Name: atomic force microscopy combined with infrared spectroscopy as a tool to probe single bacterium chemistry
Uploaded: 2020-09-15T15:00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende Bruker for deres støtte. Dette arbejde blev støttet af Monash University Advancing Women's Success Grant (K. Kochan). A.Y.P anerkender støtte fra en australsk National Health and Medical Research Council Practitioner Fellowship (APP1117940). Dette arbejde blev finansieret af en australsk Research Council Discovery Project DP180103484. Vi vil gerne takke Mr. Finlay Shanks for hans instrumentale støtte og Ms Xenia Kostoulias for hendes tekniske bistand med prøverne.

Alt arbejde, der udføres med patogene bakterier, bør udføres med passende sikkerhedsforanstaltninger på plads. Disse omfatter arbejde i et laboratorium med et tilstrækkeligt biosikkerhedsniveau og i en biosikkerhedskabine (PC2) samt omhyggelig dekontaminering af arbejdsområde med et passende desinfektionsmiddel, f.eks. 80% ethanolopløsning. Der skal hele tiden bæres passende værnemidler.
1. Fremstilling af opløsningsmidler og materialer
<ol><li>Opløsningsmidler: Brug ultrapurt vand som opløsningsmiddel. Brug renset vand, autoklavet forud for forsøget for at undgå potentiel krydskontaminering.</li>
	<li>Substrat: Brug et af disse substrater til AFM-IR, f.eks. ZnSe, CaF2, BaF2osv. Da AFM-IR i princippet er en ikke-destruktiv teknik, kan man anvende en række andre forskningsværktøjer til den samme prøve efter AFM-IR-analyse. For eksempel kan korrelation af resultaterne med Raman spektroskopi udføres, hvis Raman grade CaF2 eller BaF2 dias anvendes.</li>
	<li>Brug glasglas i stedet for plastrør, da plast kan forurene prøven.</li>
</ol>2. Prøveforberedelse til AFM-IR
<ol><li>Vækst/inkubation af prøve<ol>
<li>Dyrk bakterier i flydende medier eller på faste plader. Vælg typen af medium, vækstbetingelser (f.eks. temperatur, tilgængelighed af ilt) og væksttid i henhold til de specifikke krav til de undersøgte bakteriearter. For eksempel kan agarplader til S. aureus Heart Infusion (HI) anvendes med vækst i 16 timer i 37 °C under aerobe forhold. BEMÆRK: For at opnå de bedste resultater bør væksten/inkubationen give nok bakterier, der gør det muligt at samle en mikropille af prøver. Det specifikke antal kolonidannende enheder eller bakterieceller afhænger af bakteriens type og størrelse.</li>
	</ol></li>
	<li>Eksempeldeposition<ol>
<li>Ved hjælp af en steril sløjfe skal du omhyggeligt samle bakterier fra kolonierne på agarpladen og overføre dem til et glasrør. Saml bakterier kun fra toppen af kolonierne. Hvis der indsamles prøver fra en flydende kultur ved hjælp af en pipette, overføres ca. 1 mL af bakterieophænget til et glasrør. Volumenet kan ændres afhængigt af bakteriebelastningen. BEMÆRK: Det er vigtigt at forsøge ikke at indsamle (eller minimere så meget som muligt indsamling af) noget medium fra under kolonien. De efterfølgende trin i prøveforberedelsen har til formål at fjerne eventuelle rester af medier. Minimering af den potentielle medium rest fra begyndelsen muliggør spektral erhvervelse af data fra rensede bakterieceller. Trin 2.2.2 og 2.2.3 finder anvendelse på prøver fremstillet af agarplader. For prøver, der er fremstillet af flydende medier, flyttes til trin 2.2.4.</li>
		<li>Tilsæt 1 mL ultrapurt vand til røret. Vortex indtil den indsamlede bakteriel pellet ikke længere er synlige i bunden af røret (typisk 1-2 min).</li>
		<li>Vurder den grove turbiditet af løsningen ved hjælp af f.eks McFarland standarder ved visuel sammenligning30 mellem den forberedte løsning og McFarland standarder. Hvis uklarheden af bakteriel suspension synes at være meget lav, tilføje flere bakterier fra pladen ved hjælp af en steril løkke og vortex igen. Gentag indtil den grove turbiditet af løsningen kan sammenlignes med McFarland standarder 0,5 og 1. Dette vil generelt give en god mængde bakteriel pellet.</li>
		<li>Centrifuge bakterieopse suspensionen ved 3.000 x g i 5 min for at opnå en pellet. BEMÆRK: Centrifugeringsparametre kan ændres for at opnå bakteriel pellet. Forsigtighed bør tages, hvis du øger g-kraft, for ikke at fremkalde brud på bakterier (især i tilfælde af Gram-negative bakterier).</li>
		<li>Brug en pipette, fjern forsigtigt supernatanten ovenfra pelleten. Tilsæt 1 mL ultrapurt vand til røret og vortex for at suspendere pelleten igen. Efterfølgende centrifugere prøven, som det blev gjort i trin 2.2.4.</li>
		<li>Vaskeproceduren gentages (trin 2.2.2 og 2.2.4) mindst tre gange. I tilfælde af indsamling af den første prøve fra flydende medier gentages proceduren mindst fire gange (fjernelse af medier efterfulgt af tre vaske).</li>
		<li>Efter den endelige vask skal du fjerne supernatanten, tilsæt ultrapurt vand og vortex i mindst 2 minutter. Derefter deponeres 5 μL af prøven på substratet (f.eks. Raman-grade CaF2).</li>
		<li>Hvis den ønskede tykkelse af prøven er et flerlags bakterier, skal prøven lades lufttørre.</li>
		<li>Hvis den ønskede tykkelse er monolag eller individuelle bakterier, tilsættes der umiddelbart efter aflejring af prøven (trin 2.2.7) mellem 20-100 μL ultrapurt vand og blandes forsigtigt med en pipettespids. Lad det lufttørre. BEMÆRK: Den nøjagtige mængde vand kan variere mellem forsøg, da det afhænger af mange faktorer (f.eks. organismens størrelse, pelstæthed osv.) og derfor bedst bestemmes empirisk. Fremstilling af en række prøver med varierende mængder af ultrapurt vand tilsat gør det muligt at vælge en prøve med den ønskede tykkelse / densitet af bakterier. Tykkelsen / densiteten af bakterier kan let visualiseres via AFM i de efterfølgende faser. Eksempler på AFM-billeder fra monolags- og enkeltcelleeksempler vises i figur 1A-H.</li>
		<li>Monter substratet på en AFM metal prøve disk ved hjælp af dobbeltsidet tape.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Instrumentforberedelse
BEMÆRK: De instrumentelle procedurer, der er beskrevet her, er for det instrument, der er angivet i materialetabellen. Den detaljerede instrumentale procedure kan afvige lidt fra den, der er beskrevet her, hvis du bruger en nyere model af AFM-IR instrument.
<ol><li>Tænd og initialiser instrumentet ved at trykke på knappen Initialiser. Sørg for, at laserskodderen er i åben position til lasertesten.</li>
	<li>Hvis der er opstillet et udrensningssystem, skal instrumentet renses med N2 ved at tænde for strømmen af N2. Juster kvælstofrensningen for at opnå et stabilt fugtighedsniveau (f.eks. 20 %). Sørg for, at fugtigheden ikke svinger under målinger og mellem indsamling af baggrunds- og prøvedata. Det anbefales at stabilisere fugtighedsniveauet ca. 20 min.</li>
	<li>Læg prøven i prøvekammeret ved at trykke på knappen Indlæs. Prøveindlæsning udføres via softwareguiden. Når du bruger softwareguiden, skal du først fokusere på spidsen ved hjælp af pile til at flytte mikroskopstadiet i Z-retningen og klikke på Næste. For det andet skal du justere dataindsamlingspunktet ved hjælp af pile, der styrer bevægelsen i flyet, og juster AFM-laser- og AFM-detektoren ved hjælp af knapperne på toppen af AFM-hovedet. Derefter fokuseres på prøveoverfladen ved at flytte mikroskopstadiet i Z-retning. BEMÆRK: Detaljerede illustrationer af hvert trin i prøveindlæsningen findes i softwaremanualen31. Fokus på prøven skal udføres med omhu. Når du nærmer dig prøveoverfladen i Z-retningen, skal du bruge en langsom motorhastighed.</li>
	<li>Gå til prøven uden at engagere dig ved at klikke på knappen Tilgang.</li>
</ol>4. Dataindsamling
<ol><li>Baggrund<ol>
<li>Før dataindsamlingen skal du indsamle baggrunden. For baggrundskollektion skal du sikre dig, at laserskodderen er i åben position. Vælg spektralområdet og opløsningen (afhængigt af analysens formål) og antallet af scanninger og antallet af co-gennemsnit af baggrund. Disse anbefales generelt at være høje (f.eks. 1024 scanninger og 3 co-gennemsnit). BEMÆRK: Generelt anbefales spektral opløsning på 4 cm-1 eller 8 cm-1 og spektrale intervaller på 3.200 cm-1–2.800 cm-1 og 1.800 cm-1-900 cm-1.</li>
		<li>Når du har fundet baggrunden, skal du gemme baggrundsfilen. Filen gemmes ikke automatisk. Skift laserskodderpositionen til Luk.</li>
	</ol></li>
	<li>Eksempel – enkeltspektre<ol><li>Tryk på knappen Engager for at aktivere til prøven. Systemet begynder at nærme sig prøveoverfladen, indtil der registreres direkte kontakt. BEMÆRK: Sætpunkt, der anvendes i dette arbejde varierede mellem 0,15-2 V og feedback gevinster (I Gain og P Gain) vil typisk blive sat til 3 og 10. NIR2 kontaktsonder anvendes almindeligvis med nanoIR2-system (model: PR-EX-nIR2-10, resonansfrekvens (kHz): 13 +/−4 kHz, fjederkonstant (N/m): 0,07−0,4 Nm-1).</li>
		<li>Saml et AFM-billede for at visualisere overfladen. I første omgang scanne et større område (f.eks. 50 x 50 μm) med lavere rumlig opløsning (f.eks. 200 x 200 point) (Figur 1I). BEMÆRK: AFM-IR-data indsamles altid i kontakttilstand, men AFM-dataene kan indsamles i kontakt- eller tapningstilstand.</li>
