Name: ms2-affinity purification coupled with rna sequencing in gram-positive bacteria
Uploaded: 2021-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria at JoVE.com

Ces travaux ont été soutenus par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR, Subvention ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, et ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, à PR). Il a également été publié dans le cadre du labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 et de l’ANR-17-EURE- 0023 (à PR), en tant que financement de l’État géré par ANR dans le cadre des investissements pour le futur programme. DL a été soutenu par le programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention Marie Skłodowska-Curie n° 753137-SaRNAReg. Les travaux du laboratoire E. Massé ont été appuyés par des subventions de fonctionnement des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) et de la subvention d’équipe R01 GM092830-06A1 des NIH des National Institutes of Health.

1. Tampons et supports
<ol><li>Pour les expériences MAPS, préparez les mémoires tampons et les supports suivants : - Tampon A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 et 1 mM TNT) - Tampon E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltose, 0,1 % Triton, 1 mM MgCl2 et 1 mM TNT) - Tampon de charge d’ARN (0,025 % de cyanol de xylène et 0,025 % de bleu de bromophénol dans l’urée 8 M) - Brain Heart Infusion (BHI) milieu (12,5 g de cerveau de veau, 10 g de pept...

<ol>
	<li>Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadening+the+Definition+of+Bacterial+Small+RNAs:+Characteristics+and+Mechanisms+of+Action.">Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action.</a> Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).</li><li>H&#246;r, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Acting+Small+RNAs+and+Their+Effects+on+Gene+Expression+in+Escherichia+coli+and+Salmonella+enterica.">Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica.</a> EcoSal Plus. 9 (1), (2020).</li><li>Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+RNA.">Noncoding RNA.</a> Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).</li><li>Adams, P. P., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+small+base-pairing+RNAs+derived+from+diverse+genomic+loci.">Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).</li><li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+bacterial+small+RNA+target+prediction+programs.">An assessment of bacterial small RNA target prediction programs.</a> RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).</li><li>Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigation+through+the+twists+and+turns+of+RNA+sequencing+technologies:+Application+to+bacterial+regulatory+RNAs.">Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).</li><li>Wright, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CopraRNA+and+IntaRNA:+predicting+small+RNA+targets,+networks+and+interaction+domains.">CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains.</a> Nucleic Acids Research. 42, 119-123 (2014).</li><li>Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+new+RNA+classes+and+global+RNA-binding+proteins.">Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins.</a> Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).</li><li>Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+RNA-seq+approaches+for+the+study+of+bacterial+pathogens.">New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens.</a> Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).</li><li>Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-RNA+Interactomes+of+ProQ+and+Hfq+Reveal+Overlapping+and+Competing+Roles.">RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles.</a> Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).</li><li>Melamed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Mapping+of+Small+RNA-Target+Interactions+in+Bacteria.">Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria.</a> Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).</li><li>Iosub, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq+CLASH+uncovers+sRNA-target+interaction+networks+linked+to+nutrient+availability+adaptation.">Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Waters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+interactome+of+pathogenic+E.+revealed+through+crosslinking+of+RNase+E.">Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E.</a> The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).</li><li>Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+molecular+interactions+broaden+the+functions+of+the+RNA+chaperone+Hfq.">New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq.</a> Current Genetics. , (2019).</li><li>Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+aspects+of+RNA-based+regulation+by+Hfq+and+its+partner+sRNAs.">New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs.</a> Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).</li><li>Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+detectable+effect+of+RNA-binding+protein+Hfq+absence+in+Staphylococcus+aureus.">No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus.</a> BMC Microbiology. 7, 10 (2007).</li><li>Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+facultative+requirement+of+the+bacterial+RNA+chaperone,+Hfq.">On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq.</a> Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).</li><li>Olejniczak, M., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProQ/FinO-domain+proteins:+another+ubiquitous+family+of+RNA+matchmakers.">ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers.</a> Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).</li><li>Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Sixteen+-+MS2-Affinity+Purification+Coupled+With+RNA+Sequencing+Approach+in+the+Human+Pathogen+Staphylococcus+aureus.">Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus.</a> Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).</li><li>Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+RNA+partners+using+MAPS.">Identification of unknown RNA partners using MAPS.</a> Methods. 117, 28-34 (2017).</li><li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3'+external+transcribed+spacer+in+a+tRNA+transcript+acts+as+a+sponge+for+small+RNAs+to+prevent+transcriptional+noise.">A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise.</a> Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).</li><li>Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DsrA+regulatory+RNA+represses+both+hns+and+rbsD+mRNAs+through+distinct+mechanisms+in+Escherichia+coli.">DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).</li><li>Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+silencing+mechanisms+of+the+same+target+mRNA+by+two+regulatory+RNAs+in+Escherichia+coli.">Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).</li><li>Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GcvB+small+RNA+uses+two+distinct+seed+regions+to+regulate+an+extensive+targetome.">GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome.</a> Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).</li><li>Silva, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SraL+sRNA+interaction+regulates+the+terminator+by+preventing+premature+transcription+termination+of+rho+mRNA.">SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).</li><li>Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sRNA+interacting+with+a+transcript+of+interest+using+MS2-affinity+purification+coupled+with+RNA+sequencing+(MAPS)+technology.">Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology.</a> Genomics Data. 5, 136-138 (2015).</li><li>Tomasini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+targetome+of+Staphylococcus+aureus+non-coding+RNA+RsaA:+impact+on+cell+surface+properties+and+defense+mechanisms.">The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms.</a> Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).</li><li>Bronesky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+small+RNA+modulates+gene+expression+upon+glucose+limitation+in+Staphylococcus+aureus.">A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus.</a> The EMBO Journal. 38 (6), (2019).</li><li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RsaC+sRNA+modulates+the+oxidative+stress+response+of+Staphylococcus+aureus+during+manganese+starvation.">RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).</li><li>Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+New+Bacterial+Small+RNA+Targets+Using+MS2+Affinity+Purification+Coupled+to+RNA+Sequencing.">Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction.">Polymerase chain reaction.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).</li><li>Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+for+optimization+of+DNA+ligation+reactions.">Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions.</a> Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).</li><li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells.">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+Preparation+and+Electroporation+of+S.+aureus+and+S.+epidermidis.">Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis.</a> Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).</li><li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis.">Northern blot analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).</li><li>Koontz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis.">Agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2016+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).</li><li>Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+study+of+base-pairing+small+regulatory+RNAs+in+bacteria.">Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria.</a> Methods. 117, 67-76 (2017).</li><li>Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IntaRNA+2.0:+enhanced+and+customizable+prediction+of+RNA-RNA+interactions.">IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).</li><li>Georg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+cooperation:+Experimental+and+computational+approaches+in+the+functional+characterization+of+bacterial+sRNAs.">The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs.</a> Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).</li></ol>

