Name: ms2-affinity purification coupled with rna sequencing in gram-positive bacteria
Uploaded: 2021-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי "סוכנות לאומית דה לה Recherche" (ANR, גרנט ANR-16-CE11-0007-01, ריבוסטף, ו ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, ליחסי ציבור). הוא פורסם גם במסגרת labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 ושל ANR-17-EURE-0023 (ליחסי ציבור), כמימון מהמדינה המנוהלת על ידי ANR כחלק מההשקעות בתוכנית העתידית. DL נתמכה על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם המענק מארי סקלודובסקי-קירי מס' 753137-SaRNAReg. העבודה במעבדת E. Massé נתמכה על ידי מענקי הפעלה של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), המועצה לחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC), והמכונים הלאומיים לבריאות NIH צוות גרנט R01 GM092830-06A1.

1. מאגרים ומדיה
<ol><li>עבור ניסויי MAPS, הכן את המאגרים והמדיה הבאים: - מאגר A (150 mM KCl, 20 מ"מ Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 ו 1 mM DTT) - חוצץ E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 מ"מ מלטוז, 0.1% טריטון, 1 mM MgCl2 ו 1 mM DTT) - מאגר טעינה RNA (0.025% קסילן ציאנול ו 0.025% כחול ברומופנול ב 8 M אוריאה) - עירוי לב המוח (BHI) בינוני (12.5 גר...

