Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Vi vil takke Dr. Julia Fine for hennes ideer og diskusjon under protokollopprettingsprosessen, samt Dr. Cassondra Vernier for hennes nyttige kommentarer gjennom redigering. Disse materialene bidro til prosjekter som delvis ble støttet av Stiftelsen for mat- og landbruksforskning, under tilskudds-ID 549025.

1. Masse bie ekstraksjon alternativ 1: larval selvfjerning
<ol><li>Bur en honningbidronning på en tom, trukket Langstroth-ramme og returner henne til kolonien. La dronningen legge egg på denne rammen i 24 timer.<ol>
<li>Kontroller rammen etter 24 timer for å sikre at de fleste kamcellene inneholder nylagte egg. Avhengig av dronningen og kolonien, legges egg noen ganger ikke veldig bra i de første 24 timer. Hvis dette skjer, la det gå ytterligere 24 timer og juster tiden etter behov.</li>
	</ol></li>
	<li>Etter 24 ...

Her har vi skissert metoder som beskriver hvert trinn i virusforsterkning og inokulumbestandsforberedelsesprosess, inkludert larversamling og virusutbredelse, ekstraksjon og konsentrasjon, samt virusbehandling i form av burfôringseksperimenter. Disse metodene muliggjør produksjon av halvriske viruspartikler (figur 4), hvis effektivitet konsekvent kan kvantifiseres ved doseresponsdødelighetstesting for virus som er dødelige for voksne (figur 5). Etter bekreft...