		<li>Vælg et bestemt interesseområde fra AFM-højden/afbøjningsbilledet, og få det til at blive afbildet igen med en højere rumlig opløsning (Figur 1J-K). Sørg for, at dataindsamlingens hastighed er passende med langsom tipbevægelse (f.eks. scanningshastighed 0,2-0,4 Hz).</li>
		<li>Vælg målestedet (f.eks. en bakterie), og flyt spidsen til stedet.</li>
		<li>Juster den IR-laser. Til dette formål skal du bruge et bølgenummer, hvor prøven vil absorbere. For biologiske materialer kan dette f.eks. være amide I (1655 cm-1). Sørg for, at Båndpasfilteret er slukket, og klik på Start IR. Den højre graf i nanoIR-måleren (FFT for afbøjningen, der vises som amplitud vs. frekvens), skal vise mindst én klar top, og den venstre graf (afbøjning vs. tid) skal have en periodisk bølgeform. Hvis dette ikke er tilfældet, skal du fortsætte med at optimere de IR-pletter. BEMÆRK: Selvom Fast Fourier Transform (FFT) og afbøjning viser forventet profil, anbefales det at udføre optimering af IR-pletter i mindst flere bølgetal, hvor bands forventes.</li>
		<li>Optimer hotspotsene for den IR-dataindsamling ved hjælp af de valgte bølgenummerværdier. Det kan være nyttigt at bruge et konventionelt IR spektrum af bakterier (f.eks ATR spektrum af bakteriel pellet) til at identificere placeringen af bånd og bruge dem til at optimere hot spots. Vælg forskellige værdier for bølgenummer (f.eks. 8-10) fra forskellige spektrale områder. BEMÆRK: Hvis konventionelle IR spektrum af bakterier af interesse ikke kunne indsamles forud for AFM-IR dataindsamling, bakterielle spektre til rådighed i litteraturen kan bruges som en grov vejledning. Resultatet af optimeringen af en IR stedet er et billede, der præsenterer et kort over FFT størrelsesorden signal på hver x og y placering. Placeringen med det største signal vælges automatisk. Eksempler på sådanne billeder er givet i software manual31.</li>
		<li>Når du har optimeret IR-pletterne for udvalgte bølgeantalværdier, skal du definere parametrene for spektral dataindsamling: spektralområde, spektral opløsning, antal scanninger og anvendt strøm og input disse i de relevante vinduer i softwaren. Den spektrale beslutning bør svare til baggrundsresolutionen, og spektralregionen bør ligge inden for den spektrale region, for hvilken der er indsamlet baggrund. BEMÆRK: Et generisk indledende sæt parametre kan være: spektralområde: 3200 cm-1–2800 cm-1 og 1800 cm-1–900 cm-1, spektral opløsning: 4 cm-1 eller 8 cm-1, antal scanninger: 512-2048.</li>
		<li>Hvis det er nødvendigt, skal du justere lasereffekten afhængigt af signalet. Generelt bør værdier mellem 8%-10% af lasereffekten være tilstrækkelige til god signalkvalitet. Højere værdier kan bruges med forsigtighed, da de kan resultere i prøveskader. BEMÆRK: Procentens lasereffekt kan variere afhængigt af typen af IR-laser. De procentværdier, der er angivet her, er for OPO laser.</li>
		<li>Klik på Erhverve at indsamle AFM-IR spektrum.</li>
		<li>Re-indsamle AFM data fra samme område efter indsamling af AFM-IR spektrum. Dette anbefales stærkt, da det vil afsløre enhver potentiel drift og / eller destruktiv indflydelse på prøven.</li>
		<li>Hvis AFM-IR-spektret er tilfredsstillende, og der ikke observeres nogen ødelæggende indflydelse på prøven, skal du fortsætte dataindsamlingen. Hvis det er nødvendigt, skal du definere en række punkter for dataindsamling ved hjælp af array-indstillingen og indsamlet AFM-højde eller afbøjningsbillede. Denne mulighed gør det muligt at indsamle spektre fortløbende fra hvert punkt med de samme spektralparametre som defineret for et enkelt spektrum.</li>
		<li>Hvis AFM-billedet, der indsamles efter samling af AFM-IR-spektrum, afslører destruktiv indflydelse på prøven (typisk et brændt sted), skal du reducere strømmen; vælg et andet sted, og gentag trin 4.3.8–4.3.11.</li>
		<li>Hvis signalet i AFM-IR-spektrum ikke er tilfredsstillende, skal du kontrollere rigtigheden af optimering af IR-pletter (trin 4.3.6). Hvis den er korrekt, øges lasereffekten en smule og gentages trin 4.3.7-4.3.11. Dette kan gentages, indtil der er opnået et tilfredsstillende signal.</li>
	</ol></li>
	<li>Eksempel – billedbehandlingsmetode BEMÆRK: Det anbefales stærkt at optage et enkelt AFM-IR-spektrum af bakterien, før der indsamles et intensitetsfordelingsbillede for en valgt bølgeantalværdi.<ol>
<li>Registrer et AFM-billede af det valgte eksempelområde. For at gøre dette skal du først indsamle AFM-billede af et større område med lavere rumlig opløsning (f.eks. 50 x 50 μm, 200 x 200 point), derefter vælge et område af interesse og indsamle et AFM-billede med øget rumlig opløsning (som illustreret i figur 1I-K).</li>
		<li>Vælg bølgenummerværdierne for AFM-IR-billeddannelse.</li>
		<li>Sørg for, at laserens IR-plet er optimeret til de valgte bølgenummerværdier (trin 4.3.6). Hvis den IR stedet ikke er optimeret til nogle bølgetal (ingen klar maksimum), optimere det for dem.</li>
		<li>Definer parametrene for det afbildede område: bredden og højden, antallet af datapunkter i X- og Y-retning. BEMÆRK: Hvis det fortløbende udvalg af pletter fra de tidligere AFM-billeder anvendes (som vist i figur 1I-K), vil bredde- og højdefelterne automatisk blive udfyldt ved markering af området.</li>
		<li>Definer parametrene for spektral signalopsamling: bølgelængden, antallet af scanninger og lasereffekten. BEMÆRK: Antallet af scanninger skal holdes inden for en grund. 64 eller 32 scanninger vil typisk tillade en tilstrækkelig mængde signal.</li>
		<li>Definer parametrene for AFM-tipbevægelse ved at klikke på scanningshastigheden. Jo højere antallet af scanninger i det foregående trin og antallet af datapunkter i X-retning, jo langsommere skal spidsbevægelserne være. Manglende justering mellem disse parametre vil resultere i for hurtig bevægelse af spidsen, hvilket forhindrer den faktiske erhvervelse af definerede antal scanninger fra hvert punkt. BEMÆRK: For eksempel, for en passende samling af IR-signal med 64 co-tilføjelser og 200 point, indstille scanningshastigheden som 0,07 kHz.</li>
		<li>Kontroller, at feltet Aktiver IR-billedbehandling er markeret.</li>
		<li>Begynd at blive billeddannelse. AFM-IR af intensiteten af signalet ved det valgte bølgenummer vil blive indsamlet samtidig med AFM-data fra dette område. BEMÆRK: Når OPO laseren anvendes, er det muligt at derudover indsamle samtidig kontakt resonans peak frekvens billede. Dette kan bruges til at indhente oplysninger om prøvens relative stivhed forskellige steder.</li>
		<li>Brug vinduet Hent sekvens til at angive en fortløbende samling AFM-IR-data fra det samme område med de samme parametre, men for forskellige bølgenummerværdier. Det kan du gøre ved at åbne vinduet Hent sekvens, skrive hvert bølgenummer og definere den anvendte lasereffekt (for hvert bølgenummer).</li>
		<li>Eksporter de indsamlede data (AFM og AFM-IR, enkeltspektre og billeddannelse) i forskellige formater og analyser dem ved hjælp af metoder, der er tilstrækkelige til specifikke forskningsformål.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Sears, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+partnership:+celebrating+our+gut+flora.">A dynamic partnership: celebrating our gut flora.</a> Anaerobe. 11 (5), 247-251 (2005).</li><li>Rudd, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=regional,+and+national+sepsis+incidence+and+mortality,+1990-2017:+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study.">regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: analysis for the Global Burden of Disease Study.</a> The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).</li><li>Seymour, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+to+treatment+and+mortality+during+mandated+emergency+care+for+sepsis.">Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (23), 2235-2244 (2017).</li><li>Weiss, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+antimicrobial+therapy+increases+mortality+and+organ+dysfunction+duration+in+pediatric+sepsis.">Delayed antimicrobial therapy increases mortality and organ dysfunction duration in pediatric sepsis.</a> Critical Care Medicine. 42 (11), 2409-2417 (2014).</li><li>Peker, N., Couto, N., Sinha, B., Rossen, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+bloodstream+infections+from+positive+blood+cultures+and+directly+from+blood+samples:+recent+developments+in+molecular+approaches.">Diagnosis of bloodstream infections from positive blood cultures and directly from blood samples: recent developments in molecular approaches.</a> Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 24 (9), 944-955 (2018).</li><li>Aminov, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+antibiotics+and+antibiotic+resistance+in+nature.">The role of antibiotics and antibiotic resistance in nature.</a> Environmental Microbiology. 11 (12), 2970-2988 (2009).</li><li>Levy, S. B., Marshall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibacterial+resistance+worldwide:+causes,+challenges+and+responses.">Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses.</a> Nature Medicine. 10 (12), 122-129 (2004).</li><li>Roca, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+threat+of+antimicrobial+resistance:+science+for+intervention.">The global threat of antimicrobial resistance: science for intervention.