<ol>
	<li>Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadening+the+Definition+of+Bacterial+Small+RNAs:+Characteristics+and+Mechanisms+of+Action.">Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action.</a> Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).</li><li>H&#246;r, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Acting+Small+RNAs+and+Their+Effects+on+Gene+Expression+in+Escherichia+coli+and+Salmonella+enterica.">Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica.</a> EcoSal Plus. 9 (1), (2020).</li><li>Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+RNA.">Noncoding RNA.</a> Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).</li><li>Adams, P. P., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+small+base-pairing+RNAs+derived+from+diverse+genomic+loci.">Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).</li><li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+bacterial+small+RNA+target+prediction+programs.">An assessment of bacterial small RNA target prediction programs.</a> RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).</li><li>Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigation+through+the+twists+and+turns+of+RNA+sequencing+technologies:+Application+to+bacterial+regulatory+RNAs.">Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).</li><li>Wright, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CopraRNA+and+IntaRNA:+predicting+small+RNA+targets,+networks+and+interaction+domains.">CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains.</a> Nucleic Acids Research. 42, 119-123 (2014).</li><li>Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+new+RNA+classes+and+global+RNA-binding+proteins.">Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins.</a> Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).</li><li>Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+RNA-seq+approaches+for+the+study+of+bacterial+pathogens.">New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens.</a> Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).</li><li>Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-RNA+Interactomes+of+ProQ+and+Hfq+Reveal+Overlapping+and+Competing+Roles.">RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles.</a> Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).</li><li>Melamed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Mapping+of+Small+RNA-Target+Interactions+in+Bacteria.">Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria.</a> Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).</li><li>Iosub, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq+CLASH+uncovers+sRNA-target+interaction+networks+linked+to+nutrient+availability+adaptation.">Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Waters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+interactome+of+pathogenic+E.+revealed+through+crosslinking+of+RNase+E.">Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E.</a> The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).</li><li>Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+molecular+interactions+broaden+the+functions+of+the+RNA+chaperone+Hfq.">New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq.</a> Current Genetics. , (2019).</li><li>Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+aspects+of+RNA-based+regulation+by+Hfq+and+its+partner+sRNAs.">New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs.</a> Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).</li><li>Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+detectable+effect+of+RNA-binding+protein+Hfq+absence+in+Staphylococcus+aureus.">No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus.</a> BMC Microbiology. 7, 10 (2007).</li><li>Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+facultative+requirement+of+the+bacterial+RNA+chaperone,+Hfq.">On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq.</a> Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).</li><li>Olejniczak, M., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProQ/FinO-domain+proteins:+another+ubiquitous+family+of+RNA+matchmakers.">ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers.</a> Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).</li><li>Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Sixteen+-+MS2-Affinity+Purification+Coupled+With+RNA+Sequencing+Approach+in+the+Human+Pathogen+Staphylococcus+aureus.">Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus.</a> Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).</li><li>Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+RNA+partners+using+MAPS.">Identification of unknown RNA partners using MAPS.</a> Methods. 117, 28-34 (2017).</li><li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3'+external+transcribed+spacer+in+a+tRNA+transcript+acts+as+a+sponge+for+small+RNAs+to+prevent+transcriptional+noise.">A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise.</a> Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).</li><li>Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DsrA+regulatory+RNA+represses+both+hns+and+rbsD+mRNAs+through+distinct+mechanisms+in+Escherichia+coli.">DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).</li><li>Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+silencing+mechanisms+of+the+same+target+mRNA+by+two+regulatory+RNAs+in+Escherichia+coli.">Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).</li><li>Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GcvB+small+RNA+uses+two+distinct+seed+regions+to+regulate+an+extensive+targetome.">GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome.</a> Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).</li><li>Silva, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SraL+sRNA+interaction+regulates+the+terminator+by+preventing+premature+transcription+termination+of+rho+mRNA.">SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).</li><li>Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sRNA+interacting+with+a+transcript+of+interest+using+MS2-affinity+purification+coupled+with+RNA+sequencing+(MAPS)+technology.">Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology.</a> Genomics Data. 5, 136-138 (2015).</li><li>Tomasini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+targetome+of+Staphylococcus+aureus+non-coding+RNA+RsaA:+impact+on+cell+surface+properties+and+defense+mechanisms.">The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms.</a> Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).</li><li>Bronesky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+small+RNA+modulates+gene+expression+upon+glucose+limitation+in+Staphylococcus+aureus.">A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus.</a> The EMBO Journal. 38 (6), (2019).</li><li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RsaC+sRNA+modulates+the+oxidative+stress+response+of+Staphylococcus+aureus+during+manganese+starvation.">RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).</li><li>Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+New+Bacterial+Small+RNA+Targets+Using+MS2+Affinity+Purification+Coupled+to+RNA+Sequencing.">Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction.">Polymerase chain reaction.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).</li><li>Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+for+optimization+of+DNA+ligation+reactions.">Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions.</a> Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).</li><li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells.">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing.">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li><li>Grosser, M. R., Richardson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+Preparation+and+Electroporation+of+S.+aureus+and+S.+epidermidis.">Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis.</a> Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).</li><li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis.">Northern blot analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).</li><li>Koontz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis.">Agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2016+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).</li><li>Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+study+of+base-pairing+small+regulatory+RNAs+in+bacteria.">Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria.</a> Methods. 117, 67-76 (2017).</li><li>Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IntaRNA+2.0:+enhanced+and+customizable+prediction+of+RNA-RNA+interactions.">IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).</li><li>Georg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+cooperation:+Experimental+and+computational+approaches+in+the+functional+characterization+of+bacterial+sRNAs.">The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs.</a> Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).</li></ol>

פרוטוקול שונה עבור חיידקים גראם חיובי הפרוטוקול הראשוני של MAPS פותח כדי לחקור אינטראקציה sRNA באורגניזם המודל E. coli20,30. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שונה אשר מתאים לאפיון של רשתות רגולטוריות תלויות sRNA בפתוגן האנושי האופורטוניסטי S. aureus והוא בהח...