Honningbier (Apis mellifera) spiller en kritisk rolle i det moderne globale landbrukslandskapet, men lider for tiden av en kombinasjon av biotiske og abiotiske stressfaktorer, inkludert eksponering for plantevernmidler, dårlig fôr, parasitter og patogener 1,2. En av de viktigste patogenene av bekymring er virus, hvorav mange er vektorisert av en annen av de store honningbistressorene, den parasittiske Varroa-myten (Varroa destructor). Disse virusene kan forårsake en rekke negative effekter hos honningbier, inkludert redusert brødoverlevelse, utviklingsfeil og lammelse som kan føre til total bikubekollaps både før og etter overvintringsperioder 3,4,5. Selv om det har vært lovende fremskritt i utviklingen av teknologier som brukes til å bekjempe virusinfeksjon 6,7,8,9, dynamikken som mange virus forplanter, sprer seg og samhandler innenfor en honningbi eller koloni er fortsatt dårlig forstått 5,10 . Å forstå den grunnleggende biologien til honningbi og virusinteraksjoner og deres forhold til andre miljøfaktorer er avgjørende for å utvikle effektive virushåndteringsteknikker.
Studier av honningbi-virusinteraksjoner gir imidlertid utfordringer med mange kjente og ukjente faktorer som kompliserer prosessen. Disse inkluderer interaksjoner med diett 11,12, pesticid eksponering13, og bi genetisk bakgrunn14,15. Selv når du fokuserer på virusinfeksjon alene, er komplikasjoner vanlige fordi honningbipopulasjoner, både administrerte og ville, alltid har en viss grad av bakgrunnsvirusinfeksjon, men ofte uten å manifestere akutte symptomer16,17, og effekten av virusmyntfeksjon er ikke godt forstått18. Dette har gjort studiet av honningbiviruseffekter vanskelig å disentangle.
Mange honningbivirusstudier har brukt indisier for å se etter interaksjoner med andre stressfaktorer, og observerer hvordan bakgrunnsinfeksjoner endres med andre behandlinger 12,19,20,21. Selv om denne tilnærmingen har vært vellykket med å identifisere viktige effekter, spesielt å oppdage hvordan plantevernmidler eller kostholdsbehandlinger påvirker virusnivåer og replikasjon, er inokulasjon med virusbehandling av kjent innhold og konsentrasjon avgjørende for eksperimentell testing av virusinfeksjonsdynamikk. Likevel kan det å skille eksperimentell behandling fra bakgrunnsinfeksjon også by på utfordringer. I feltstudier har forskere differensiert stammer av deformert vingevirus (DWV) for å gi bevis for virusoverføring fra honningbier til humlebier22, men å bruke denne tilnærmingen ville være vanskelig i honningbier alene. Virus smittsomme kloner er et kraftig verktøy, ikke bare for å spore infeksjon 23,24,25 men for omvendte genetikk studier av honning bie virus og for virus-vert interaksjon forskning 26,27,28. Men i de fleste tilfeller er smittsomme kloner fortsatt pålagt å oppfylle infeksjonssyklusen inne i celler for å produsere partikler. Slike partikler foretrekkes som inocula for eksperimentelle behandlinger fordi deres infektivitet er høyere enn den nakne virale RNA og inokulasjon med innkapslede genomer etterligner en naturlig infeksjon.
Produksjonen av rene, ukontaminerte honningbivirus inocula (villtype virusstammer eller de som er avledet fra smittsomme kloner) gir også utfordringer. Disse skyldes hovedsakelig vanskelighetene med å skaffe en pålitelig, kontinuerlig replikerende, virusfri honningbicellelinje for å produsere renstammevirus29,30. Mens noen cellelinjer er produsert, forblir disse systemene ufullkomne; Likevel er det håp om at en levedyktig cellelinje kan produseres29, noe som vil gi bedre kontroll over virusproduksjon og undersøkelse. Inntil en slik linje blir allment tilgjengelig, vil de fleste virusproduksjonsprotokoller fortsette å stole på bruk av in vivo virusproduksjon og rensing 18,31,32,33,34. Disse tilnærmingene innebærer å identifisere og rense viruspartikler av interesse (eller produsere en smittsom klone) og bruke dem til å infisere honningbier, vanligvis som pupper. Puppen injiseres med målviruset og ofres deretter, og ytterligere partikler ekstraheres og renses. Men fordi ingen bier er virusfrie til å begynne med, er det alltid en viss grad av forurensning fra spor av andre virus i noe slikt konsentrat, og derfor må det tas stor forsiktighet ved valg av bier med lav sannsynlighet for bakgrunnsinfeksjoner. Videre er metoder for å fjerne puppene fra kamcellene for bruk i disse protokollene33 svært arbeidskrevende og kan indusere stress i biene, noe som begrenser produksjonen med disse midlene18,32. Her rapporterer vi en alternativ metode som muliggjør storskala fjerning av larver med lite arbeidskraft og mindre mekanisk stress på biene.
Når pupper er oppnådd og injisert med startviruset inoculum, må de inkuberes for å gi viruset tid til å replikere. Deretter kan produserte viruspartikler behandles i en form som kan brukes til å infisere eksperimentelle bier. Det finnes flere enkle metoder for å oppnå dette, inkludert å bruke en rå homogenat35,36 eller hemolymfe generert fra viralt infiserte bier som en kilde til infeksjon37. Disse metodene er effektive, men har større sjanse for å introdusere ukjente variabler fra bakgrunnssubstratet (f.eks. andre faktorer i de døde bi-homogenatene). I tillegg er det ønskelig å konsentrere partiklene hvis et eksperiment krever å gi en stor, kjent dose av et virus på kort tid. Derfor, for bedre kontroll, er det å foretrekke å bruke metoder som tillater et visst nivå av rensing og konsentrasjon av viruspartiklene. Generelt vil en rekke nedbørs- og sentrifugeringstrinn føre til fjerning av nesten alt mulig ikke-målvirusmateriale33.
Etter å ha produsert dette konsentrerte inokulumet, er det gunstig å kvantifisere virale titere (qPCR) og karakterisere det med in vivo bioassays for å teste sin levedyktighet og evne til å forårsake dødelighet, samt å bekrefte at økte virustitre oppnås etter infeksjon. Dette kan oppnås gjennom injeksjonseksperimenter (enten i pupper eller voksne) eller fôringseksperimenter (i larver eller voksne). Mens alle disse tilnærmingene er mulige, er fôring til grupper av voksne bier i et bur ofte den raskeste og enkleste. Buranalysemetoden er også mye brukt til å teste ulike andre behandlinger på bier, inkludert pesticidtoksisitet38, eggstokkutvikling39 og ernæringsmessig påvirkning på atferd40,41 og kan derfor danne et godt grunnlag for eksperimenter som knytter virusinfeksjon med andre faktorer42.
Her beskriver vi en pålitelig metode for å produsere store mengder halvrent, svært beriket viruspartikler uten å bruke en dyr ultracentrifuge, inkludert en metode for å fjerne pupper som reduserer arbeidskraft og mekanisk stress på biene og en svært repeterbar bioassay med høy gjennomstrømning for testing av virusinfeksjon og effekter. Ved å kontrollere renheten til viral inocula tett, kan etterforskere redusere variasjonen i honningbi viral respons i forhold til andre virale inokulasjonsmetoder. Videre kan bioassay screene for viruseffekter på et lite gruppenivå ved hjelp av svært repeterbare eksperimentelle enheter før skalering til feltrealistiske innstillinger, noe som er langt mer arbeidskrevende å administrere. I kombinasjon gir disse to metodene de nødvendige verktøyene for studier som kan bidra til å forbedre vår generelle forståelse av honningbi-virus fysiologiske interaksjoner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Honningbier er av stor økologisk og landbruksmessig betydning rundt om i verden, men er også utsatt for en rekke trykk som påvirker biehelsen negativt, inkludert eksponering for virale patogener. Slike virus kan forårsake et bredt spekter av ødeleggende effekter og kan ofte være utfordrende å studere på grunn av flere faktorer som gjør det vanskelig å skille effekten av eksperimentelle behandlinger fra eksisterende bakgrunnsinfeksjon. Her presenterer vi en metode for å masseprodusere store mengder viruspartikler sammen med en bioassay med høy gjennomstrømning for å teste virusinfeksjon og effekter. Nødvendiggjort av dagens mangel på en kontinuerlig, virusfri honningbicellelinje, forsterkes virale partikler in vivo ved hjelp av honningbipupp, som ekstraheres fra bikube i store mengder ved hjelp av minimal stressende metodikk. Disse viruspartiklene kan deretter brukes i honningbiburbioassays for å teste inokulær levedyktighet, samt ulike andre virusinfeksjonsdynamikker, inkludert interaksjoner med ernæring, plantevernmidler og andre patogener. En stor fordel med å bruke slike partikler er at det i stor grad reduserer sjansene for å introdusere ukjente variabler i etterfølgende eksperimentering sammenlignet med nåværende alternativer, for eksempel infeksjon via infisert bi hemolymfe eller homogenat, selv om det fortsatt bør tas hensyn når du kjøper biene, for å minimere bakgrunnsvirusforurensning. Merdanalysene er ikke en erstatning for store, feltrealistiske eksperimenter som tester virusinfeksjonseffekter på koloninivå, men fungerer i stedet som en metode for å etablere grunnleggende virale responser som i kombinasjon med de semi-rene viruspartiklene kan tjene som viktige verktøy for å undersøke ulike dimensjoner av honningbi-virus fysiologiske interaksjoner.

