרים. אלה נובעים בעיקר מהקשיים בהשגת קו אמין, המשכפל ברציפות, של תאי דבורת דבש נטולי וירוסים, כדי לייצר נגיפים בעלי זן טהור29,30. בעוד שכמה קווי תאים יוצרו, מערכות אלה נותרו לא מושלמות; ובכל זאת, יש תקווה שניתן יהיה לייצר קו תאים בר קיימא29, שיאפשר שליטה עדינה יותר על ייצור וירוסים וחקירה. עד שקו כזה יהיה זמין באופן נרחב, רוב פרוטוקולי ייצור הנגיף ימשיכו להסתמך על שימוש בייצור וטיהור של וירוסים in vivo 18,31,32,33,34. גישות אלה כוללות זיהוי וטיהור של חלקיקי נגיף בעלי עניין (או ייצור שיבוט מדבק) ושימוש בהם כדי להדביק דבורי דבש, בדרך כלל כגלמים. הגלמים מוזרקים עם נגיף המטרה ולאחר מכן מוקרבים, וחלקיקים נוספים מופקים ומטוהרים. עם זאת, מכיוון שדבורים אינן נקיות מווירוסים מלכתחילה, תמיד יש מידה מסוימת של זיהום מעקבות של וירוסים אחרים בכל תרכיז כזה, ולכן יש לנקוט בזהירות רבה בבחירת דבורים עם סבירות נמוכה לזיהומי רקע. יתר על כן, שיטות להסרת הגלמים מתאי המסרק לשימוש בפרוטוקולים אלה33 הן עתירות עבודה מאוד ויכולות לגרום ללחץ אצל הדבורים, ולהגביל את הייצור באמצעים אלה18,32. כאן אנו מדווחים על שיטה חלופית המאפשרת הסרה בקנה מידה גדול של זחלים עם מעט עבודה ופחות לחץ מכני על הדבורים.
לאחר שהגלמים מתקבלים ומוזרקים להם אינוקולום הנגיף ההתחלתי, יש לדוגר אותם כדי לספק לנגיף זמן להשתכפל. לאחר מכן, ניתן לעבד חלקיקי נגיף המיוצרים לצורה שמישה כדי להדביק דבורים ניסיוניות. ישנן מספר שיטות פשוטות להשיג זאת, כולל שימוש בהומוגנט גולמי35,36 או המולימפה שנוצר מדבורים נגועות בנגיף כמקור לזיהום37. שיטות אלה יעילות, אך יש להן סיכוי גדול יותר להכניס משתנים לא ידועים ממצע הרקע (למשל, גורמים אחרים בהומוגנטים של הדבורים המתות). בנוסף, רצוי לרכז את החלקיקים אם ניסוי דורש מתן מינון גדול וידוע של וירוס בפרק זמן קצר. לכן, לשליטה טובה יותר, עדיף להשתמש בשיטות המאפשרות רמה מסוימת של טיהור וריכוז של חלקיקי הנגיף. באופן כללי, סדרה של צעדי משקעים וצנטריפוגה תביא להסרת כמעט כל החומר האפשרי שאינו קשור לנגיף33.
לאחר הפקת אינוקולום מרוכז זה, כדאי לכמת את הטיטרים הנגיפיים (qPCR) ולאפיין אותו עם bioassays in vivo כדי לבחון את הכדאיות שלו ואת יכולתו לגרום לתמותה, כמו גם כדי לאשש כי titers וירוס מוגבר מתקבלים לאחר ההדבקה. ניתן להשיג זאת באמצעות ניסויי הזרקה (לתוך גלמים או מבוגרים) או ניסויי האכלה (לזחלים או למבוגרים). בעוד שכל הגישות הללו אפשריות, האכלה לקבוצות של דבורים בוגרות בכלוב היא לעתים קרובות המהירה והפשוטה ביותר. שיטת בדיקת הכלובים נמצאת בשימוש נרחב גם לבדיקת טיפולים שונים אחרים בדבורים, כולל רעילות חומרי הדברה38, התפתחות שחלה39 והשפעה תזונתית על התנהגות40,41, ולכן יכולה להוות בסיס טוב לניסויים הקושרים בין זיהום בנגיף לגורמים אחרים42.
כאן אנו מתארים שיטה אמינה לייצור כמויות גדולות של חלקיקי נגיף טהורים למחצה, מועשרים מאוד, ללא שימוש ב-ultracentrifuge יקר, כולל שיטה להסרת גלמים המפחיתה את הלחץ הנגרם והלחץ המכני על הדבורים ובדיקה ביולוגית בתפוקה גבוהה הניתנת לחזרה גבוהה לבדיקת זיהום והשפעות נגיפיות. על ידי שליטה הדוקה בטוהר האינוקולה הנגיפית, החוקרים מסוגלים להפחית את השונות בתגובה הנגיפית של דבורת הדבש ביחס לשיטות חיסון ויראליות אחרות. יתר על כן, הבדיקה הביולוגית יכולה לסנן השפעות ויראליות ברמת קבוצות קטנות באמצעות יחידות ניסיוניות הניתנות לחזרה רבה לפני שינוי קנה המידה להגדרות מציאותיות בשטח, וזה הרבה יותר עבודה אינטנסיבית לניהול. בשילוב, שתי השיטות הללו מספקות את הכלים הדרושים למחקרים שיכולים לעזור לשפר את ההבנה הכוללת שלנו של אינטראקציות פיזיולוגיות בין דבורי דבש לנגיף.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