מאות, אולי אפילו אלפי RNAs רגולטוריים קטנים (sRNAs) זוהו ברוב הגנומים החיידקיים, אך הפונקציות של רובם המכריע נותרו לא אופייניות. בסך הכל, sRNAs הם מולקולות קצרות ללא קידוד, ממלא תפקידים מרכזיים בפיזיולוגיה חיידקית והסתגלות לסביבותמשתנות 1,2,3. אכן, מקרומולקולות אלה נמצאות במרכזן של רשתות רגולטוריות מורכבות רבות, המשפיעות על מסלולים מטבוליים, תגובות מתח אך גם ארסיות ועמידות לאנטיביוטיקה. מבחינה הגיונית, הסינתזה שלהם מופעלת על ידי גירויים סביבתיים ספציפיים (למשל, רעב לחומרים מזינים, לחצים חמצוניים או קרום). רוב sRNAs לווסת mRNAs יעד מרובים ברמה שלאחר שעתוק באמצעות זיווג בסיס קצר ולא רציף. הם בדרך כלל למנוע ייזום תרגום על ידי מתחרה עם ריבוזומים עבור אזורי ייזום תרגום4. היווצרות של sRNA:mRNA דופלקסים גם לעתים קרובות תוצאות השפלה פעילה של mRNA היעד על ידי גיוס של RNases ספציפיים.
האפיון של יעד sRNA (כלומר, כל הסט של RNAs היעד שלה) מאפשר זיהוי של המסלולים המטבוליים שבהם הוא מתערב ואת האות הפוטנציאלי שהוא עונה. כתוצאה מכך, הפונקציות של sRNA מסוים בדרך כלל ניתן להסיק מן היעד שלה. לשםכךפותחו מספר כלי חיזוי סיליקו כגון IntaRNA ו- CopraRNA 5,6,7. הם מסתמכים בעיקר על השלמות רצף, זיווג אנרגיה ונגישות של אתר האינטראקציה הפוטנציאלי כדי לקבוע שותפי sRNA putative. עם זאת, אלגוריתמי חיזוי אינם משלבים את כל הגורמים המשפיעים על זיווג בסיס ב vivo כגון מעורבות של מלווים RNA8 לטובת אינטראקציות תת אופטימליות או ביטוי משותף של שני בני הזוג. בשל המגבלות הטבועות בהם, שיעור החיזוי החיובי הכוזב נותר גבוה. רוב הגישות הניסיוניות בקנה מידה גדול מבוססות על טיהור משותף של זוגות sRNA:mRNA אינטראקציה עם חלבון מחייב RNA מתויג (RBP)6,9. לדוגמה, שיטת האינטראקציה RNA על ידי קשירה ורצף (RIL-seq) זיהתה דופלקסים RNA מטוהרים במשותף עם מלווים RNA כגון Hfq ו ProQ ב Escherichia coli10,11. טכנולוגיה דומה הנקראת UV-Crosslinking, קשירה ורצף של כלאיים (CLASH) הוחלה על RNase E- ו- Hfq הקשורים sRNAs ב E. coli12,13. למרות התפקידים המתוארים היטב של Hfq ו- ProQ ברגולציה בתיווך sRNA בחיידקים מרובים8,14,15, רגולציה מבוססת sRNA נראה RNA מלווה עצמאי בכמה אורגניזמים כמו S. aureus16,17,18. גם אם הטיהור של דופלקסים RNA בשיתוף עם RNases הוא ריאלי כפי שהוכח על ידי ווטרס ועמיתים לעבודה13, זה נשאר מסובך כמו RNases לעורר השפלה מהירה שלהם. לפיכך, טיהור MS2-Affinity בשילוב עם רצף RNA (MAPS)גישה 19,20 מהווה חלופה מוצקה אורגניזמים כאלה.
שלא כמו שיטות שהוזכרו לעיל, MAPS משתמש sRNA ספציפי כפיתיון כדי ללכוד את כל RNAs אינטראקציה ולכן אינו מסתמך על מעורבות של RBP. התהליך כולו מתואר באיור 1. בקצרה, sRNA מתויג ב 5 'עם MS2 RNA aptamer כי הוא מוכר במיוחד על ידי חלבון מעיל MS2. חלבון זה הוא התמזגו עם חלבון מחייב מלטוז (MBP) להיות משותק על שף amylose. לכן, MS2-sRNA ושותפיו RNA נשמרים בעמודה כרומטוגרפיה זיקה. לאחר התרוממות רוח עם RNAs מלטוזיים ומטוהרים מזוהים באמצעות רצף RNA בעל תפוקה גבוהה ואחריו ניתוח ביואינפורמטי (איור 2). טכנולוגיית MAPS מציירת בסופו של דבר מפה של כל האינטראקציות הפוטנציאליות המתרחשות ב- vivo.
טכנולוגיית MAPS יושמה במקור בחיידק הגרם-שלילי הלא פתוגניים E. coli21. למרבה הפלא, MAPS סייעה לזהות שבר שמקורו ב-tRNA במיוחד באינטראקציה עם RyhB ו-RybB sRNAs ולמנוע רעש שעתוק של sRNA כדי לווסת מטרות mRNA בתנאים שאינם מעוררים. לאחר מכן, MAPS הוחל בהצלחה על SRNAs אחרים E. coli כמו DsrA22, RprA23, CyaR23 ו GcvB24 (טבלה 1). בנוסף לאישור מטרות ידועות בעבר, MAPS הרחיבה את היעד של sRNAs ידועים אלה. לאחרונה, MAPS בוצע סלמונלה Typhimurium וחשף כי SRNA SraL נקשר rho mRNA, קידוד עבור גורם סיום שעתוק25. באמצעות זיווג זה, SraL מגן rho mRNA מפני סיום שעתוק מוקדם מופעלות על ידי רו עצמה. מעניין, טכנולוגיה זו אינה מוגבלת sRNAs והוא יכול להיות מיושם על כל סוג של RNAs הסלולר כפי שהודגם על ידי שימוש שבר נגזר tRNA26 ואזור 5'-untranslated של mRNA22 (טבלה 1).
שיטת MAPS הותאמה גם לחיידק גרם חיובי פתוגניים S. aureus19. באופן ספציפי, פרוטוקול התמוגה שונה באופן נרחב כדי לשבור תאים ביעילות עקב דופן תאים עבה יותר מאשר חיידקים גראם שליליים ולשמור על שלמות RNA. פרוטוקול מותאם זה כבר חשף את האינטראקציה של RsaA27, RsaI28 ו RsaC29. גישה זו נתנה תובנות על התפקיד המכריע של sRNAs אלה במנגנונים רגולטוריים של תכונות פני התא, ספיגת גלוקוז, ותגובות מתח חמצוני.
הפרוטוקול שפותח ומיושם ב- E. coli בשנת 2015 תואר לאחרונה בפירוט רב30. כאן, אנו מספקים את פרוטוקול MAPS שונה, אשר מתאים במיוחד לחקר רשתות רגולטוריות sRNA בחיידקים גראם חיובי (קיר תא עבה) אם לא פתוגניים או פתוגניים (אמצעי זהירות).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="834">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:187px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.690.001</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:187px;">Starstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2939BA</td>
			<td>RNA quantity and quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">250 mL culture flask</td>
			<td style="width:187px;">Dominique Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">2515074</td>
			<td>Bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352051</td>
			<td>Culture centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:187px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">20821.321</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Allegra X-12R Centrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bacterial pelleting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ampicilin (amp)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9518-5G</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Amylose resin</td>
			<td style="width:187px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">E8021S</td>
