Name: ms2-affinity purification coupled with rna sequencing in gram-positive bacteria
Uploaded: 2021-02-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dalla "Agence Nationale de la Recherche" (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH e ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, a PR). È stato anche pubblicato nell'ambito del labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 e di ANR-17-EURE- 0023 (a PR), come finanziamento dallo Stato gestito da ANR nell'ambito degli investimenti per il futuro programma. DL è stato supportato dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skłodowska-Curie n. 753137-SaRNAReg. Il lavoro in E. Massé Lab è stato supportato da sovvenzioni operative del Canadian Institutes of Health Research (CIHR), del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) e del National Institutes of Health NIH Team Grant R01 GM092830-06A1.

1. Buffer e supporti
<ol><li>Per gli esperimenti MAPS, preparare i seguenti buffer e supporti: - Tampone A (150 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT) - Tampone E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM maltosio, 0,1% Tritone, 1 mM MgCl2 e 1 mM DTT) - Tampone di carico dell'RNA (0,025% cianolo di xilene e 0,025% blu bromofenolo in urea 8 M) - Mezzo per infusione di cuore cerebrale (BHI) (12,5 g di cervello di vitello, 10 g di peptone, 5 g di cuore di manzo...

<ol>
	<li>Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadening+the+Definition+of+Bacterial+Small+RNAs:+Characteristics+and+Mechanisms+of+Action.">Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action.</a> Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).</li><li>H&#246;r, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Acting+Small+RNAs+and+Their+Effects+on+Gene+Expression+in+Escherichia+coli+and+Salmonella+enterica.">Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica.</a> EcoSal Plus. 9 (1), (2020).</li><li>Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+RNA.">Noncoding RNA.</a> Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).</li><li>Adams, P. P., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+small+base-pairing+RNAs+derived+from+diverse+genomic+loci.">Prevalence of small base-pairing RNAs derived from diverse genomic loci.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (7), 194524 (2020).</li><li>Pain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+assessment+of+bacterial+small+RNA+target+prediction+programs.">An assessment of bacterial small RNA target prediction programs.</a> RNA Biology. 12 (5), 509-513 (2015).</li><li>Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S., Lalaouna, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Navigation+through+the+twists+and+turns+of+RNA+sequencing+technologies:+Application+to+bacterial+regulatory+RNAs.">Navigation through the twists and turns of RNA sequencing technologies: Application to bacterial regulatory RNAs.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Gene Regulatory Mechanisms. , 194506 (2020).</li><li>Wright, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CopraRNA+and+IntaRNA:+predicting+small+RNA+targets,+networks+and+interaction+domains.">CopraRNA and IntaRNA: predicting small RNA targets, networks and interaction domains.</a> Nucleic Acids Research. 42, 119-123 (2014).</li><li>Smirnov, A., Schneider, C., Hor, J., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+new+RNA+classes+and+global+RNA-binding+proteins.">Discovery of new RNA classes and global RNA-binding proteins.</a> Current Opinion in Microbiology. 39, 152-160 (2017).</li><li>Saliba, A. E., Santos, S., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+RNA-seq+approaches+for+the+study+of+bacterial+pathogens.">New RNA-seq approaches for the study of bacterial pathogens.</a> Current Opinion in Microbiology. 35, 78-87 (2017).</li><li>Melamed, S., Adams, P. P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-RNA+Interactomes+of+ProQ+and+Hfq+Reveal+Overlapping+and+Competing+Roles.">RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles.</a> Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).</li><li>Melamed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Mapping+of+Small+RNA-Target+Interactions+in+Bacteria.">Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria.</a> Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).</li><li>Iosub, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq+CLASH+uncovers+sRNA-target+interaction+networks+linked+to+nutrient+availability+adaptation.">Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Waters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+interactome+of+pathogenic+E.+revealed+through+crosslinking+of+RNase+E.">Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E.</a> The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).</li><li>Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+molecular+interactions+broaden+the+functions+of+the+RNA+chaperone+Hfq.">New molecular interactions broaden the functions of the RNA chaperone Hfq.</a> Current Genetics. , (2019).</li><li>Kavita, K., de Mets, F., Gottesman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+aspects+of+RNA-based+regulation+by+Hfq+and+its+partner+sRNAs.">New aspects of RNA-based regulation by Hfq and its partner sRNAs.</a> Current Opinion in Microbiology. 42, 53-61 (2018).</li><li>Bohn, C., Rigoulay, C., Bouloc, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=No+detectable+effect+of+RNA-binding+protein+Hfq+absence+in+Staphylococcus+aureus.">No detectable effect of RNA-binding protein Hfq absence in Staphylococcus aureus.</a> BMC Microbiology. 7, 10 (2007).</li><li>Jousselin, A., Metzinger, L., Felden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+facultative+requirement+of+the+bacterial+RNA+chaperone,+Hfq.">On the facultative requirement of the bacterial RNA chaperone, Hfq.</a> Trends in Microbiology. 17 (9), 399-405 (2009).</li><li>Olejniczak, M., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProQ/FinO-domain+proteins:+another+ubiquitous+family+of+RNA+matchmakers.">ProQ/FinO-domain proteins: another ubiquitous family of RNA matchmakers.</a> Molecular Microbiology. 104 (6), 905-915 (2017).</li><li>Lalaouna, D., Desgranges, E., Caldelari, I., Marzi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+Sixteen+-+MS2-Affinity+Purification+Coupled+With+RNA+Sequencing+Approach+in+the+Human+Pathogen+Staphylococcus+aureus.">Chapter Sixteen - MS2-Affinity Purification Coupled With RNA Sequencing Approach in the Human Pathogen Staphylococcus aureus.