Name: preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)
Uploaded: 2020-08-26T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Protokol oluşturma sürecindeki fikirleri ve tartışmaları için Dr. Julia Fine'a ve düzenleme boyunca yararlı yorumları için Dr. Cassondra Vernier'e teşekkür ederiz. Bu materyaller, kısmen Gıda ve Tarım Araştırmaları Vakfı tarafından hibe kimliği 549025 kapsamında desteklenen projelere katkıda bulunmuştur.

1. Kütle arı ekstraksiyon seçeneği 1: larva kendi kendine çıkarma
<ol><li>Bir bal arısı kraliçesini boş, çizilmiş Langstroth çerçevesine kafesleyin ve onu kolonisine geri döndürün. Kraliçenin bu çerçeveye 24 saat boyunca yumurta bırakmasına izin verin.<ol>
<li>Tarak hücrelerinin çoğunun yeni yumurtlayan yumurtalar içerdiğinden emin olmak için çerçeveyi 24 saat sonra kontrol edin. Kraliçeye ve koloniye bağlı olarak, yumurtalar bazen ilk 24 saatte çok iyi döşenmez. Bu durumda, 24 saat ...

Burada, larva toplama ve virüs yayılımı, ekstraksiyonu ve konsantrasyonunun yanı sıra kafes besleme deneyleri şeklinde viral tedavi de dahil olmak üzere virüs amplifikasyonu ve inokülum stok hazırlama sürecinin her adımını detaylandıran yöntemleri özetledik. Bu yöntemler, etkinliği yetişkinler için ölümcül olan virüsler için doz-yanıt mortalite testi ile tutarlı bir şekilde ölçülebilen yarı saf virüs parçacıklarının üretilmesine izin verir (<strong cla...