			<td>MS2-affinity purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Anti-dioxigenin AP Fab fragment</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11093274910</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autoradiography cassette</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-212-726</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">BamHI</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0051</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">BHI (Brain Heart Infusion) Broth</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">53286</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11096176001</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">CDP-Star</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11759051001</td>
			<td>Northern blot assays (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Centrifuge 5415 R</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform</td>
			<td style="width:187px;">Dominique Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">508320-CER</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">DIG-RNA labelling mix</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11277073910</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">DNase I</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td>DNase treatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythromycin (ery)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Fluka 45673</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPrep device</td>
			<td style="width:187px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">116004500</td>
			<td>Mechanical lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidium Thiocyanate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9277-250G</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Hybridization Hoven Hybrigene</td>
			<td style="width:187px;">Techne</td>
			<td style="width:119px;">FHB4DD</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Hybridization tubes</td>
			<td style="width:187px;">Techne</td>
			<td style="width:119px;">FHB16</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A/6960/08</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">LB (Lysogeny Broth)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Matrix B Bulk</td>
			<td style="width:187px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">6540-428</td>
			<td>Mechanical lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:187px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652100</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Milli-Q water device</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA/DNA quantity and quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:187px;">Dominique Dutsher</td>
			<td style="width:119px;">10600002</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Phembact Neutre</td>
			<td style="width:187px;">PHEM Technologies</td>
			<td style="width:119px;">BAC03-5-11205</td>
			<td>Cleaning and decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Phenol</td>
			<td style="width:187px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">38.2</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:187px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">pMBP-MS2</td>
			<td style="width:187px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">65104</td>
			<td>MS2-MBP production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Poly-Prep chromatography column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td style="width:119px;">7311550</td>
			<td>MS2-affinity purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PstI</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0615</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit 3 Fluorometer</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15387293</td>
			<td>RNA quantity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">RNAPro Solution</td>
			<td style="width:187px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">6055050</td>
			<td>Mechanical lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ScriptSeq Complete Kit</td>
			<td style="width:187px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">BB1224</td>
			<td>Preparation of cDNA librairies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Spectrophotometer Genesys 20</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11972278</td>
			<td>Bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">SpeedVac Savant vacuum device</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DNA120</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Stratalinker UV Crosslinker 1800</td>
			<td style="width:187px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;">400672</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EL0014</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">TBE (Tris-Borate-EDTA)</td>
			<td style="width:187px;">Euromedex</td>
			<td style="width:119px;">ET020-C</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ThermalCycler T100</td>
			<td style="width:187px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1861096</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416-100ML</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-ray film processor</td>
			<td style="width:187px;">hu.q</td>
			<td style="width:119px;">HQ-350XT</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">X-ray films Super RX-N</td>
			<td style="width:187px;">FujiFilm</td>
			<td style="width:119px;">4741019318</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ms2-affinity purification coupled with rna sequencing in gram-positive bacteria