Vellykket etter protokollene (figur 1) for pupal injeksjon og viral ekstraksjon bør produsere store mengder viruspartikler. Prøvetaking og injeksjon av pupper hentet fra en rekke kolonier på flere tidspunkter maksimerer imidlertid sjansene for å skaffe seg målvirus med lav forurensning. Dynamikken som virus replikerer og samhandler med hverandre i en honningbi, er ikke godt forstått; kombinert med sannsynligheten for preeksisterer infeksjon, er det ingen garanti for at det injiserte (ønskede) viru...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Her beskriver vi to protokoller: først å forplante, trekke ut, rense og kvantifisere store mengder honningbi ikke-innhyllede viruspartikler, inkludert en metode for å fjerne honningbi-pupper og for det andre for å teste effekten av virusinfeksjon ved hjelp av en svært repeterbar, høygjennomstrømningsburbioassay.

Fremstilling av virusberiket inokulum for oral infeksjon av honningbier (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Utarbeidelse av acinøse Cells for hensikten med Kalsium Imaging, celleskade Measurements, og adenovirus infeksjon

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Metoder for å sammenligne Næringsstoffer i beebread Made by Africanized og europeisk Honey Bees og virkningene på hemolymph Protein Titere

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Bone Betinget Medium: Utarbeidelse og Bioassay

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

Disseksjon og Observasjon av Honey Bee Dorsal Vessel for studier av hjertefunksjonen

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

Overvåking koloni-nivå effekter Sublethal plantevernmidler eksponering på honning bier

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Muntlig bakteriell infeksjon og Shedding i Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Vurdering av agrokjemisk risiko for parret honningbi queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

En forbedret Chemotaxis-analyse for rask identifisering av rhizobakterielle kjemoattractanter i roteksudater

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...