Un protocole modifié pour les bactéries à Gram positif Le protocole initial de MAPS a été développé pour étudier l’interactome de l’ARNs dans l’organisme modèle E. coli20,30. Ici, nous décrivons un protocole modifié qui convient à la caractérisation des réseaux de régulation ARN-dépendants dans l’agent pathogène humain opportuniste S. aureus et est certainement transposable à d’autres bactéries Gr...

Des centaines, voire des milliers de petits ARN régulateurs (ARNs) ont été identifiés dans la plupart des génomes bactériens, mais les fonctions de la grande majorité d’entre eux restent inhabituelles. Dans l’ensemble, les ARNs sont de courtes molécules non codantes, jouant un rôle majeur dans la physiologie bactérienne et l’adaptation aux environnements fluctuants1,2,3. En effet, ces macromolécules sont au centre de nombreux réseaux de régulation complexes, impactant les voies métaboliques, les réponses au stress mais aussi la virulence et la résistance aux antibiotiques. Logiquement, leur synthèse est déclenchée par des stimuli environnementaux spécifiques (p. ex. privation de nutriments, stress oxydatif ou membranaire). La plupart des ARNm régulent plusieurs ARNm cibles au niveau post-transcriptionnel par le biais d’appariements de bases courts et non contigus. Ils empêchent généralement l’initiation de la traduction en concurrençant les ribosomes pour les régions d’initiation de la traduction4. La formation de duplex ARNm:ARNm entraîne aussi souvent la dégradation active de l’ARNm cible par le recrutement de RNases spécifiques.
La caractérisation d’un targetome d’ARNs (c’est-à-dire l’ensemble de ses ARN cibles) permet d’identifier les voies métaboliques dans lesquelles il intervient et le signal potentiel auquel il répond. Par conséquent, les fonctions d’un ARNr spécifique peuvent généralement être déduites de son targetome. A cet effet, plusieurs outils de prédiction in silico ont été développés tels que IntaRNA et CopraRNA5,6,7. Ils s’appuient notamment sur la complémentarité des séquences, l’énergie d’appariement et l’accessibilité du site d’interaction potentiel pour déterminer les partenaires d’ARNs putatifs. Cependant, les algorithmes de prédiction n’intègrent pas tous les facteurs influençant l’appariement de bases in vivo tels que l’implication d’ARN chaperons8 favorisant des interactions sous-optimales ou la co-expression des deux partenaires. En raison de leurs limites inhérentes, le taux de faux positifs des outils de prédiction reste élevé. La plupart des approches expérimentales à grande échelle sont basées sur la co-purification des couples ARNs:ARNm interagissant avec une protéine de liaison à l’ARN marqué (RBP)6,9. Par exemple, la méthode RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) a identifié des duplex d’ARN co-purifiés avec des chaperons d’ARN tels que Hfq et ProQ dans Escherichia coli10,11. Une technologie similaire appelée UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) a été appliquée aux ARNs associés à la RNase E- et Hfq dans E. coli12,13. Malgré les rôles bien décrits de Hfq et ProQ dans la régulation par l’ARN dans plusieurs bactéries8,14,15,la régulation basée sur l’ARNs semble être indépendante de l’ARN chez plusieurs organismes comme S. aureus16,17,18. Même si la purification des duplex d’ARN en association avec les RNases est possible comme démontré par Waters et ses collègues13,cela reste délicat car les RNases déclenchent leur dégradation rapide. Par conséquent, l’approche MS2-Affinity Purification couplée au Séquençage de l’ARN (MAPS)19,20 constitue une alternative solide chez de tels organismes.
Contrairement aux méthodes mentionnées ci-dessus, MAPS utilise un ARN spécifique comme appât pour capturer tous les ARN en interaction et ne repose donc pas sur l’implication d’un RBP. L’ensemble du processus est illustré à la figure 1. En bref, l’ARNs est marqué au 5' avec l’aptamère à ARN MS2 qui est spécifiquement reconnu par la protéine ms2. Cette protéine est fusionnée avec la protéine de liaison au maltose (MBP) pour être immobilisée sur une résine amylose. Par conséquent, l’ARNsM2 et ses partenaires ARN sont retenus sur la colonne de chromatographie d’affinité. Après élution avec du maltose, les ARN co-purifiés sont identifiés à l’aide d’un séquençage d’ARN à haut débit suivi d’une analyse bioinformatique(Figure 2). La technologie MAPS dessine finalement une carte en interaction de toutes les interactions potentielles se produisant in vivo.
La technologie MAPS a été mise en œuvre à l’origine dans la bactérie Gram négatif non pathogène E. coli21. Remarquablement, MAPS a aidé à identifier un fragment dérivé de l’ARNt interagissant spécifiquement avec les ARNs RyhB et RybB et empêchant tout bruit transcriptionnel de l’ARNr pour réguler les cibles de l’ARNm dans des conditions non induisantes. Par la suite, maps a été appliqué avec succès à d’autres ARNs de E. coli comme DsrA22,RprA23,CyaR23 et GcvB24 (Tableau 1). En plus de confirmer des cibles précédemment connues, MAPS a étendu le targetome de ces ARNs bien connus. Récemment, MAPS a été réalisée dans Salmonella Typhimurium et a révélé que l’ARNs SraL se lie à l’ARNm rho, codant pour un facteur de terminaison de transcription25. Grâce à cet appariement, SraL protège l’ARNm rho de l’arrêt prématuré de la transcription déclenché par Rho lui-même. Fait intéressant, cette technologie n’est pas limitée aux ARNs et peut être appliquée à n’importe quel type d’ARN cellulaires comme l’illustre l’utilisation d’un fragment dérivé de l’ARNt26 et d’une région non traduite 5'-de l’ARNm22 (Tableau 1).
La méthode MAPS a également été adaptée à la bactérie pathogène à Gram positif S. aureus19. Plus précisément, le protocole de lyse a été largement modifié pour briser efficacement les cellules en raison d’une paroi cellulaire plus épaisse que les bactéries à Gram négatif et pour maintenir l’intégrité de l’ARN. Ce protocole adapté a déjà démêlé l’interactome de RsaA27,RsaI28 et RsaC29. Cette approche a donné des aperçus sur le rôle crucial de ces ARNs dans les mécanismes de régulation des propriétés de surface cellulaire, de l’absorption de glucose, et des réponses oxydantes de stress.
Le protocole élaboré et mis en œuvre dans E. coli en 2015 a récemment été décrit en détail30. Ici, nous fournissons le protocole MAPS modifié, qui est particulièrement adapté à l’étude des réseaux de régulation de l’ARNs chez les bactéries Gram-positives (paroi cellulaire plus épaisse), qu’elles soient non pathogènes ou pathogènes (précautions de sécurité).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="834">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:187px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.690.001</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:187px;">Starstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2939BA</td>