Bal arıları (Apis mellifera) modern küresel tarım alanında kritik bir rol oynamaktadır, ancak şu anda pestisit maruziyeti, zayıf yem, parazitler ve patojenler dahil olmak üzere biyotik ve abiyotik stresörlerin bir kombinasyonundan muzdariptir 1,2. Endişe verici en önemli patojenlerden biri, birçoğu büyük bal arısı stresörlerinden biri olan parazitik Varroa akarı (Varroa yıkıcı) tarafından vektörleştirilen virüslerdir. Bu virüsler, bal arılarında azalmış yavru sağkalımı, gelişimsel kusurlar ve felç dahil olmak üzere bir dizi olumsuz etkiye neden olabilir ve bu da kışlama dönemlerinden önce ve sonra toplam kovan çöküşüne yol açabilir 3,4,5. Virüs enfeksiyonu ile mücadelede kullanılan teknolojilerin geliştirilmesinde umut verici ilerlemeler olmasına rağmen 6,7,8,9, birçok virüsün bir bal arısı veya kolonisi içinde yayıldığı, yayıldığı ve etkileşime girdiği dinamikler hala tam olarak anlaşılamamıştır 5,10 . Bal arısı ve virüs etkileşimlerinin temel biyolojisini ve diğer çevresel faktörlerle ilişkilerini anlamak, etkili virüs yönetimi teknikleri geliştirmek için kritik öneme sahiptir.
Bununla birlikte, bal arısı-virüs etkileşimlerini incelemek, süreci zorlaştıran çok sayıda bilinen ve bilinmeyen faktörle ilgili zorluklar ortaya koymaktadır. Bunlar diyet 11,12, pestisit maruziyeti 13 ve arı genetik arka planı14,15 ile etkileşimleri içerir. Sadece virüs enfeksiyonuna odaklanıldığında bile, komplikasyonlar yaygındır, çünkü hem yönetilen hem de vahşi bal arısı popülasyonları, genellikle akut semptomlar göstermeden 16,17 ve virüs koenfeksiyonunun etkileri iyi anlaşılmamıştır18. Bu, bal arısı virüsü etkilerinin incelenmesini çözülmeyi zorlaştırmıştır.
Birçok bal arısı virüsü çalışması, arka plan enfeksiyonlarının diğer tedavilerle nasıl değiştiğini gözlemleyerek, diğer stresörlerle etkileşimleri aramak için durumsal virüs enfeksiyonlarını kullanmıştır 12,19,20,21. Bu yaklaşım, özellikle pestisit veya diyet tedavilerinin virüs seviyelerini ve replikasyonunu nasıl etkilediğini keşfetmede önemli etkileri belirlemede başarılı olsa da, bilinen içerik ve konsantrasyonun bir virüs tedavisi ile aşılama, virüs enfeksiyon dinamiklerinin deneysel olarak test edilmesi için kritik öneme sahiptir. Yine de, deneysel tedaviyi arka plan enfeksiyonundan ayırmak da zorluklar doğurabilir. Saha çalışmalarında, araştırmacılar bal arılarından bombus arılarına virüs bulaşması için kanıt sağlamak için deforme olmuş kanat virüsü (DWV) suşlarını farklılaştırdılar22, ancak bu yaklaşımı kullanmak yalnızca bal arıları içinde zor olacaktır. Virüs enfeksiyöz klonları, sadece enfeksiyonu izlemek için değil 23,24,25 değil, bal arısı virüslerinin ters genetik çalışmaları ve virüs-konakçı etkileşim araştırması 26,27,28 için de güçlü bir araçtır. Bununla birlikte, çoğu durumda, parçacıklar üretmek için hücrelerin içindeki enfeksiyon döngüsünü yerine getirmek için bulaşıcı klonlara hala ihtiyaç vardır. Bu tür parçacıklar deneysel tedaviler için inoküla olarak tercih edilir, çünkü enfektiviteleri çıplak viral RNA'dan daha yüksektir ve kapsüllenmiş genomlarla aşılama doğal bir enfeksiyonu taklit eder.
Saf, kirlenmemiş bal arısı virüsü inocula'nın (vahşi tip virüs suşları veya bulaşıcı klonlardan türetilenler) üretimi de zorluklar doğurmaktadır. Bunlar temel olarak, saf suş virüsleri üretmek için güvenilir, sürekli çoğalan, virüssüz bir bal arısı hücre hattı elde etmedeki zorluklardan kaynaklanmaktadır29,30. Bazı hücre hatları üretilirken, bu sistemler kusurlu kalır; Yine de, virüs üretiminin ve araştırmasının daha iyi kontrol edilmesini sağlayacak uygulanabilir bir hücre hattının29 üretilebileceği umudu var. Böyle bir hat yaygın olarak kullanılabilir hale gelene kadar, çoğu virüs üretim protokolü in vivo virüs üretimi ve saflaştırma18,31,32,33,34 kullanımına güvenmeye devam edecektir. Bu yaklaşımlar, ilgilenilen virüs parçacıklarını tanımlamayı ve saflaştırmayı (veya bulaşıcı bir klon üretmeyi) ve bunları genellikle pupa olarak bal arılarını enfekte etmek için kullanmayı içerir. Pupa hedef virüs ile enjekte edilir ve daha sonra kurban edilir ve daha fazla parçacık ekstrakte edilir ve saflaştırılır. Bununla birlikte, başlangıçta hiçbir arı virüssüz olmadığından, bu tür bir konsantredeki diğer virüslerin izlerinden her zaman bir dereceye kadar kontaminasyon vardır ve bu nedenle, arka plan enfeksiyonları olasılığı düşük olan arıların seçiminde büyük özen gösterilmelidir. Ayrıca, bu protokollerde kullanılmak üzere pupaları tarak hücrelerinden çıkarma yöntemleri33 çok emek yoğundur ve arılarda strese neden olabilir, bu sayede üretimi sınırlayabilir 18,32. Burada, larvaların az emek ve arılar üzerinde daha az mekanik stres ile büyük ölçekli olarak uzaklaştırılmasını sağlayan alternatif bir yöntem sunuyoruz.
Pupa elde edildikten ve başlangıç virüsü inokulumu ile enjekte edildikten sonra, virüsün çoğalmasını sağlamak için inkübe edilmeleri gerekir. Daha sonra, üretilen virüs parçacıkları, deneysel arıları enfekte etmek için kullanılabilecek bir formda işlenebilir. Bunu başarmak için, bir enfeksiyon kaynağı olarak ham homojenat35,36 veya viral olarak enfekte arılardan üretilen hemolenf kullanmak da dahil olmak üzere birkaç basit yöntem vardır37. Bu yöntemler etkilidir, ancak arka plan substratından bilinmeyen değişkenleri (örneğin, ölü arı homojenatlarındaki diğer faktörler) sokma şansı daha yüksektir. Ek olarak, bir deney kısa sürede büyük, bilinen bir virüs dozu vermeyi gerektiriyorsa, parçacıkların konsantre edilmesi arzu edilir. Bu nedenle, daha iyi kontrol için, virüs parçacıklarının bir miktar saflaştırılmasına ve konsantrasyonuna izin veren yöntemlerin kullanılması tercih edilir. Genel olarak, bir dizi yağış ve santrifüjleme adımı, neredeyse tüm olası hedef dışı virüs materyalinin çıkarılmasıyla sonuçlanacaktır33.
Bu konsantre inokulumu ürettikten sonra, viral titreleri (qPCR) ölçmek ve canlılığını ve mortaliteye neden olma yeteneğini test etmek ve enfeksiyondan sonra artan virüs titrelerinin elde edildiğini doğrulamak için in vivo biyotahlillerle karakterize etmek faydalıdır. Bu, enjeksiyon deneyleri (pupa veya yetişkinlere) veya beslenme deneyleri (larvalara veya yetişkinlere) yoluyla elde edilebilir. Tüm bu yaklaşımlar mümkün olsa da, bir kafeste yetişkin arı gruplarına beslenme genellikle en hızlı ve en basit olanıdır. Kafes testi yöntemi, pestisit toksisitesi38, yumurtalık gelişimi39 ve davranış üzerindeki beslenme etkisi 40,41 dahil olmak üzere arılar üzerindeki çeşitli diğer tedavileri test etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu nedenle, virüs enfeksiyonunu diğer faktörlerle ilişkilendiren deneyler için iyi bir temel oluşturabilir42.
Burada, arılar üzerindeki emeği ve mekanik stresi azaltan pupaları çıkarmak için bir yöntem ve viral enfeksiyon ve etkileri test etmek için oldukça tekrarlanabilir, yüksek verimli bir biyotahlil de dahil olmak üzere, pahalı bir ultrasantrifüj kullanmadan büyük miktarlarda yarı saf, yüksek oranda zenginleştirilmiş virüs parçacıkları üretmek için güvenilir bir yöntem açıklıyoruz. Viral inokulusun saflığını sıkı bir şekilde kontrol ederek, araştırmacılar bal arısı viral yanıtındaki varyasyonu diğer viral aşılama yöntemlerine göre azaltabilirler. Ayrıca, biyotahlil, viral etkileri, yönetilmesi çok daha emek yoğun olan alan gerçekçi ayarlara ölçeklendirmeden önce, yüksek oranda tekrarlanabilir deneysel birimler kullanarak küçük gruplar düzeyinde tarayabilir. Kombinasyon halinde, bu iki yöntem, bal arısı-virüsü fizyolojik etkileşimleri hakkındaki genel anlayışımızı geliştirmeye yardımcı olabilecek çalışmalar için gerekli araçları sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% bleach solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24:1 chloroform:isoamyl alcohol</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cages for bioassay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dependent on experimental setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combitips Advanced 0.1 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30089405</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Containers for larval self-removal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Should measure roughly 19&#34; x 9-1/8&#34; (Langstroth deep frame dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blunt, soft forceps for larval separationl; blunt, hard forceps for pupal excision</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fume hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of maintaining 34 &#186;C and 50% relative humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td>Any absorbent wipe will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium-sized weight boats</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Serve as inoculum trays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcon-100kDa with Biomax membrane</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>MPE100025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>P5119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol 8000 (PEG)</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>1546605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated benchtop centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 15,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Capable of 21,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeater M4 Multipipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4982000322</td>
			<td>Optional (if no injector appartus is available)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse Away</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>7000TS1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAse-free water</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TES</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>T1375</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of virus-enriched inoculum for oral infection of honey bees (apis mellifera)

