Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Vi vill tacka Dr. Julia Fine för hennes idéer och diskussion under processen för att skapa protokoll, liksom Dr. Cassondra Vernier för hennes hjälpsamma kommentarer under hela redigeringen. Detta material bidrog till projekt som delvis stöddes av Stiftelsen för livsmedels- och jordbruksforskning, under anslags-ID 549025.

1. Massbiutvinningsalternativ 1: larv självborttagning
<ol><li>Bura en honungsbidrottning på en tom, utdragen Langstroth-ram och återför henne till sin koloni. Låt drottningen lägga ägg på denna ram i 24 timmar.<ol>
<li>Kontrollera ramen efter 24 timmar för att säkerställa att de flesta kamcellerna innehåller nylagda ägg. Beroende på drottningen och kolonin läggs ägg ibland inte så bra under de första 24 timmarna. Om detta inträffar, tillåt ytterligare 24 timmar och justera tiden efter behov.</li>
	...

Här har vi beskrivit metoder som beskriver varje steg i virusförstärknings- och inokulumberedningsprocessen, inklusive larvuppsamling och virusförökning, extraktion och koncentration, samt viral behandling i form av burmatningsexperiment. Dessa metoder möjliggör produktion av halvrena viruspartiklar (figur 4), vars effektivitet konsekvent kan kvantifieras genom dos-responsdödlighetstest för virus som är dödliga för vuxna (figur 5). Efter bekräftelse...