			<td>RNA quantity and quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">250 mL culture flask</td>
			<td style="width:187px;">Dominique Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">2515074</td>
			<td>Bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352051</td>
			<td>Culture centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:187px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">20821.321</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Allegra X-12R Centrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bacterial pelleting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ampicilin (amp)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9518-5G</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Amylose resin</td>
			<td style="width:187px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">E8021S</td>
			<td>MS2-affinity purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Anti-dioxigenin AP Fab fragment</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11093274910</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autoradiography cassette</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-212-726</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">BamHI</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0051</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">BHI (Brain Heart Infusion) Broth</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">53286</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11096176001</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">CDP-Star</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11759051001</td>
			<td>Northern blot assays (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Centrifuge 5415 R</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform</td>
			<td style="width:187px;">Dominique Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">508320-CER</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">DIG-RNA labelling mix</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11277073910</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">DNase I</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td>DNase treatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythromycin (ery)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Fluka 45673</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPrep device</td>
			<td style="width:187px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">116004500</td>
			<td>Mechanical lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidium Thiocyanate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9277-250G</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Hybridization Hoven Hybrigene</td>
			<td style="width:187px;">Techne</td>
			<td style="width:119px;">FHB4DD</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Hybridization tubes</td>
			<td style="width:187px;">Techne</td>
			<td style="width:119px;">FHB16</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A/6960/08</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">LB (Lysogeny Broth)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Matrix B Bulk</td>
			<td style="width:187px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">6540-428</td>
			<td>Mechanical lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:187px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652100</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Milli-Q water device</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA/DNA quantity and quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:187px;">Dominique Dutsher</td>
			<td style="width:119px;">10600002</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Phembact Neutre</td>
			<td style="width:187px;">PHEM Technologies</td>
			<td style="width:119px;">BAC03-5-11205</td>
			<td>Cleaning and decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Phenol</td>
			<td style="width:187px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">38.2</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:187px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">pMBP-MS2</td>
			<td style="width:187px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">65104</td>
			<td>MS2-MBP production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Poly-Prep chromatography column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td style="width:119px;">7311550</td>
			<td>MS2-affinity purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PstI</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0615</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit 3 Fluorometer</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15387293</td>
			<td>RNA quantity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">RNAPro Solution</td>
			<td style="width:187px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">6055050</td>
			<td>Mechanical lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ScriptSeq Complete Kit</td>
			<td style="width:187px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">BB1224</td>
			<td>Preparation of cDNA librairies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Spectrophotometer Genesys 20</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11972278</td>
			<td>Bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">SpeedVac Savant vacuum device</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DNA120</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Stratalinker UV Crosslinker 1800</td>
			<td style="width:187px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;">400672</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EL0014</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">TBE (Tris-Borate-EDTA)</td>
			<td style="width:187px;">Euromedex</td>
			<td style="width:119px;">ET020-C</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ThermalCycler T100</td>
			<td style="width:187px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1861096</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416-100ML</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-ray film processor</td>
			<td style="width:187px;">hu.q</td>
			<td style="width:119px;">HQ-350XT</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">X-ray films Super RX-N</td>
			<td style="width:187px;">FujiFilm</td>
			<td style="width:119px;">4741019318</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ms2-affinity purification coupled with rna sequencing in gram-positive bacteria