לדבורי הדבש יש חשיבות אקולוגית וחקלאית רבה ברחבי העולם, אך הן גם נתונות למגוון לחצים המשפיעים לרעה על בריאות הדבורים, כולל חשיפה לפתוגנים נגיפיים. וירוסים כאלה יכולים לגרום למגוון רחב של השפעות הרסניות ולעתים קרובות יכולים להיות מאתגרים למחקר בשל גורמים רבים המקשים על הפרדת ההשפעות של טיפולים ניסיוניים מזיהום רקע קיים מראש. כאן אנו מציגים שיטה לייצור המוני של כמויות גדולות של חלקיקי וירוסים יחד עם בדיקה ביולוגית בתפוקה גבוהה לבדיקת זיהום והשפעות נגיפיות. כתוצאה מהיעדר הנוכחי של קו תאי דבורת דבש רציפים ונטולי וירוסים, חלקיקים נגיפיים מוגברים in vivo באמצעות גולמי דבורת דבש, המופקים מהכוורת בכמויות גדולות באמצעות מתודולוגיה מלחיצה מינימלית. לאחר מכן ניתן להשתמש בחלקיקי הנגיף האלה בבדיקות ביולוגיות של כלובי דבורי דבש כדי לבחון את כדאיות האינוקולה, כמו גם בדינמיקות שונות אחרות של זיהום בנגיף, כולל אינטראקציות עם תזונה, חומרי הדברה ופתוגנים אחרים. יתרון מרכזי של שימוש בחלקיקים כאלה הוא שהוא מקטין מאוד את הסיכויים להחדרת משתנים לא ידועים בניסויים הבאים בהשוואה לחלופות הנוכחיות, כגון זיהום באמצעות המולימפה של דבורים נגועות או הומוגנט, אם כי עדיין יש לנקוט משנה זהירות בעת מיקור הדבורים, כדי למזער את זיהום נגיף הרקע. מבחני הכלובים אינם תחליף לניסויים רחבי היקף ומציאותיים בשטח הבודקים את השפעות ההדבקה בנגיף ברמת המושבה, אלא מתפקדים כשיטה ליצירת תגובות נגיפיות בסיסיות, שבשילוב עם חלקיקי הנגיף הטהורים למחצה, יכולות לשמש ככלים חשובים לבחינת ממדים שונים של אינטראקציות פיזיולוגיות בין דבורי דבש לנגיף.

מעקב מוצלח אחר הפרוטוקולים (איורים 1) להזרקת pupal ומיצוי נגיפי אמור לייצר כמויות גדולות של חלקיקי וירוסים. עם זאת, דגימה והזרקה של גלמים שמקורם ממגוון מושבות בנקודות זמן מרובות ממקסמת את הסיכויים לרכוש וירוס מטרה עם זיהום נמוך. הדינמיקה שבאמצעותה וירוסים משכפלים ומתקשרים זה עם זה ב...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים: ראשית להפצה, חילוץ, טיהור וכימות כמויות גדולות של חלקיקי נגיף שאינם עטופים בדבורי דבש, כולל שיטה להסרת גלמי דבורת הדבש ושנית לבדיקת ההשפעות של זיהום נגיפי באמצעות בדיקה ביולוגית של כלובים בתפוקה גבוהה הניתנת לחזרה גבוהה.

הכנת אינוקולום מועשר בנגיף לזיהום אוראלי של דבורי דבש (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

הפרוטוקולים של זיהום אוראלי של הזחלים Lepidopteran עם Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

מיצוי של המרכיב EPP מן Surface EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

הכנת תאי לבלב acinar לצורך סידן ההדמיה, פגיעה בתא המדידות, וזיהום adenoviral

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

שיטות להשוואה בין חומרים מזינים בBeebread נוצרו על ידי דבורים דבש Africanized ואירופאי והשפעות על titers חלבון Hemolymph

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

בינוני אוויר עצם: הכנה ומבדק

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

דיסקציה תצפית של כלי דבש דבורים הגבי ללימודים של תפקוד הלב

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

ניטור המושבה ברמת ההשפעה של ההדברה לא קטלני על דבש דבורים

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

זיהום חיידקי הפה ו Shedding ב דרוזופילה melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

הערכת הסיכון האגרוכימי למלכות דבורת הדבש המויזות

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

בדיקת כימוטקסיס משופרת לזיהוי מהיר של כימותרפים ריזובקטריאליים באקסודות שורש

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...