Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Vorremmo ringraziare la dott.ssa Julia Fine per le sue idee e discussioni durante il processo di creazione del protocollo, così come la dott.ssa Cassondra Vernier per i suoi utili commenti durante l'editing. Questi materiali hanno contribuito a progetti che sono stati sostenuti in parte dalla Foundation for Food and Agriculture Research, nell'ambito della sovvenzione ID 549025.

1. Opzione di estrazione di massa delle api 1: auto-rimozione larvale
<ol><li>Ingabbia una regina delle api mellifere su una cornice Langstroth vuota e tirata fuori e riportala alla sua colonia. Lascia che la regina deponga le uova su questo telaio per 24 ore.<ol>
<li>Controllare il telaio dopo 24 ore per assicurarsi che la maggior parte delle celle a pettine contenga uova appena deposte. A seconda della regina e della colonia, le uova a volte non vengono deposte molto bene nelle prime 24 ore. In tal caso, attendere ul...

Qui abbiamo delineato metodi che descrivono in dettaglio ogni fase del processo di amplificazione del virus e di preparazione dello stock di inoculo, compresa la raccolta delle larve e la propagazione, l'estrazione e la concentrazione del virus, nonché il trattamento virale sotto forma di esperimenti di alimentazione in gabbia. Questi metodi consentono la produzione di particelle virali semi-pure (Figura 4), la cui efficacia può essere costantemente quantificata mediante test di mortalità...