Bien que les petits ARN régulateurs (ARNs) soient répandus dans le domaine bactérien de la vie, les fonctions de beaucoup d’entre eux restent mal caractérisées notamment en raison de la difficulté d’identifier leurs cibles d’ARNm. Ici, nous avons décrit un protocole modifié de la purification par affinité MS2 couplé à la technologie de séquençage de l’ARN (MAPS), visant à révéler tous les partenaires ARN d’un ARN spécifique in vivo. En gros, l’aptamère MS2 est fusionné à l’extrémité 5' de l’ARNr d’intérêt. Cette construction est ensuite exprimée in vivo, permettant à l’ARNsM2 d’interagir avec ses partenaires cellulaires. Après la récolte bactérienne, les cellules sont lysées mécaniquement. L’extrait brut est chargé dans une colonne de chromatographie à base d’amylose préalablement recouverte de la protéine MS2 fusionnée à la protéine de liaison au maltose. Cela permet la capture spécifique de l’ARNs MS2 et des ARN en interaction. Après l’élution, les ARN co-purifiés sont identifiés par séquençage de l’ARN à haut débit et analyse bioinformatique ultérieure. Le protocole suivant a été mis en œuvre dans l’agent pathogène humain à Gram positif Staphylococcus aureus et est, en principe, transposable à toute bactérie à Gram positif. En résumé, la technologie MAPS constitue une méthode efficace pour explorer en profondeur le réseau de régulation d’un ARNr particulier, offrant un instantané de l’ensemble de son targetome. Cependant, il est important de garder à l’esprit que les cibles putatives identifiées par MAPS doivent encore être validées par des approches expérimentales complémentaires.