למרות RNAs רגולטוריים קטנים (sRNAs) נפוצים בקרב התחום החיידקי של החיים, הפונקציות של רבים מהם נשארים מאופיינים בצורה גרועה בעיקר בשל הקושי לזהות את מטרות mRNA שלהם. כאן, תיארנו פרוטוקול שונה של טיהור MS2-Affinity יחד עם טכנולוגיית רצף RNA (MAPS), במטרה לחשוף את כל שותפי ה- RNA של sRNA ספציפי ב- vivo. באופן כללי, APTAMER MS2 הוא התמזגו הקיצוניות 5 'של sRNA של עניין. מבנה זה בא לידי ביטוי לאחר מכן vivo, המאפשר MS2-sRNA לקיים אינטראקציה עם השותפים הסלולריים שלה. לאחר קצירת חיידקים, התאים הם lysed מכנית. התמצית הגולמית נטענת לתוך עמוד כרומטוגרפיה המבוסס על אמילוס, שהיה מצופה בעבר בחלבון MS2 המותך לחלבון הכריכה המלטוזי. פעולה זו מאפשרת לכידה ספציפית של MS2-sRNA ו- RNAs אינטראקציה. לאחר התרוממות רוח, RNAs מטוהרים מזוהים על ידי רצף RNA בעל תפוקה גבוהה וניתוח ביואינפורמטי עוקב. הפרוטוקול הבא יושם בפתוגן האנושי גראם חיובי סטפילוקוקוס aureus והוא, באופן עקרוני, transposable לכל חיידקים גראם חיובי. לסיכום, טכנולוגיית MAPS מהווה שיטה יעילה לחקור לעומק את הרשת הרגולטורית של sRNA מסוים, ומציעה תמונת מצב של כל היעד שלה. עם זאת, חשוב לזכור כי מטרות putative שזוהו על ידי MAPS עדיין צריך להיות מאומת על ידי גישות ניסיוניות משלימות.