Le api mellifere (Apis mellifera) svolgono un ruolo fondamentale nel moderno paesaggio agricolo globale, ma attualmente soffrono di una combinazione di fattori di stress biotici e abiotici, tra cui esposizione a pesticidi, foraggio scadente, parassiti e agenti patogeni 1,2. Uno dei più importanti agenti patogeni di preoccupazione sono i virus, molti dei quali sono vettorizzati da un altro dei principali fattori di stress delle api da miele, l'acaro parassita Varroa (Varroa destructor). Questi virus possono causare una serie di effetti negativi nelle api mellifere tra cui una ridotta sopravvivenza della covata, difetti dello sviluppo e paralisi che possono portare al collasso totale dell'alveare sia prima che dopo i periodi di svernamento 3,4,5. Sebbene ci siano stati progressi promettenti nello sviluppo di tecnologie utilizzate per combattere l'infezione da virus 6,7,8,9, le dinamiche con cui molti virus si propagano, si diffondono e interagiscono all'interno di un'ape o colonia di miele sono ancora poco conosciute 5,10 . Comprendere la biologia di base delle interazioni tra api e virus e le loro relazioni con altri fattori ambientali è fondamentale per lo sviluppo di tecniche efficaci di gestione dei virus.
Tuttavia, lo studio delle interazioni tra api e virus del miele pone sfide con numerosi fattori noti e sconosciuti che complicano il processo. Questi includono interazioni con la dieta11,12, esposizione ai pesticidi13 e background genetico delle api14,15. Anche quando ci si concentra solo sull'infezione da virus, le complicazioni sono comuni perché le popolazioni di api da miele, sia gestite che selvatiche, hanno sempre un certo grado di infezione da virus di fondo, anche se spesso senza manifestare sintomiacuti 16,17, e gli effetti della coinfezione da virus non sono ben compresi18. Ciò ha reso difficile districare lo studio degli effetti del virus delle api da miele.
Molti studi sul virus delle api da miele hanno utilizzato infezioni virali circostanziali per cercare interazioni con altri fattori di stress, osservando come le infezioni di fondo cambiano con altri trattamenti 12,19,20,21. Mentre questo approccio ha avuto successo nell'identificare effetti importanti, in particolare scoprendo come i pesticidi o i trattamenti dietetici influenzano i livelli e la replicazione del virus, l'inoculazione con un trattamento del virus di contenuto e concentrazione noti è fondamentale per i test sperimentali delle dinamiche di infezione da virus. Anche così, separare il trattamento sperimentale dall'infezione di fondo può anche porre delle sfide. Negli studi sul campo, i ricercatori hanno differenziato i ceppi del virus dell'ala deformata (DWV) per fornire prove della trasmissione del virus dalle api mellifere ai bombi22, ma l'uso di questo approccio sarebbe difficile solo all'interno delle api da miele. I cloni infettivi da virus sono uno strumento potente, non solo per il monitoraggio dell'infezione 23,24,25, ma per studi di genetica inversa sui virus delle api da miele e per la ricerca sull'interazione virus-ospite 26,27,28. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, i cloni infettivi sono ancora necessari per soddisfare il ciclo di infezione all'interno delle cellule per produrre particelle. Tali particelle sono preferite come inoculi per trattamenti sperimentali perché la loro infettività è superiore all'RNA virale nudo e l'inoculazione con genomi incapsulati imita un'infezione naturale.
Anche la produzione di inoculi puri e incontaminati del virus delle api del miele (ceppi virali selvatici o derivati da cloni infettivi) pone delle sfide. Questi sono principalmente dovuti alle difficoltà nell'ottenere una linea cellulare di api da miele affidabile, a replicazione continua e priva di virus per produrre virus di ceppo puro29,30. Mentre alcune linee cellulari sono state prodotte, questi sistemi rimangono imperfetti; tuttavia, c'è la speranza che una linea cellulare praticabile possa essere prodotta29, il che consentirebbe un controllo più preciso della produzione e dell'indagine del virus. Fino a quando tale linea non sarà ampiamente disponibile, la maggior parte dei protocolli di produzione di virus continuerà a fare affidamento sull'uso della produzione e purificazione di virus in vivo 18,31,32,33,34. Questi approcci comportano l'identificazione e la purificazione di particelle virali di interesse (o la produzione di un clone infettivo) e il loro utilizzo per infettare le api da miele, di solito come pupe. Le pupe vengono iniettate con il virus bersaglio e poi sacrificate, e ulteriori particelle vengono estratte e purificate. Tuttavia, poiché nessuna ape è priva di virus per cominciare, c'è sempre un certo grado di contaminazione da tracce di altri virus in qualsiasi concentrato di questo tipo e, pertanto, è necessario prestare molta attenzione nella scelta delle api con una bassa probabilità di infezioni di fondo. Inoltre, i metodi per rimuovere le pupe dalle cellule del pettine per l'uso in questi protocolli33 sono molto laboriosi e possono indurre stress nelle api, limitando la produzione con questi mezzi18,32. Qui, riportiamo un metodo alternativo che consente la rimozione su larga scala delle larve con poco lavoro e meno stress meccanico sulle api.