Les résultats représentatifs proviennent de l’étude du targetome RsaC chez S. aureus29. RsaC est un ARNs 1,116 nt-long non conventionnel. Son extrémité 5' contient plusieurs régions répétées tandis que son extrémité 3' (544 nt) est structurellement indépendante et contient tous les sites d’interaction prédits avec ses cibles ARNm. L’expression de cet ARNs est induite lorsque le manganèse (Mn) est rare, ce qui est souvent produit dans le contexte de la réponse immunita...

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MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

La technologie MAPS a été développée pour examiner le targetome d’un ARN régulateur spécifique in vivo. L’ARN d’intérêt est marqué à l’aide d’un aptamère MS2 permettant la co-purification de ses partenaires ARN et leur identification par séquençage de l’ARN. Ce protocole modifié est particulièrement adapté aux bactéries à Gram positif.

Purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN dans les bactéries à Gram positif

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

Une purification par affinité MS2 couplée au séquençage de l’ARN ou à des MAPS a été développée pour identifier l’ensemble du targetome de tout ARN d’intérêt pour les bactéries. Cette technologie permet d’identifier tout type de partenaire ARN indépendamment du mécanisme de régulation. La caractérisation des réseaux de régulation dépendants de l’ARNs aidera à mieux comprendre la production de facteurs de virulence, la formation de biofilms et la survie des bactéries dans les cellules hôtes, et finalement lutter contre les infections staphylococciques.Ce protocole peut être appliqué à toute bactérie grampositaire pathogène ou non pathogène. Noemie Mercier, doctorante du laboratoire du Dr Pascal Romby, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, cultivez une colonie de souches portant soit l’ARNspCN51 P3 MS2, soit les plasmides pCN51 P3 MS2 dans trois millilitres de milieu BHI complétés par 10 microgrammes par érythromycine microlitre en double.Diluer chaque culture pendant la nuit dans 50 millilitres de milieu frais de BHI complété avec de l’érythromycine pour atteindre une DO 600 de 0,05. Cultivez les cultures à 37 degrés Celsius en secouant à 180 rpm pendant six heures. Transférer chaque culture dans un tube de centrifugation de 50 millilitres et centrifuger les tubes à 2 900 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius, puis jeter le surnageant, les congeler et les stocker à moins 80 degrés Celsius ou garder les pastilles sur la glace et effectuer directement la lyse mécanique des cellules.Pour effectuer la lyse mécanique des cellules, ressuscitez les pastilles dans cinq millilitres de tampon A et transférez les cellules remises en suspension dans des tubes à centrifuger de 15 millilitres avec 3,5 grammes de billes de silice. Insérez les tubes dans un instrument de lyse à cellules mécaniques et exécutez un cycle de 40 secondes à quatre mètres par seconde. Centrifuger les tubes à 2 900 fois G pendant 15 minutes, puis récupérer le surnageant et le garder sur glace.Assurez-vous que le surnageant est clair, en répétant la centrifugation si ce n’est pas le cas. Retirez la pointe de la colonne, puis mettez une colonne de chromatographie dans un rack de colonne et lavez la colonne avec de l’eau ultrapure. Ajouter 300 microlitres de résine amylose et laver la colonne avec 10 millilitres de tampon A.Diluer 1, 200 picamoles de protéine MBP-MS2 dans six millilitres de tampon A et le charger dans la colonne.Lavez la colonne avec 10 millilitres de tampon A.Ensuite, effectuez une purification d’affinité MS2. Chargez le lysat de la cellule dans la colonne et collectez la fraction d’écoulement dans un tube de collecte propre. Laver la colonne trois fois