</a> New Microbes and New Infections. 6, 22-29 (2015).</li><li>O'Neill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+review+on+antimicrobial+resistance.+Tackling+drug-resistant+infections+globally:+final+report+and+recommendations.">The review on antimicrobial resistance. Tackling drug-resistant infections globally: final report and recommendations.</a> Wellcome Trust. , (2016).</li><li>Perry, J. A., Westman, E. L., Wright, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibiotic+resistome:+what's+new.">The antibiotic resistome: what's new.</a> Current Opinion in Microbiology. 21, 45-50 (2014).</li><li>Piddock, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assess+drug-resistance+phenotypes,+not+just+genotypes.">Assess drug-resistance phenotypes, not just genotypes.</a> Nature Microbiology. 1 (8), 16120 (2016).</li><li>Naumann, D., Helm, D., Labischinski, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiological+characterizations+by+FT-IR+spectroscopy.">Microbiological characterizations by FT-IR spectroscopy.</a> Nature. 351 (6321), 81-82 (1991).</li><li>Zarnowiec, P., Lechowicz, L., Czerwonka, G., Kaca, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fourier+Transform+Infrared+Spectroscopy+(FTIR)+as+a+tool+for+the+identification+and+differentiation+of+pathogenic+bacteria.">Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) as a tool for the identification and differentiation of pathogenic bacteria.</a> Current Medicinal Chemistry. 22 (14), 1710-1718 (2015).</li><li>Quintelas, C., Ferreira, E. C., Lopes, J. A., Sousa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+overview+of+the+evolution+of+infrared+spectroscopy+applied+to+bacterial+typing.">An overview of the evolution of infrared spectroscopy applied to bacterial typing.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), 1700449 (2018).</li><li>San-Blas, E., Cubill&#225;n, N., Guerra, M., Portillo, E., Esteves, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+xenorhabdus+and+photorhabdus+bacteria+by+Fourier+transform+mid-infrared+spectroscopy+with+attenuated+total+reflection+(FT-IR/ATR).">Characterization of xenorhabdus and photorhabdus bacteria by Fourier transform mid-infrared spectroscopy with attenuated total reflection (FT-IR/ATR).</a> Spectrochimica Acta. Part A, Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 93, 58-62 (2012).</li><li>Sousa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+of+the+acinetobacter+calcoaceticus-acinetobacter+baumannii+complex+species+by+Fourier+transform+infrared+spectroscopy.">Discrimination of the acinetobacter calcoaceticus-acinetobacter baumannii complex species by Fourier transform infrared spectroscopy.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 33 (8), 1345-1353 (2014).</li><li>Rodriguez-Saona, L. E., Khambaty, F. M., Fry, F. S., Calvey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+identification+of+bacterial+strains+by+Fourier+transform+near-infrared+spectroscopy.">Rapid detection and identification of bacterial strains by Fourier transform near-infrared spectroscopy.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 49 (2), 574-579 (2001).</li><li>Dawson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+Fourier+transform+infrared+spectroscopy+for+the+rapid+typing+of+uropathogenic+Escherichia+coli.">Implementation of Fourier transform infrared spectroscopy for the rapid typing of uropathogenic Escherichia coli.</a> European Journal of Clinical Microbiology &amp; Infectious Diseases. 33 (6), 983-988 (2014).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Antimicrobial+Resistance-Related+Changes+in+Biochemical+Composition+of+Staphylococcus+aureus+by+Means+of+Atomic+Force+Microscopy-Infrared+Spectroscopy.">Detection of Antimicrobial Resistance-Related Changes in Biochemical Composition of Staphylococcus aureus by Means of Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15397-15403 (2019).</li><li>Dazzi, A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-IR:+Technology+and+Applications+in+Nanoscale+Infrared+Spectroscopy+and+Chemical+Imaging.">AFM-IR: Technology and Applications in Nanoscale Infrared Spectroscopy and Chemical Imaging.</a> Chemical Reviews. 117 (7), 5146-5173 (2017).</li><li>Dazzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM-IR:+combining+atomic+force+microscopy+and+infrared+spectroscopy+for+nanoscale+chemical+characterization.">AFM-IR: combining atomic force microscopy and infrared spectroscopy for nanoscale chemical characterization.</a> Applied Spectroscopy. 66 (12), 1365-1384 (2012).</li><li>Kochan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.+In+vivo+atomic+force+microscopy-infrared+spectroscopy+of+bacteria.">et al. In vivo atomic force microscopy-infrared spectroscopy of bacteria.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 15 (140), (2018).</li><li>Katzenmeyer, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mid-infrared+spectroscopy+beyond+the+diffraction+limit+via+direct+measurement+of+the+photothermal+effect.">Mid-infrared spectroscopy beyond the diffraction limit via direct measurement of the photothermal effect.</a> Nanoscale. 7 (42), 17637-17641 (2015).</li><li>. Bruker Life Science Applications Available from: <a target="_blank" href="https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers/nanoscale-ir-spectroscopy-applications/life-sciences.html">https://www.bruker.com/products/surface-and-dimensional-analysis/nanoscale-infrared-spectrometers/nanoscale-ir-spectroscopy-applications/life-sciences.html</a> (2020)</li><li>Mayet, C., Dazzi, A., Prazeres, R., Ortega, J. M., Jaillard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+identification+and+imaging+of+bacterial+polymer+nanogranules+by+infrared+nanospectroscopy.">In situ identification and imaging of bacterial polymer nanogranules by infrared nanospectroscopy.</a> Analyst. 135 (10), 2540-2545 (2010).</li><li>Baldassarre, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+amide+I+absorption+in+single+bacteria+and+mammalian+cells+with+resonant+infrared+nanospectroscopy.">Mapping the amide I absorption in single bacteria and mammalian cells with resonant infrared nanospectroscopy.</a> Nanotechnology. 27 (7), 075101 (2016).</li><li>Vitry, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+infrared+and+mode+synthesizing+atomic+force+microscopy:+Application+to+the+study+of+lipid+vesicles+inside+Streptomyces+bacteria.">Combining infrared and mode synthesizing atomic force microscopy: Application to the study of lipid vesicles inside Streptomyces bacteria.</a> Nano Research. 9 (6), 1674-1681 (2016).</li><li>Dazzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+mapping+of+the+distribution+of+viruses+into+infected+bacteria+with+a+photothermal+method.">Chemical mapping of the distribution of viruses into infected bacteria with a photothermal method.</a> Ultramicroscopy. 108 (7), 635-641 (2008).</li><li>Steenbergen, J. N., Alder, J., Thorne, G. M., Tally, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daptomycin:+a+lipopeptide+antibiotic+for+the+treatment+of+serious+Gram-positive+infections.">Daptomycin: a lipopeptide antibiotic for the treatment of serious Gram-positive infections.</a> The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 283-288 (2005).</li><li>Garcia, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MacFarlan+Standards.">MacFarlan Standards.</a> Clinical Microbiology Procedures Handbook, 3rd Edition. , (2010).</li><li>NanolR-2 System Manual. Anasys Instruments Available from: <a target="_blank" href="https://www.anasysinstruments.com/downloadpr/nanoIR2_s_System_Manual.pdf">https://www.anasysinstruments.com/downloadpr/nanoIR2_s_System_Manual.pdf</a> (2020)</li><li>Whelan, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+an+en+masse+and+reversible+B-+to+A-DNA+conformational+transition+in+prokaryotes+in+response+to+desiccation.">Detection of an en masse and reversible B- to A-DNA conformational transition in prokaryotes in response to desiccation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 11 (97), 20140454 (2014).</li><li>McGuinness, W. A., Malachowa, N., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vancomycin+Resistance+in+Staphylococcus+aureus.">Vancomycin Resistance in Staphylococcus aureus.</a> The Yale Journal of Biology and Medicine. 90 (2), 269-281 (2017).</li><li>Howden, B. P., Peleg, A. Y., Stinear, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+vancomycin+intermediate+Staphylococcus+aureus+(VISA)+and+heterogenous-VISA.">The evolution of vancomycin intermediate Staphylococcus aureus (VISA) and heterogenous-VISA.</a> Infection, Genetics and Evolution: Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases. 21, 575-582 (2014).</li><li>Perez-Guaita, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+Atomic+Force+Microscopy-Infrared+Nano-Imaging+of+Malaria+Infected+Red+Blood+Cells.">Multispectral Atomic Force Microscopy-Infrared Nano-Imaging of Malaria Infected Red Blood Cells.</a> Analytical Chemistry. 90 (5), 3140-3148 (2018).</li></ol>