Bal arıları dünya çapında büyük ekolojik ve tarımsal öneme sahiptir, ancak viral patojenlere maruz kalma da dahil olmak üzere arı sağlığını olumsuz yönde etkileyen çeşitli baskılara maruz kalmaktadır. Bu tür virüsler çok çeşitli yıkıcı etkilere neden olabilir ve deneysel tedavilerin etkilerini önceden var olan arka plan enfeksiyonundan ayırmayı zorlaştıran çoklu faktörler nedeniyle incelenmesi zor olabilir. Burada, viral enfeksiyonu ve etkileri test etmek için yüksek verimli bir biyotahlil ile birlikte büyük miktarlarda virüs parçacıklarını seri olarak üretmek için bir yöntem sunuyoruz. Sürekli, virüssüz bir bal arısı hücre hattının mevcut eksikliğinin gerektirdiği viral parçacıklar, minimum stresli metodoloji kullanılarak kovandan büyük miktarlarda ekstrakte edilen bal arısı pupaları kullanılarak in vivo olarak çoğaltılır. Bu virüs parçacıkları daha sonra inoküla canlılığını test etmek için bal arısı kafesi biyotahlillerinde ve ayrıca beslenme, böcek ilaçları ve diğer patojenlerle etkileşimler de dahil olmak üzere çeşitli diğer virüs enfeksiyon dinamiklerinde kullanılabilir. Bu tür parçacıkları kullanmanın en büyük avantajı, enfekte arı hemolenfi veya homojenat yoluyla enfeksiyon gibi mevcut alternatiflerle karşılaştırıldığında, sonraki deneylerde bilinmeyen değişkenlerin ortaya çıkma şansını büyük ölçüde azaltmasıdır, ancak arıları tedarik ederken hala dikkatli olunmalıdır. Kafes tahlilleri, koloni düzeyinde virüs enfeksiyonu etkilerini test eden büyük ölçekli, saha gerçekçi deneylerin yerine geçmez, bunun yerine, yarı saf virüs parçacıkları ile kombinasyon halinde, bal arısı-virüsü fizyolojik etkileşimlerinin çeşitli boyutlarını incelemek için önemli araçlar olarak hizmet edebilecek temel viral yanıtları oluşturmak için bir yöntem olarak işlev görür.