avec 10 millilitres de tampon A et recueillir la fraction de lavage, puis éluer la colonne avec un millilitre de tampon E et recueillir la fraction d’élution dans un microtube de deux millilitres.Conservez toutes les fractions collectées sur la glace jusqu’à l’extraction de l’ARN. Utilisez un millilitre de chaque fraction pour l’extraction de l’ARN. Ajouter un volume de phénol à l’ARN et mélanger vigoureusement, puis centrifuger le mélange à 16 000 fois G pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius.Transférer la phase supérieure sur un microtube propre de deux millilitres. Ajouter un volume d’alcool isoamylique chloroforme et répéter la centrifugation, puis transférer la phase supérieure dans un nouveau tube. Ajouter 2,5 volumes d’éthanol à 100 % froid et 0,1 volume d’acétate de sodium à trois molaires à un pH de 5,2 et précipiter pendant la nuit à moins 20 degrés Celsius.Le lendemain, centrifuger les tubes pendant 15 minutes à 16 000 fois G et quatre degrés Celsius. Retirez lentement l’éthanol avec une pipette, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Ajouter 500 microlitres d’éthanol froid à 80 % et centrifuger pendant cinq minutes.Jetez l’éthanol en le pipetant lentement, puis séchez la pastille à l’aide d’un concentrateur à vide pendant cinq minutes en mode de fonctionnement. Ressusciter le culot dans un volume approprié d’eau ultrapure. Ce protocole a été employé pour étudier le targetome de RsaC dans S.aureus.Plusieurs ARNm interagissant directement avec rsac ont été identifiés à l’aide de la technologie MAPS, révélant son rôle crucial dans le stress oxydatif et les réponses liées aux métaux. Pour confirmer les constructions d’ARNs MS2 et visualiser leur modèle d’expression, des cellules ont été récoltées après deux, quatre et six heures de croissance dans le milieu BHI. L’ARN a été extrait et l’analyse de northern blot a été exécutée utilisant la sonde dig RsaC-spécifique.Le niveau de RsaC endogène a augmenté de manière significative après six heures de croissance. Il est important de savoir que le niveau de MS2-RsaC 544 et ms2-RsaC 1, 116 était comparable à celui de RsaC endogène à six heures. La purification d’affinité a été exécutée et des ARN ont été extraits des fractions brutes d’extrait, d’écoulement et d’élution dans la souche de type sauvage exprimant la balise MS2 seule et la souche mutante RsaC exprimant la construction MS2-RsaC 544.Le 1,116 nucléotide long endogène RsaC a été enrichi dans la fraction d’élution, mais a interagi non spécifiquement avec la colonne d’affinité en raison de sa longueur et de sa structure secondaire complexe. Le MS2-RsaC 544 a été fortement enrichi en fraction d’élution démontrant qu’il a été retenu avec succès par la protéine de fusion MS2-MBP. Une analyse bioinformatique a révélé des cibles putatives d’ARNm selon le changement de pli entre l’ARNsM MS2 et le contrôle de l’ARNm2, indiquant que la sodA était la première cible putative.Une analyse par transfert Northern a effectué une sonde DIG spécifique à la sodA après purification par affinité MS2 montre que la sodA a été efficacement co-enrichie avec MS2-RsaC 544 par rapport au contrôle MS2. Lorsque vous tentez ce protocole, gardez à l’esprit que l’ajout de la balise MS2 peut affecter la confirmation, la stabilité ou la fonction de l’ARNs. Cela devrait être surveillé de près.MAPS fournit un instantané de l’appariement des cibles ARN-ARN. Une validation expérimentale plus poussée démêlera leur fonction. Cette technique représente un outil puissant pour construire des réseaux de régulation de l’ARNs dans toutes les bactéries.

Research

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Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

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