Vi vil gerne anerkende Bruker for betaling af offentliggørelse gebyr. KK, BRW, AP og PH er opfindere på et internationalt patent (PCTIB2020/052339), som beskriver nogle af de grundlæggende aspekter af tilgangen.

Nytten af IR-spektroskopi til karakterisering af en bred vifte af biologiske prøver i forbindelse med deres kemiske sammensætning er veletableret. I løbet af det seneste årti har IR-spektroskopi vist sig som et lovende værktøj til bakteriestudier12,13,14,15,16,17. Det fortsætter med at tiltrække betydelig interesse inden for mikrobiologi, som en af de få teknikker, der muliggør en fænotypisk karakterisering gennem den kemiske sammensætning. I denne sammenhæng ligger den største ulempe ved konventionel FTIR-mikroskopi i begrænset rumlig opløsning, der forhindrer enkeltcellede og subcellulære undersøgelser af bakterier. Faktisk repræsenterer den lille størrelse af bakterier en hindring ikke kun for IR, men for langt de fleste teknikker. Således er de tilgængelige forskningsværktøjer til enkeltcellede og subcellulære undersøgelser af bakterier betydeligt begrænsede. Kombinationen af AFM med IR gør det muligt at overvinde den rumlige opløsningsbegrænsning af IR-spektroskopi, hvilket giver et nyt værktøj til bakterieforskning, der er i stand til nanoskala sondering af den kemiske sammensætning.
Teknikken er ikke begrænset til enkeltcelleundersøgelser og gør det muligt at sondere en række prøver, der spænder i tykkelse. Utvivlsomt, ren, og omhyggelig prøve forberedelse er afgørende for at opnå billeder af høj kvalitet. Protokollen heri indeholder en metode til at forberede flerlags-, monolags- og/eller enkeltcelleprøver af forskellige bakterier (Figur 1). Den forberedte prøve afhænger af flere faktorer, herunder den oprindelige bakteriebelastning, fortynding efter vask samt yderligere fortynding på substratet. Mængden af prøve, der er opnået efter fortynding af de vaskede pellets, og før deposition på substratet typisk gør det muligt at fremstille mange prøver. For at opnå den ønskede fordeling af prøven på substratet er det derfor ofte gavnligt at forberede en række prøver, der spænder i deres fortynding. For undersøgelser, der sigter mod indsamling af AFM-IR-spektre i stedet for subcellulær billeddannelse, kan det være gavnligt at ændre mængden af prøve (f.eks. fra monolag til flerlag) for at øge signalets intensitet.
Et andet kritisk aspekt ved prøveforberedelse er passende fjernelse af mellemstore rester. Afhængigt af de udvalgte prøvekultmetoder opsamles prøven enten fra flydende medium eller fra en agarplade. I begge tilfælde vil den mellemste rest sandsynligvis være til stede i prøven, om end i langt mindre grad ved indsamling fra agarplader. Da bakterievækstmedier indeholder en overflod af forskellige biologiske komponenter, er det afgørende at sikre passende fjernelse af medium. Vi anbefaler tre vasker med ultrapurt vand til agarpladeprøver og mindst fire vaske til prøver indsamlet fra medium. Antallet af vaske kan øges, hvis det er nødvendigt; Til sammenligning mellem forskellige prøver er det dog vigtigt at holde det konsistent mellem prøverne. Den demonstrerede protokol bruger vand, snarere end opløsningsmidler såsom fosfat bufferopløsning (PBS) eller saltvand. Både PBS og saltvand fører til dannelse af krystaller ved lufttørring, hvilket kan beskadige bakterierne. Derudover er begge en kilde til intense IR-bånd, hvor PBS især indeholder flere bånd i fingeraftryksområdet. Den manglende evne til brug af saltvand eller PBS, i øjeblikket udgør en vigtig begrænsning for teknikken. Typisk forårsager brugen af vand til vask ikke nogen destruktiv indflydelse på bakterierne; der bør dog udvises forsigtighed, og om muligt bør vandeksponeringen begrænses. Hvis prøveforberedelsesprotokollen skal sættes på pause på vaskestadiet, anbefales det at lade prøven stå i pelletiseret form efter fjernelse af vandet. Dette er af særlig betydning for Gram-negative bakterier, der indeholder en tyndere cellevæg, da de er mere tilbøjelige til brud.
For at sikre korrekte AFM-IR-data af høj kvalitet er flere aspekter i dataindsamlingsprotokollen af afgørende betydning. For det første er den korrekte indsamling af baggrund afgørende for dataindsamlingen. Det er især nødvendigt at opretholde stabile fugtighedsniveauer i hele baggrundsopsamlingen samt mellem baggrunds- og prøveindsamling. For at sikre dette anbefaler vi, at instrumentet renses med nitrogen og opretholder fugtighedsniveauet, der ikke er højere end 25%. Manglende udrensning kan pålægge en betydelig begrænsning, især på steder med høj luftfugtighed. For det andet bør betydningen af korrekt optimering af IR-spots fremhæves. For de bedste resultater, en priori viden om placeringen af band maxima kan være gavnligt. For eksempel kan et konventionelt IR-spektrum af bakteriel pellet bruges til at bestemme positioner af bånd, der forventes af en prøve. Hvis det ikke er muligt at erhverve, som en alternativ tilgang, kan brugeren udnytte IR spektre til rådighed i litteraturen eller begynde optimering ved hjælp af et bånd position, der er rimeligt at forvente i bakterien (f.eks amide I og amide II). For det tredje er det for dataindsamling vigtigt at fremhæve betydningen af omhyggelig strømvalg (hvilket gør det muligt at opnå et godt S /N-forhold), da det kan have en ødelæggende virkning. Den anbefalede effekt afhænger af prøvens tykkelse, med grov vejledning tilgængelig i instrumentmanualen31. Vi anbefaler empirisk at teste tilstanden af prøven efter måling ved indsamling af et AFM-billede, da det vil afsløre enhver destruktiv indflydelse. Desuden tjener samlingen af AFM-billeder fra samme område før og efter indsamling af AFM-IR-spektre som en god bekræftelse på, at der ikke er sket nogen drift, og at spektret faktisk stammer fra det valgte punkt i cellen. Muligheden for afdrift er særlig vigtig, når billeddannelse modalitet, gennem på hinanden følgende billeddannelse af IR intensitet på udvalgte bølgenummer værdier. Et eksempel herpå er illustreret i figur 5. Det afbildede område blev defineret i begyndelsen af eksperimentet og er beregnet til at være konsistent for alle bølgenummerværdier. Der er dog en klar afdrift mellem hvert AFM-højdebillede (og det tilsvarende IR-bølgeantalintensitet) billede med anskaffelsestid for hvert kort på ca. 40 min. På grund af dette anbefaler vi for brugere, der indsamler billeddata, altid at vælge et område, der er lidt større end prøven af interesse, for at sikre, at selv ved eksistensen af drift forbliver prøven af interesse inden for det afbildede område.
De potentielle begrænsninger af protokollen omfatter den manglende evne til at indsamle data i en hydreret tilstand i fysiologiske løsninger (f.eks saltvand eller PBS), der er beskrevet ovenfor. Desuden, især i områder med høj luftfugtighed, er der ofte behov for kvælstofrensning. Desuden gør protokollen det muligt at sondere organismer ned til 100 nm i størrelse, bortset fra muligheden for, at den anvendes til mindre strukturer. Selv om dette kan overvindes ved hjælp af en anden laser (f.eks quantum cascade laser gør det muligt at opnå den rumlige opløsning på 20 nm), er det også forbundet med begrænset spektral rækkevidde samt vanskeligheder med at opnå et godt signal til støj ratio. Endelig kan sondering af bløde overflader udgøre en udfordring, hvor spidsen ikke registrerer overfladen korrekt og fortsætter ud over kontaktpunktet, indtil brud. Selv om dette typisk ikke er et problem med bakterieprøver, Det kan forekomme ved målinger af blødere prøver. I sådanne tilfælde anbefales det at forsøge at engagere sig på substratets rene overflade i nærheden af prøven.
Den beskrevne protokol kan anvendes til mange typer af bakteriel forskning, herunder sammenlignende undersøgelser mellem forskellige prøver samt subcellulære undersøgelse. Dataene kan analyseres ved hjælp af kemiske tilgange til enkeltspektre og billeddannelsesmetoder35, afhængigt af formålet med forskningen. Desuden kan protokollen også ændres til anvendelse på andet biologisk materiale (såsom svampe, gær, celler osv.) gennem tilsætning af fiksering.