Pupa enjeksiyonu ve viral ekstraksiyon için protokolleri (Şekil 1) başarıyla takip etmek, büyük miktarlarda virüs parçacıkları üretmelidir. Bununla birlikte, çeşitli kolonilerden elde edilen pupaların birden fazla zaman noktasında örneklenmesi ve enjekte edilmesi, düşük kontaminasyonla hedef virüs edinme şansını en üst düzeye çıkarır. Virüslerin bir bal arısı içinde çoğaldıkları ve birbirleriyle etkileşime girdikleri dinamikler iyi anlaşılmamıştır; Önceden var o...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera at JoVE.com

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees Apis mellifera

Burada iki protokolü tanımlıyoruz: birincisi, bal arısı pupalarını çıkarmak için bir yöntem de dahil olmak üzere, büyük miktarlarda bal arısı zarfsız virüs parçacıklarını yaymak, çıkarmak, saflaştırmak ve ölçmek ve ikincisi, yüksek oranda tekrarlanabilir, yüksek verimli bir kafes biyotahlili kullanarak viral enfeksiyonun etkilerini test etmek.

Bal Arılarının Oral Enfeksiyonu için Virüs Bakımından Zenginleştirilmiş İnokulum Hazırlanması (Apis mellifera)

Honey bees are of great ecological and agricultural importance around the world but are also subject to a variety of pressures that negatively affect bee ...

Research

JoVE Journal

Biology

Preparation of Virus-Enriched Inoculum for Oral Infection of Honey Bees (Apis mellifera)

Protocols for Oral Infection of Lepidopteran Larvae with Baculovirus

Baculovirus lepidopteran Larva Ağız Enfeksiyon Protokolleri

Baculoviruses are widely used both as protein expression vectors and as insect pest control agents. This video shows how lepidopteran larvae can be ...

Extraction of the EPP Component from the Surface EMG

Yüzey EMG EPP Bileşeni çıkarımı

A surface electromyogram (EMG), especially when recorded near the neuromuscular junction, is expected to contain the endplate potential (EPP) component ...

Preparation of Pancreatic Acinar Cells for the Purpose of Calcium Imaging, Cell Injury Measurements, and Adenoviral Infection

Kalsiyum Görüntüleme amacı, Hücre Yaralanma Ölçümler ve Adenoviral Enfeksiyon için Pankreas Asiner Hücreleri hazırlanması

The pancreatic acinar  cell is the main parenchymal cell of the exocrine pancreas and plays a primary  role in the secretion of pancreatic enzymes into ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Africanized ve Avrupa Bal Arısı Made by beebread besin tuzu karşılaştırılması yöntemleri ve Hemolenf Protein Titrelerin Etkileri

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Bone Conditioned Medium: Preparation and Bioassay

Kemik koşullu ortam: Hazırlama ve Biyo-

Autologous bone grafts are widely used in oral and maxillofacial surgery, orthopedics, and traumatology. Autologous bone grafts not only replace missing ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

Kalp Fonksiyon Çalışmaları Diseksiyon ve Bal Arısı Dorsal Vessel Gözlem

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Monitoring Colony-level Effects of Sublethal Pesticide Exposure on Honey Bees

Bal arıları üzerinde Sublethal pestisit pozlama koloni düzeyi etkilerinin izlenmesi

The effects of sublethal pesticide exposure to honey bee colonies may be significant but difficult to detect in the field using standard visual assessment ...

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster

Bakteriyel enfeksiyon ve atma Drosophila melanogaster içinde sözlü

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the best developed model systems of infection and innate immunity. While most work has focused on systemic ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

ÇiftLeşme Bal Arısı Kraliçeleri için Tarımsal Kimyasal Riskin Değerlendirilmesi

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

An Improved Chemotaxis Assay for the Rapid Identification of Rhizobacterial Chemoattractants in Root Exudates

Kök Eksüdalarında Rhizobacterial Kemoattractants'ın Hızlı Tanımlanması için Geliştirilmiş Bir Kemotaksi Tahlili

Chemotaxis identification is very important for the research and application of rhizosphere growth-promoting bacteria. We established a straightforward ...