התוצאות הייצוגיות מקורן במחקר של יעד RsaC ב S. aureus29. RsaC הוא SRNA לא קונבנציונלי באורך 1,116 nt. הקצה של 5' מכיל מספר אזורים חוזרים ונשנים בעוד הקצה 3 ' שלה (544 nt) הוא עצמאי מבחינה מבנית ומכיל את כל אתרי האינטראקציה החזויים עם מטרות mRNA שלה. הביטוי של sRNA זה הוא המושרה כאשר מנגן (Mn) הוא נדיר,...

Watch this Scientific Journal Video about MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria at JoVE.com

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

טכנולוגיית MAPS פותחה כדי לבחון את היעד של RNA רגולטורי ספציפי ב vivo. sRNA של עניין מתויג עם APTAMER MS2 המאפשר טיהור משותף של שותפי RNA שלה וזיהוי שלהם על ידי רצף RNA. פרוטוקול שונה זה מתאים במיוחד לחיידקים גראם חיוביים.

טיהור MS2-זיקה בשילוב עם רצף RNA בחיידקים גראם חיוביים

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

MS2-זיקה טיהור בשילוב עם רצף RNA או MAPS פותחה כדי לזהות את היעד כולו של כל RNA של עניין בחיידקים. טכנולוגיה זו מאפשרת לזהות כל סוג של שותפי sRNA ללא תלות במנגנון הרגולציה. האפיון של רשתות רגולטוריות תלויות sRNA יעזור להבין גורמי ארסיות טובים יותר ייצור, היווצרות ביופילם, והישרדות של החיידקים בתוך התאים המארחים, ובסופו של דבר להילחם נגד זיהומים staphylococcal.פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על כל חיידקים פתוגניים או לא פתוגניים גרם חיובי. מי שתדגים את ההליך תהיה נעמי מרסייה, דוקטורנטית מהמעבדה של ד"ר פסקל רומבי. כדי להתחיל, לגדל מושבה אחת של זנים הנושאים גם pCN51 P3 MS2 sRNA או pCN51 P3 MS2 פלסמידים בשלושה מיליליטר של בינוני BHI בתוספת 10 מיקרוגרם לכל אריתרומיצין מיקרוליטר בכפילויות.לדלל כל תרבות לילה ב 50 מיליליטר של בינוני BHI טרי בתוספת אריתרומיצין להגיע OD 600 של 0.05. לגדל את התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד ב 180 סל"ד במשך שש שעות. להעביר כל תרבות לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר וצנטריפוגה הצינורות ב 2, 900 פעמים G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ואז להשליך את supernatant, להקפיא ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס או לשמור את כדורי על הקרח ישירות לבצע תמוגה תא מכני.כדי לבצע תמוגה תא מכני, resuspend כדורי בחמישה מיליליטר של חיץ A ולהעביר את התאים לשימוש חוזר ל 15 מיליליטר צנטריפוגות צינורות עם 3.5 גרם של חרוזי סיליקה. הכנס את הצינורות למכשיר תמוגה תא מכני ולהפעיל מחזור של 40 שניות בארבעה מטרים לשנייה. צנטריפוגה הצינורות ב 2, 900 פעמים G במשך 15 דקות, ואז לשחזר את supernatant ולשמור אותו על הקרח.ודא כי supernatant ברור, חוזר על הצנטריפוגה אם זה לא. הסר את קצה העמודה ולאחר מכן הצב עמודת כרומטוגרפיה בארון תקשורת של עמודים ושטוף את העמוד במים דקים במיוחד. הוסף 300 מיקרוליטרים של שרף amylose ולשטוף את העמודה עם 10 מיליליטר של מאגר A.Dilute 1, 200 picamoles של חלבון MBP-MS2 בשישה מיליליטר של חיץ A ולטעון אותו לתוך העמודה.לשטוף את העמודה עם 10 מיליליטר של חיץ A.Next, לבצע טיהור MS2-זיקה. לטעון את התא lysate לתוך העמודה ולאסוף את השבר זרימה דרך בצינור אוסף נקי. לשטוף את הטור שלוש פעמים עם 10 מיליליטר של חוצץ A ולאסוף את שבר לשטוף, ואז elute את העמודה עם מיליליטר אחד של חיץ E ולאסוף את שבר elution ב microtube שני מיליליטר.