Bakterier er enkeltcellede prokaryote organismer, der forekommer i forskellige former og størrelser, typisk i området mellem flere hundrede nanometer til mikrometer. De findes i en række forskellige levesteder og er afgørende for eksistensen af liv. Inden for menneskekroppen er størstedelen af bakterierne, der er til stede i tarmen, harmløse, og mange er faktisk gavnlige1. Flere bakteriearter er imidlertid patogene og forårsager en række smitsomme sygdomme. Bakterielle infektioner kan føre til udvikling af sepsis og septisk chok: en livstruende tilstand, som følge af kroppens reaktion på en infektion2. Sepsis er en global stor sundhedstrussel med høj prævalens på verdensplan og alvorlig dødelighed. Alene i 2017 blev der registreret skønsmæssigt 50 millioner tilfælde af sepsis på verdensplan, hvoraf 11 millioner resulterede i dødsfald (ca. 20 %)2. Desuden viste et fald i patientens overlevelseschancer på grund af forsinket behandling sig at forekomme på en timelig måde3,4.
Bakterielle infektioner behandles med antibiotika. Sværhedsgraden af potentielle konsekvenser af bakterielle blodbanen infektioner (BSI'er), sammen med en klar betydning af hurtig indledning af antimikrobiel behandling, bede behovet for øjeblikkelig antibiotika administration. Men da de nuværende diagnostiske tilgange, der anvendes i klinisk praksis (f.eks blodkulterende) kræver relativt lang tid, antibiotika administration ofte sker forud for positiv BSI diagnose5. Denne faktor fører til omfattende overforbrug af antibiotika, hvilket sammen med overdreven brug af antibiotika i andre sektorer somf.eks. AMR er i øjeblikket en af de mest presserende globale sundhedsspørgsmål7,8 og, i 2050, forventes at blive den hyppigste dødsårsag9. Udviklingen af resistens, sammen med spredningen af AMR stammer sker i et alarmerende tempo7,8,9 og overstiger, langt, antallet af opdagelser af nye antibiotika10. Nye resistente fænotyper dukker hele tiden op over hele verden, mens forskning , der er dedikeret til at forstå de AMR-relaterede ændringer , er ofte langsom og begrænset af tilgængelige tilgange11. Derudover fokuserer de almindeligt anvendte metoder, såsom polymerasekædereaktion (PCR) og hele gensekvensering (WGS), kun på genotypic ændringer. Disse er ikke tilstrækkelige til at afsløre modstandsmekanismerne11, hvilket giver anledning til et presserende behov for et forskningsværktøj, der gør det muligt at forstå bakteriernes kemiske sammensætning.
Infrarød spektroskopi (IR) giver en molekylær karakterisering af prøven og er dermed en lovende kandidat til fænotypisk bakteriel sondering. Siden dens tidlige anvendelser12, en stor størrelsesorden af eksempler på dens anvendelse blev demonstreret i litteraturen13,14. Disse omfatter fænotypisk-baseret identifikation af bakterier påslægten 15,art16, og stamme17,18 niveau. Den rumlige opløsning af konventionelle IR er imidlertid begrænset til flere mikron på grund af bølgelængde diffraktionens rumlige opløsningsgrænse19. Da størrelsen af de fleste bakterier ligger under denne grænse (f.eks. Staphylococcus aureus ≈ 400 nm i diameter), gælder konventionel IR ikke for sondering på enkeltcellet eller intracellulært niveau.
Begrænsningen af den rumlige opløsning blev for nylig overvundet ved at kombinere IR-spektroskopi med Atomic Force Microscopy (AFM-IR). I dette tilfælde registreres den IR-absorption indirekte gennem termisk udvidelse af materialet19,20,21,22. Kort sagt resulterer absorptionen af IR-stråling i en lokal temperaturstigning. Dette kan måles enten direkte23 eller ved måling af svingning af AFM cantilever sonden, som følge af kraftimpuls skabt af IR absorption20,21. Den kombinerede AFM-IR-teknik gør det muligt at opnå rumlig opløsning, der nærmer sig 20 nm, hvilket giver samtidige oplysninger om lokale fysiske egenskaber ved en prøve (AFM) og dens kemiske sammensætning (AFM-IR). Indsamling af begge, enkeltspektre fra udvalgte steder og kortlægning af intensiteten af udvalgte bølgenummerværdier inden for et valgt område er mulige.
I betragtning af den opnåelige rumlige opløsning af AFM-IR er det indlysende, at teknikken åbner mulighed for kemisk / fænotypisk sondering af enkelt bakteriecelle og deres intracellulære sammensætning24. Hidtil har flere eksempler på anvendelse af AFM-IR for enkelte bakterier blev påvist i litteraturen19,20,21,22,25,26,27,28. Disse omfatter enkeltspektral analyse19,21,22 og kortlægning på subcellulært niveau19,22,25,26,27,28. For eksempel er evnen til at opdage intracellulære lipid vesikler27 og vira28 inden for enkelt bakterie blevet beskrevet. Disse resultater viser nytten af AFM-IR til nanoskalaundersøgelser af enkelte bakterier og klinisk relevante patogener19.
Derfor præsenterer vi en prøveforberedelses- og indsamlingsmetode til AFM-IR-data af flerlags-, monolags- og enkeltcellebakterprøver. Den protokol, der er beskrevet heri, blev anvendt til at studere forskellige arter af bakterier22 og ændringerne i deres kemiske sammensætning. Navnlig blev in vivo-udviklingen af vancomycinresistens og daptomycin-ikke-modtagelighed undersøgt i kliniske par S. aureus19. Både vancomycin intermitterende resistens og daptomycin ikke-modtagelighed i S. aureus (VISA og DpR) opstod relativt for nylig, efter den øgede brug og indførelse af disse antibiotika til klinikker, der udgør et betydeligt medicinsk problem. Desuden er mekanismen for daptomycins ikke-modtagelighed stadig flygtig, og hæmmer alternativ lægemiddeludvikling19,29. Den præsenterede protokol fokuserer på levering af pålidelige AFM-IR spektre af enkelte bakterier, som yderligere kan analyseres ved hjælp af en række kemiske tilgange, i henhold til de eksperimentelle mål. Det omfatter desuden kortlægningsmetoden, som gælder for intracellulære undersøgelser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM metal specimen disc</td>
			<td>PST ProSciTech Pty Ltd</td>
			<td>GA530-15</td>
			<td>Recommended 15 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anasys AFM-IR nanoIR2</td>
			<td>Anaysys Instruments</td>
			<td>0</td>
			<td>model: nanoIR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2</td>
			<td>Bruker / Anasys Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Model: Model: PR-EX-NIR2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus Pico 17 Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks Inc</td>
			<td>-</td>
			<td>Multivariate data analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Heathrow Scientific&#160;</td>
			<td>HEA4323</td>
			<td>Can be replaced with any other micro-centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoIR 2 instrument</td>
			<td>Bruker / Anasys Instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLS toolbox</td>
			<td>Mathworks Inc</td>
			<td>-</td>
			<td>GUI for Matlab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PP2001</td>
			<td>Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selected bacterial strain</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Substrate (e.g. Raman grade CaF2)</td>
			<td>Crystran</td>
			<td>CAFP13-2R</td>
			<td>Recommended size: 13 mm &#216; x 2.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 1000 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-1000-B</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 200 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-200-C</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip pipette 0.5-10 &#181;l</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>T-300-R</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy combined with infrared spectroscopy as a tool to probe single bacterium chemistry