Una volta ottenute le pupe e iniettate con l'inoculo del virus di partenza, devono essere incubate per fornire al virus il tempo di replicarsi. Successivamente, le particelle virali prodotte possono essere trasformate in una forma utilizzabile per infettare le api sperimentali. Esistono diversi metodi semplici per raggiungere questo obiettivo, tra cui l'utilizzo di un omogeneizzato grezzo35,36 o emolinfa generata da api infette viralmente come fonte di infezione37. Questi metodi sono efficaci ma incontrano una maggiore possibilità di introdurre variabili sconosciute dal substrato di fondo (ad esempio, altri fattori negli omogeneizzati delle api morte). Inoltre, è auspicabile concentrare le particelle se un esperimento richiede di somministrare una dose ampia e nota di un virus in un breve periodo di tempo. Pertanto, per un migliore controllo, è preferibile utilizzare metodi che consentano un certo livello di purificazione e concentrazione delle particelle virali. Generalmente, una serie di fasi di precipitazione e centrifugazione comporterà la rimozione di quasi tutto il possibile materiale virale non bersaglio33.
Dopo aver prodotto questo inoculo concentrato, è utile quantificare i titoli virali (qPCR) e caratterizzarlo con biosaggi in vivo per testarne la vitalità e la capacità di causare mortalità, nonché per confermare che si ottengono titoli virali aumentati dopo l'infezione. Ciò può essere ottenuto attraverso esperimenti di iniezione (sia in pupe che in adulti) o esperimenti di alimentazione (in larve o adulti). Mentre tutti questi approcci sono possibili, l'alimentazione di gruppi di api adulte in una gabbia è spesso la più veloce e semplice. Il metodo di analisi della gabbia è anche ampiamente utilizzato per testare vari altri trattamenti sulle api, tra cui la tossicità dei pesticidi38, lo sviluppo dell'ovaio39 e l'influenza nutrizionale sul comportamento40,41 e, quindi, può costituire una buona base per esperimenti che collegano l'infezione da virus con altri fattori42.
Qui descriviamo un metodo affidabile per produrre grandi quantità di particelle virali semi-pure e altamente arricchite senza utilizzare un costoso ultracentrifuga, incluso un metodo per rimuovere le pupe che riduce il lavoro e lo stress meccanico sulle api e un biotest altamente ripetibile e ad alto rendimento per testare l'infezione virale e gli effetti. Controllando strettamente la purezza dell'inoculo virale, i ricercatori sono in grado di ridurre la variazione della risposta virale delle api da miele rispetto ad altri metodi di inoculazione virale. Inoltre, il biotest può schermare gli effetti virali a livello di piccoli gruppi utilizzando unità sperimentali altamente ripetibili prima di scalare su impostazioni realistiche sul campo, che è molto più laborioso da gestire. In combinazione, questi due metodi forniscono gli strumenti necessari per gli studi che possono aiutare a migliorare la nostra comprensione generale delle interazioni fisiologiche ape-virus del miele.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Le api da miele sono di grande importanza ecologica e agricola in tutto il mondo, ma sono anche soggette a una varietà di pressioni che influenzano negativamente la salute delle api, compresa l'esposizione a patogeni virali. Tali virus possono causare un'ampia varietà di effetti devastanti e spesso possono essere difficili da studiare a causa di molteplici fattori che rendono difficile separare gli effetti dei trattamenti sperimentali dall'infezione di fondo preesistente. Qui presentiamo un metodo per produrre in serie grandi quantità di particelle virali insieme a un biotest ad alto rendimento per testare l'infezione virale e gli effetti. Rese necessarie dall'attuale mancanza di una linea continua di cellule di api da miele prive di virus, le particelle virali vengono amplificate in vivo utilizzando pupe di api da miele, che vengono estratte dall'alveare in grandi volumi utilizzando una metodologia minimamente stressante. Queste particelle virali possono quindi essere utilizzate nei biotest delle gabbie delle api per testare la vitalità degli inoculi, nonché in varie altre dinamiche di infezione virale, comprese le interazioni con nutrizione, pesticidi e altri agenti patogeni. Uno dei principali vantaggi dell'utilizzo di tali particelle è che riduce notevolmente le possibilità di introdurre variabili sconosciute nella sperimentazione successiva rispetto alle alternative attuali, come l'infezione tramite emolinfa delle api infette o omogeneizzato, anche se è necessario prestare attenzione quando si acquistano le api, per ridurre al minimo la contaminazione da virus di fondo. I saggi in gabbia non sostituiscono esperimenti su larga scala e realistici sul campo che testano gli effetti dell'infezione virale a livello di colonia, ma funzionano invece come metodo per stabilire risposte virali di base che, in combinazione con le particelle virali semi-pure, possono servire come strumenti importanti per esaminare varie dimensioni delle interazioni fisiologiche ape-virus del miele.

Seguire con successo i protocolli (Figure 1) per l'iniezione pupale e l'estrazione virale dovrebbe produrre grandi quantità di particelle virali. Tuttavia, il campionamento e l'iniezione di pupe provenienti da una varietà di colonie in più punti temporali massimizza le possibilità di acquisire virus bersaglio con bassa contaminazione. La dinamica con cui i virus si replicano e interagiscono tra loro all'interno di un'ape mellifera non è ben compresa; accoppiato con la probabilità di infezione prees...

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Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Qui descriviamo due protocolli: in primo luogo per propagare, estrarre, purificare e quantificare grandi quantità di particelle virali non avvolte dalle api da miele, incluso un metodo per rimuovere le pupe delle api da miele e in secondo luogo per testare gli effetti dell'infezione virale utilizzando un biotest in gabbia altamente ripetibile e ad alto rendimento.

Preparazione dell'inoculo arricchito da virus per l'infezione orale delle api mellifere (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

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