שמור את כל השברים שנאספו על קרח עד מיצוי RNA. השתמש מיליליטר אחד של כל שבר עבור מיצוי RNA. מוסיפים נפח אחד של פנול ל- RNA ומערבבים במרץ, ואז צנטריפוגה התערובת ב 16, 000 פעמים G במשך 10 דקות ב 20 מעלות צלזיוס.העבר את השלב העליון למיקרו-צינור נקי של שני מיליליטר. הוסף נפח אחד של אלכוהול איזואמיל כלורופורם ולחזור על הצנטריפוגה, ולאחר מכן להעביר את השלב העליון לצינור חדש. הוסף 2.5 כרכים של 100% אתנול קר ונפח 0.1 של שלושה נתרן אצטט טוחן ב- pH 5.2 ומזרז לילה במינוס 20 מעלות צלזיוס.למחרת, צנטריפוגה הצינורות במשך 15 דקות ב 16, 000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס. לאט להסיר את האתנול עם פיפטה, מקפיד לא להפריע גלולה. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של 80% אתנול קר וצנטריפוגה לחמש דקות.להשליך את האתנול על ידי pipetting אותו לאט, ואז לייבש את גלולה באמצעות רכז ואקום במשך חמש דקות במצב ריצה. Resuspend גלולה בנפח המתאים של מים אולטרה-דקים. פרוטוקול זה שימש כדי ללמוד את היעד RsaC בS.aureus.מספר mRNAs אינטראקציה ישירה עם RsaC זוהו באמצעות טכנולוגיית MAPS, חושף את תפקידה המכריע מתח חמצוני ותגובות הקשורות מתכת. כדי לאשר את מבנה ה-MS2 sRNA ולהמחיש את דפוס הביטוי שלהם, תאים נקצרו לאחר שעתיים, ארבע ושש שעות של צמיחה במדיום BHI. RNA חולץ וניתוח כתם צפון בוצע באמצעות בדיקה DIG ספציפי RsaC.רמת RsaC אנדוגני גדל באופן משמעותי לאחר שש שעות של צמיחה. חשוב לציין, רמת MS2-RsaC 544 ו MS2-RsaC 1, 116 היו דומים RsaC אנדוגני בשש שעות. טיהור זיקה בוצע RNAs חולצו מן התמצית הגולמית, זרימה דרך, שברי elution בזן סוג פראי המבטא את תג MS2 לבד ואת זן RsaC מוטציה המבטא את MS2-RsaC 544 לבנות.1, 116 nucleotide ארוך endogenous RsaC הועשר בשבר elution, אבל אינטראקציה לא במיוחד עם עמודת הזיקה בשל אורכו ומבנה משני מורכב. MS2-RsaC 544 היה מועשר מאוד בשבר elution המוכיח כי הוא נשמר בהצלחה על ידי חלבון היתוך MS2-MBP. ניתוח ביואינפורמטי חשף מטרות mRNA putative על פי שינוי הקיפול בין MS2 sRNA ו MS2 שליטה, המציין כי SODA היה היעד putative הראשון.ניתוח כתם צפוני ביצע בדיקה DIG ספציפית לסודה לאחר טיהור MS2-זיקה מראה כי SODA היה מועשר ביעילות עם MS2-RsaC 544 בהשוואה לבקרת MS2. בעת ניסיון לפרוטוקול זה, זכור שהתוספת של תג MS2 יכולה להשפיע על אישור, יציבות או פונקציה של sRNA. זה צריך להיות במעקב קפדני.MAPS מספק תמונת מצב של זיווג מטרות sRNA-RNA. אימות ניסיוני נוסף יחשוף את תפקידם. טכניקה זו מייצגת כלי רב עוצמה לבניית רשתות רגולטוריות sRNA בכל חיידק.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

גידול גבישים חלבון עם ממדים ברורים באמצעות כלים אוטומטיים התגבשות בשילוב עם בחיי עיר פיזור אור דינאמי

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

צעד אחר צעד טיהור של מתחמי Macromolecular בעזרת RNA המצורפת ביוטין, מקשר צילום-cleavable

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

תרגום הריבוכמה אהדה לטיהור (מלכודת) לבידוד רנ א מתאי האנדותל בvivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

מהירה מאוד וספציפית תיוג מטבולי של RNA ב Vivo עם 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

מיצוי RNA מהיר וחסכוני של רקמת הלבלב חולדה

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...