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) er en ny kombinationsteknik, der muliggør samtidig karakterisering af fysiske egenskaber og kemisk sammensætning af prøve med nanoskalaopløsning. Ved at kombinere AFM med IR overvindes den rumlige opløsningsbegrænsning for konventionel IR, hvilket gør det muligt at opnå en opløsning på 20-100 nm. Dette åbner døren for en bred vifte af nye anvendelser af IR mod sondering prøver mindre end flere mikrometer, tidligere uopnåelige ved hjælp af konventionel IR mikroskopi. AFM-IR er yderst velegnet til bakterieforskning, der giver både spektral og rumlig information på enkeltcellet og intracellulært niveau. Den stigende globale sundhed bekymringer og ugunstige fremtidige forudsigelse vedrørende bakterielle infektioner, og især, hurtig udvikling af antimikrobiel resistens, har skabt et presserende behov for et forskningsværktøj i stand til fænotypiske sondering på enkelt celle og subcellulært niveau. AFM-IR giver mulighed for at imødekomme dette behov ved at muliggøre detaljeret karakterisering af kemisk sammensætning af en enkelt bakterie. Her leverer vi en komplet protokol til prøveforberedelse og dataindsamling af enkeltspektre og kortlægningsmodalitet til anvendelse af AFM-IR mod bakteriestudier.