Honungsbin (Apis mellifera) spelar en avgörande roll i det moderna globala jordbrukslandskapet men lider för närvarande av en kombination av biotiska och abiotiska stressfaktorer, inklusive exponering för bekämpningsmedel, dåligt foder, parasiter och patogener 1,2. En av de viktigaste patogenerna av oro är virus, av vilka många vektoriseras av en annan av de stora honungsbistressorerna, den parasitiska Varroa-mitten (Varroa destructor). Dessa virus kan orsaka en rad negativa effekter hos honungsbin inklusive minskad överlevnad av kullar, utvecklingsdefekter och förlamning som kan leda till total bikupakollaps både före och efter övervintringsperioder 3,4,5. Även om det har skett lovande framsteg i utvecklingen av teknik som används för att bekämpa virusinfektion 6,7,8,9, är dynamiken genom vilken många virus sprider sig, sprider sig och interagerar inom ett honungsbi eller koloni fortfarande dåligt förstådd 5,10 . Att förstå den grundläggande biologin för honungsbi och virusinteraktioner och deras relationer med andra miljöfaktorer är avgörande för att utveckla effektiva virushanteringstekniker.
Att studera interaktioner mellan honungsbin och virus innebär dock utmaningar med många kända och okända faktorer som komplicerar processen. Dessa inkluderar interaktioner med diet11,12, exponering för bekämpningsmedel13 och biets genetiska bakgrund14,15. Även när man fokuserar på enbart virusinfektion är komplikationer vanliga eftersom honungsbipopulationer, både hanterade och vilda, alltid har en viss grad av bakgrundsvirusinfektion, men ofta utan att uppvisa akuta symtom 16,17, och effekterna av virusinfektion är inte väl förstådda18. Detta har gjort studien av honungsbiviruseffekter svår att skilja åt.
Många studier av honungsbivirus har använt indicievirusinfektioner för att leta efter interaktioner med andra stressfaktorer och observera hur bakgrundsinfektioner förändras med andra behandlingar 12,19,20,21. Även om detta tillvägagångssätt har varit framgångsrikt för att identifiera viktiga effekter, särskilt att upptäcka hur bekämpningsmedel eller dietbehandlingar påverkar virusnivåer och replikation, är ympning med en virusbehandling av känt innehåll och koncentration avgörande för experimentell testning av virusinfektionsdynamik. Ändå kan det också innebära utmaningar att skilja experimentell behandling från bakgrundsinfektion. I fältstudier har forskare differentierat stammar av deformerat vingvirus (DWV) för att ge bevis för virusöverföring från honungsbin till humlor22, men att använda detta tillvägagångssätt skulle vara svårt inom honungsbin ensam. Virusinfektiösa kloner är ett kraftfullt verktyg, inte bara för att spåra infektion 23,24,25 utan för omvända genetiska studier av honungsbivirus och för virus-värdinteraktionsforskning 26,27,28. Men i de flesta fall krävs fortfarande smittsamma kloner för att uppfylla infektionscykeln inuti celler för att producera partiklar. Sådana partiklar föredras som inokula för experimentella behandlingar eftersom deras smittsamhet är högre än det nakna virala RNA och ympning med inkapslade genom efterliknar en naturlig infektion.
Produktionen av rena, oförorenade honungsbivirus inokula (virusstammar av vild typ eller sådana som härrör från smittsamma kloner) utgör också utmaningar. Dessa beror främst på svårigheterna att få en pålitlig, kontinuerligt replikerande, virusfri honungsbicelllinje för att producera rena stamvirus29,30. Medan vissa cellinjer har producerats förblir dessa system ofullkomliga; ändå finns det hopp om att en livskraftig cellinje kan produceras29, vilket skulle möjliggöra finare kontroll av virusproduktion och utredning. Tills en sådan linje blir allmänt tillgänglig kommer de flesta virusproduktionsprotokoll att fortsätta att förlita sig på användningen av in vivo-virusproduktion och rening 18,31,32,33,34. Dessa metoder innebär att identifiera och rena viruspartiklar av intresse (eller producera en smittsam klon) och använda dem för att infektera honungsbin, vanligtvis som puppor. Pupporna injiceras med målviruset och offras sedan, och ytterligare partiklar extraheras och renas. Men eftersom inga bin är virusfria till att börja med finns det alltid en viss grad av förorening från spår av andra virus i något sådant koncentrat, och därför måste stor försiktighet iakttas vid val av bin med låg sannolikhet för bakgrundsinfektioner. Vidare är metoder för att ta bort pupporna från kamcellerna för användning i dessa protokoll33 mycket arbetsintensiva och kan inducera stress hos bin, vilket begränsar produktionen med dessa medel18,32. Här redovisar vi en alternativ metod som möjliggör storskaligt avlägsnande av larver med lite arbete och mindre mekanisk belastning på bina.
När puppor har erhållits och injicerats med startvirusets inokulum måste de inkuberas för att ge viruset tid att replikera. Därefter kan producerade viruspartiklar bearbetas till en form som kan användas för att infektera experimentella bin. Det finns flera enkla metoder för att uppnå detta, inklusive att använda ett grovt homogenat35,36 eller hemolymf genererat från virusinfekterade bin som en källa till infektion37. Dessa metoder är effektiva men har större chans att införa okända variabler från bakgrundssubstratet (t.ex. andra faktorer i de döda bihomogenaten). Dessutom är det önskvärt att koncentrera partiklarna om ett experiment kräver att man ger en stor, känd dos av ett virus på kort tid. För bättre kontroll är det därför att föredra att använda metoder som möjliggör en viss nivå av rening och koncentration av viruspartiklarna. I allmänhet kommer en serie utfällnings- och centrifugeringssteg att resultera i avlägsnande av nästan allt möjligt icke-målvirusmaterial33.
Efter att ha producerat denna koncentrerade inokulum är det fördelaktigt att kvantifiera virustitrarna (qPCR) och karakterisera den med in vivo bioassays för att testa dess livskraft och förmåga att orsaka dödlighet, samt att bekräfta att ökade virustitrar erhålls efter infektion. Detta kan uppnås genom injektionsexperiment (antingen i puppor eller vuxna) eller utfodringsexperiment (i larver eller vuxna). Även om alla dessa tillvägagångssätt är möjliga är utfodring av grupper av vuxna bin i en bur ofta den snabbaste och enklaste. Buranalysmetoden används också i stor utsträckning för att testa olika andra behandlingar på bin inklusive bekämpningsmedelstoxicitet38, äggstocksutveckling39 och näringspåverkan på beteende40,41 och kan därför utgöra en bra grund för experiment som kopplar virusinfektion med andra faktorer42.
Här beskriver vi en pålitlig metod för att producera stora mängder halvrena, högt berikade viruspartiklar utan att använda en dyr ultracentrifug, inklusive en metod för att ta bort puppor som minskar arbetskraft och mekanisk stress på bina och en mycket repeterbar bioassay med hög kapacitet för att testa virusinfektion och effekter. Genom att noggrant kontrollera renheten hos den virala inokula kan utredarna minska variationen i honungsbiets virala svar i förhållande till andra virala ympningsmetoder. Dessutom kan bioassay screena för virala effekter på en liten gruppnivå med hjälp av mycket repeterbara experimentella enheter innan de skalas till fältrealistiska inställningar, vilket är mycket mer arbetsintensivt att hantera. I kombination ger dessa två metoder de nödvändiga verktygen för studier som kan bidra till att förbättra vår övergripande förståelse av fysiologiska interaktioner mellan honungsbin och virus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Honungsbin är av stor ekologisk och jordbruksbetydelse runt om i världen men utsätts också för en mängd olika tryck som negativt påverkar bihälsan, inklusive exponering för virala patogener. Sådana virus kan orsaka en mängd olika förödande effekter och kan ofta vara utmanande att studera på grund av flera faktorer som gör det svårt att skilja effekterna av experimentella behandlingar från redan existerande bakgrundsinfektion. Här presenterar vi en metod för att massproducera stora mängder viruspartiklar tillsammans med en bioanalys med hög genomströmning för att testa virusinfektion och effekter. Nödvändigt av den nuvarande bristen på en kontinuerlig, virusfri honungsbicelllinje, förstärks virala partiklar in vivo med hjälp av honungsbipuppor, som extraheras från bikupan i stora volymer med minimalt stressande metodik. Dessa viruspartiklar kan sedan användas i bioassays av honungsbiburar för att testa inokula livskraft, liksom olika andra virusinfektionsdynamiker, inklusive interaktioner med näring, bekämpningsmedel och andra patogener. En stor fördel med att använda sådana partiklar är att det kraftigt minskar risken för att införa okända variabler i efterföljande experiment jämfört med nuvarande alternativ, såsom infektion via infekterad bihemolymf eller homogenat, även om man fortfarande bör vara försiktig när man köper bina, för att minimera bakgrundsviruskontaminering. Buranalyserna är inte en ersättning för storskaliga, fältrealistiska experiment som testar virusinfektionseffekter på koloninivå, utan fungerar istället som en metod för att fastställa baslinjevirussvar som i kombination med de halvrena viruspartiklarna kan fungera som viktiga verktyg för att undersöka olika dimensioner av honungsbi-virus fysiologiska interaktioner.