Den beskrevne protokol gør det muligt at opnå en række typer af cellefordelinger af bakterier på substratet, afhængigt af den oprindelige koncentration af prøven og mængden af tilsat vand. Figur 1 illustrerer eksemplerne på AFM-billeder (højde og afbøjning), der er registreret fra monolag og encellede prøver, der er fremstillet ved hjælp af den beskrevne protokol fra Gram-positive (S. aureus) og Gram-negative (Escherichia coli) bakterier.
Protokollen beskrevet her kan udnyttes til AFM-IR billeddannelse af intra- og ekstra-cellulære strukturer af enkelt bakterier. Et eksempel på denne applikation er vist i figur 2, som viser resultaterne af overvågning af de rumligt lokaliserede kemiske ændringer, der forekommer under opdeling af en S. aureus celle. Selvom lufttørring almindeligvis betragtes som en fikseringsmetode til bakteriepræparat, viser bakterier i sagens natur meget høj modstand mod eksterne faktorer som temperatur og blev rapporteret at overleve dehydrering32. De resultater, der præsenteres her, blev opnået fra en lufttørret prøve. Dannelsen af en septum, der forekommer før celledeling blev observeret og overvåget via AFM imaging (Figur 2A-D) ved indsamling af 12 billeder af samme område fortløbende (samling af et enkelt billede ≈ 20 min). Figur 2A-D viser 4 udvalgte AFM-billeder med tid mellem samling af hvert billede på ca. 40 min. Den dannede struktur (septum) er 45 nm høj. Den dannede septum er tydeligt synlig i AFM højde og afbøjning billeder (Figur 2E-F). AfM-IR-spektret, der er optaget fra celle- og septumområdet (Figur 2G, oprindelsessteder markeret i figur 2F), blev normaliseret til amide I-båndet før sammenligning for at minimere indflydelsen af varierende prøvetykkelse mellem dataindsamlingssteder. AFM-IR spektrum af septum er kendetegnet ved højere relativ intensitet af bands på 1240 og 1090 cm-1 i forhold til AFM-IR spektrum indsamlet fra celleområde. Disse tilskrives kulhydrat- og fosfodiestergrupper af cellevægskomponenter (herunder f.eks. peptidoglycan og teichoicsyre)22.
Den beskrevne protokol kan også bruges til sammenligning af et enkelt spektre mellem en række forskellige prøver. Et eksempel på denne ansøgning sammen med resultaterne er vist i figur 3 og figur 4. Formålet med undersøgelsen er at bestemme de kemiske ændringer, der opstår som følge af in vivo udvikling af vancomycin intermitterende resistens i S. aureus (VISA). Til dette formål blev der indsamlet kliniske par prøver fra patienter, hvor forældrestammen var isoleret ved indlæggelse på hospitalet og før antibiotikabehandling (vancomycin susceptible S. aureus, VSSA) og datterstammen isoleret fra den samme patient efter optagelse af antibiotika og klinisk svigt. Prøverne blev yderligere dyrket på agarmedium og fremstillet i henhold til protokollen (figur 3A-B). AFM-IR-spektret blev indsamlet fra flere enkeltbakterier (og flere prøver) til VSSA og VISA og efterfølgende analyseret ved hjælp af flere kemiske tilgange (Figur 3C).
Der blev ikke observeret morfologiske forskelle mellem VSSA- og VISA-celler (figur 4A-C). AFM-IR-spektret (figur 4D,F) og deres andet derivater (figur 4E,G)viste imidlertid en klar forskel i den kemiske sammensætning mellem resistente og modtagelige stammer. Den relative intensitet af de bånd, der er forbundet med kulhydrat- og fosfodiestergrupper fra cellevægkomponenter (især båndet ved 1088 cm-1),steg klart i den resistente stamme sammenlignet med det modtagelige modstykke. Bemærk, at alle omkodede spektre (VISA: 81, VSSA: 88) viser en lille standardafvigelse. Dette viser god reproducerbarhed af data, der er registreret fra forskellige prøver fremstillet af samme stamme, da der ikke var mulighed for forskelsbehandling mellem spektre registreret fra forskellige prøver af samme stamme. De observerede forskelle indikerede en øget tykkelse af cellevæggen i resistente stammer sammenlignet med det modtagelige modstykke, som fortsat er i overensstemmelse med andre litteraturrapporter33,34.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig01.jpg"> Figur 1: Repræsentative AFM-billeder af forskellige bakterieprøver til AFM-IR-målinger. Afhængigt af fortyndingen på substratet tillader protokollen en at opnå flerlags og monolag af bakterier samt encellede prøver. Repræsentative AFM-billeder af: (A-D) monolag og (E-H) enkeltcellet prøve for (A,B,E,F) Gram-positive (S. aureus) og (C,D,G,H) Gram negative (E. coli) bakterier. (A,C,E,G) viser højdebilleder og viser (B,D,F,H) tilsvarende afbøjningsbilleder. Størrelsen på afbildede områder: (A-D,G,H) 20 x 20 μm, (E,F) 50 x 50 μm. (I-K) fortløbende valg af et område til AFM-IR-kortlægning. Dette opnås ved hjælp af AFM-billeddannelse med stigende rumlig opløsning i eksemplet med en enkelt S. aureus celle. Hvert billede indsamles ved prøveudtagning 200 x 200 point, med stigende rumlig opløsning på grund af reduktionen i størrelsen af det afbildede område. Billedområders størrelse: (I) 40 x 40 μm, (J) 20 x 20 μm og (K) 2,24 x 2,24 μm. Den sorte firkant i (I) markerer det område, der er afbildet i (J). Den sorte firkant i (J) markerer det område, der er afbildet i (K). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig02.jpg"> Figur 2: Overvågning af S. aureus celledeling via AFM-IR. (A-D) AFM billeder af S. aureus celle, der viser dannelsen af septum foregående celledeling. Størrelse på afbildet område: 2 x 2 μm. Billederne blev udvalgt fra en større serie (12 billeder optaget hvert 20. minut) og repræsenterer data registreret hvert 40. (E-F) AFM-højde og afbøjningsbillede optaget i slutningen af celle septumdannelse med markerede indsamlingssteder for AFM-IR-spektre. Størrelsen på det afbildede område 1,17 x 1,15 μm. Højden af den nydannede struktur er 45 nm. (G) AFM-IR-spektre registreret fra celleområde (sort) og septumområde (rødt) (markeret i (F)), i området 1400-900 cm-1. Begge spektre blev normaliseret til amide I band og demonstrere en stigning i den relative intensitet af celle væg komponenter fra septum. Dette tal er blevet ændret fra K. Kochan et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig03.jpg"> Figur 3: En oversigt over det eksperimentelle design til AFM-IR-undersøgelse af antimikrobiel resistens. (A) Prøveoprindelse og indledende præparat: modtagelig forældrestamme blev indsamlet fra en patient før antibiotikabehandling, og den datterresistente stamme blev hentet fra den samme patient efter antibiotikabehandling og klinisk svigt (in vivoresistensudvikling). Bakterier blev isoleret og dyrket på Heart Infusion (HI) agar i 16 timer i 37 °C. (B) Efterfølgende prøveforberedelse til AFM-IR, herunder indsamling af prøven efterfulgt af vask af bakteriepalle (3×) og prøveaflejring. (C) AFM-IR dataindsamling og -analyse: AFM højde og AFM-IR spektrum (1800-900 cm-1). Størrelsen af det afbildede AFM-område: 1,7 x 1,4 μm. AFM-IR-spektret blev indsamlet fra midten af cellen. Dataene blev efterfølgende analyseret ved hjælp af kemiske tilgange, herunder hierarkisk klyngeanalyse. Dette tal er blevet ændret fra K. Kochan et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig04.jpg"> Figur 4: AFM- og AFM-IR-resultater af undersøgelse af kemiske ændringer i vancomycin mellemliggende S. aureus (VISA) sammenlignet med vancomycin modtagelige S. aureus (VSSA) i kliniske par. AFM billeder af (A-B) VISA og (C) VSSA enkeltcellede prøver. Størrelsen af de afbildede områder: (A,C) 40 x 40 μm, (B) 2,56 x 2,45 μm. (D-E) Gennemsnitligt AFM-IR-spektrespektre og deres (F-G) andet derivater for: (D,F) VISA og (E,G) VSSA-celler i spektralområdet 1800-900 cm-1. Det fremlagte spektre er i gennemsnit 81 (VISA) og 88 (VSSA) individuelle spektre og præsenteres sammen med standardafvigelse (SD). Gennemsnitet blev udført efter normalisering af alle individuelle spektre sammen. De store bands er markeret i (F-G). Dette tal er blevet ændret fra K. Kochan et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61728/61728fig05.jpg"> Figur 5: Billede driver over fortløbende registrering af AFM-IR-kort ved udvalgte bølgenummerværdier for S. aureus-cellen.  (Øverste række): AFM-billeder blev optaget samtidig med de tilsvarende ( nedersterække) AFM-IR-kort baseret på intensiteten af IR-signalet ved udvalgte bølgenummerværdier. Bølgenummerværdierne (966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 cm-1) kommenteres over nederste række. Hvert sæt (AFM billede og AFM-IR kort) blev optaget direkte efter det foregående billede (ca. 40 min pr sæt). Størrelsen på det afbildede/tilknyttede område: 1,54 x 1,57 μm. En klar drift er synlig mellem billederne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61728/61728fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry at JoVE.com

Atomic Force Microscopy Combined with Infrared Spectroscopy as a Tool to Probe Single Bacterium Chemistry

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) giver en kraftfuld platform til bakteriestudier, der gør det muligt at opnå nanoskalaopløsning. Både kortlægning af subcellulære ændringer (f.eks. ved celledeling) samt sammenlignende undersøgelser af kemisk sammensætning (f.eks. som følge af lægemiddelresistens) kan udføres på et enkelt celleniveau i bakterier.

Atomprøvesprængningsmikroskopi kombineret med infrarød spektroskopi som et værktøj til sonde enkelt bakteriekemi

Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) is a novel combinatory technique, enabling simultaneous characterization of physical properties and ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Indsigt i samspillet mellem aminosyrer og peptider med uorganiske materialer Brug Single-Molecule force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

NMR Spectroscopy as a Robust Tool for the Rapid Evaluation of the Lipid Profile of Fish Oil Supplements

NMR spektroskopi som et robust værktøj til Rapid Evaluering af Lipid Profil af fiskeolie kosttilskud

The western diet is poor in n-3 fatty acids, therefore the consumption of fish oil supplements is recommended to increase the intake of these essential ...

Coulomb Explosion Imaging as a Tool to Distinguish Between Stereoisomers

Coulomb eksplosion billeddannelse som et redskab til at skelne mellem stereoisomere

This article shows how the COLTRIMS (Cold Target Recoil Ion Momentum Spectroscopy) or the "reaction microscope" technique can be used to distinguish ...

Electrochemical Impedance Spectroscopy as a Tool for Electrochemical Rate Constant Estimation

Elektrokemiske impedans spektroskopi som et redskab for elektrokemisk sats konstant estimering

Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) was used for advanced characterization of organic electroactive compounds along with cyclic voltammetry (CV). ...

Performing Spectroscopy on Plasmonic Nanoparticles with Transmission-Based Nomarski-Type Differential Interference Contrast Microscopy

Udfører spektroskopi på Plasmonic nanopartikler med transmission-baseret Nomarski-type differential interferens kontrast mikroskopi

Differential interference contrast (DIC) microscopy is a powerful imaging tool that is most commonly employed for imaging microscale objects using ...

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

In situ FTIR Spectroscopy as a Tool for Investigation of Gas/Solid Interaction: Water-Enhanced CO2 Adsorption in UiO-66 Metal-Organic Framework

In situ FTIR Spektroskopi som et værktøj til undersøgelse af gas / solid interaktion: Vand-Forbedret CO2 Adsorption i UiO-66 Metal-Organisk ramme

In situ infrared spectroscopy is an inexpensive, highly sensitive, and selective valuable tool to investigate the interaction of polycrystalline solids ...

Characterizing Lewis Pairs Using Titration Coupled with In Situ Infrared Spectroscopy

Tegnpå Lewis Pairs Ved hjælp af titrering kombineret med In Situ Infrarød spektroskopi

Lewis acid-activation of carbonyl-containing substrates is a fundamental basis for facilitating transformations in organic chemistry. Historically, ...

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining as a Tool to Uncover Novel Natural Products

Massespektrometri-guidet genom minedrift som et redskab til at afdække nye naturlige produkter

The chemical space covered by natural products is immense and widely unrecognized. Therefore, convenient methodologies to perform wide-ranging evaluation ...

Hyperspectral Imaging as a Tool to Study Optical Anisotropy in Lanthanide-Based Molecular Single Crystals

Hyperspektral billeddannelse som et værktøj til at studere optisk anisotropi i Lanthanide-baserede molekylære enkeltkrystaller

In this work, we describe a protocol for a novel application of hyperspectral imaging (HSI) in the analysis of luminescent lanthanide (Ln3+)-based ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Kovalent fastgørelse af enkelte molekyler til AFM-baseret kraftspektroskopi

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...