Att framgångsrikt följa protokollen (figur 1) för pupal injektion och virusextraktion bör producera stora mängder viruspartiklar. Provtagning och injektion av puppor från en mängd olika kolonier vid flera tidpunkter maximerar dock chanserna att förvärva målvirus med låg kontaminering. Dynamiken genom vilken virus replikerar och interagerar med varandra inom ett honungsbi är inte väl förstådd; i kombination med sannolikheten för redan existerande infektion finns det ingen garanti för att ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Här beskriver vi två protokoll: för det första för att föröka, extrahera, rena och kvantifiera stora mängder honungsbi icke-omslutna viruspartiklar, inklusive en metod för att ta bort honungsbipuppor och för det andra för att testa effekterna av virusinfektion med hjälp av en mycket repeterbar, högkapacitetsburbioassay.

Beredning av virusberikad inokulum för oral infektion av honungsbin (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Protokoll för oral infektion av ordningen fjärilar larver med baculovirus

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

Utvinning av EPP Component från ytan EMG

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Beredning av celler i bukspottkörteln Acinar för att Kalcium Imaging, Cell Mått skada och Adenoviral Infektion

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Metoder för Jämföra Näringsämnen i Beebread Gjord av Africanized och europeiska honungsbin och Effekter på Hemolymph Protein Titrar

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Bone medium: Förberedelse och bioanalys

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

Dissekering och Observation Honey Bee Rygg fartyg för studier av hjärtfunktionen

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

Övervakning koloni-nivå effekter av subletala bekämpningsmedel exponering på honungsbin

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Muntliga bakterieinfektion och Shedding i Drosophila melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Bedömning av agrokemisk risk för parade honungsbidrottningar

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

En förbättrad Chemotaxis-analys för snabb identifiering av Rhizobacterial Chemoattractants i Root Exudates

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...