</a> Methods in Enzymology. 612, 393-411 (2018).</li><li>Lalaouna, D., Prevost, K., Eyraud, A., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+unknown+RNA+partners+using+MAPS.">Identification of unknown RNA partners using MAPS.</a> Methods. 117, 28-34 (2017).</li><li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3'+external+transcribed+spacer+in+a+tRNA+transcript+acts+as+a+sponge+for+small+RNAs+to+prevent+transcriptional+noise.">A 3' external transcribed spacer in a tRNA transcript acts as a sponge for small RNAs to prevent transcriptional noise.</a> Molecular Cell. 58 (3), 393-405 (2015).</li><li>Lalaouna, D., Morissette, A., Carrier, M. C., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DsrA+regulatory+RNA+represses+both+hns+and+rbsD+mRNAs+through+distinct+mechanisms+in+Escherichia+coli.">DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).</li><li>Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+silencing+mechanisms+of+the+same+target+mRNA+by+two+regulatory+RNAs+in+Escherichia+coli.">Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).</li><li>Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GcvB+small+RNA+uses+two+distinct+seed+regions+to+regulate+an+extensive+targetome.">GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome.</a> Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).</li><li>Silva, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SraL+sRNA+interaction+regulates+the+terminator+by+preventing+premature+transcription+termination+of+rho+mRNA.">SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).</li><li>Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sRNA+interacting+with+a+transcript+of+interest+using+MS2-affinity+purification+coupled+with+RNA+sequencing+(MAPS)+technology.">Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology.</a> Genomics Data. 5, 136-138 (2015).</li><li>Tomasini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+targetome+of+Staphylococcus+aureus+non-coding+RNA+RsaA:+impact+on+cell+surface+properties+and+defense+mechanisms.">The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms.</a> Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).</li><li>Bronesky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+small+RNA+modulates+gene+expression+upon+glucose+limitation+in+Staphylococcus+aureus.">A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus.</a> The EMBO Journal. 38 (6), (2019).</li><li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RsaC+sRNA+modulates+the+oxidative+stress+response+of+Staphylococcus+aureus+during+manganese+starvation.">RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).</li><li>Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+New+Bacterial+Small+RNA+Targets+Using+MS2+Affinity+Purification+Coupled+to+RNA+Sequencing.">Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction.">Polymerase chain reaction.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).</li><li>Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+for+optimization+of+DNA+ligation+reactions.">Kinetic analysis for optimization of DNA ligation reactions.</a> Nucleic Acids Research. 16 (21), 10301-10321 (1988).</li><li>Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+plasmid+DNA+into+cells.">Introduction of plasmid DNA into cells.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2001).</li><li>Sanger, F., Coulson, A. R., Barrell, B. G., Smith, A. J. H., Roe, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+in+single-stranded+bacteriophage+as+an+aid+to+rapid+DNA+sequencing.">Cloning in single-stranded bacteriophage as an aid to rapid DNA sequencing.</a> Journal of Molecular Biology. 143 (2), 161-178 (1980).</li><li>Grosser, M. R., Richardson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+Preparation+and+Electroporation+of+S.+aureus+and+S.+epidermidis.">Method for Preparation and Electroporation of S. aureus and S. epidermidis.</a> Methods in Molecular Biology. 1373, 51-57 (2016).</li><li>Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Northern+blot+analysis.">Northern blot analysis.</a> Methods in Molecular Biology. 58, 113-128 (1996).</li><li>Koontz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis.">Agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 529, 35-45 (2013).</li><li>Afgan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Galaxy+platform+for+accessible,+reproducible+and+collaborative+biomedical+analyses:+2016+update.">The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update.</a> Nucleic Acids Reseaerch. 44, 3-10 (2016).</li><li>Jagodnik, J., Brosse, A., Le Lam, T. N., Chiaruttini, C., Guillier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+study+of+base-pairing+small+regulatory+RNAs+in+bacteria.">Mechanistic study of base-pairing small regulatory RNAs in bacteria.</a> Methods. 117, 67-76 (2017).</li><li>Mann, M., Wright, P. R., Backofen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IntaRNA+2.0:+enhanced+and+customizable+prediction+of+RNA-RNA+interactions.">IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).</li><li>Georg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+cooperation:+Experimental+and+computational+approaches+in+the+functional+characterization+of+bacterial+sRNAs.">The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs.</a> Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).</li></ol>

Un protocollo modificato per i batteri Gram-positivi Il protocollo iniziale di MAPS è stato sviluppato per studiare l'interactoma dello sRNA nell'organismo modello E. coli20,30. Qui descriviamo un protocollo modificato adatto alla caratterizzazione di reti regolatorie dipendenti dall'sRNA nell'opportunistico agente patogeno umano S. aureus ed è certamente trasponibile ad altri batteri Gram-positivi, patogeni o meno.
<p ...

Centinaia, forse anche migliaia di piccoli RNA (SRNA) normativi sono stati identificati nella maggior parte dei genomi batterici, ma le funzioni della stragrande maggioranza di essi rimangono insolito. Nel complesso, gli sRNA sono molecole brevi e non codificanti, che svolgono ruoli importanti nella fisiologia batterica e nell'adattamento agli ambientifluttuanti1,2,3. Infatti, queste macromolecole sono al centro di numerose reti normative complesse, che hanno un impatto sulle vie metaboliche, sulle risposte allo stress ma anche sulla virulenza e sulla resistenza agli antibiotici. Logicamente, la loro sintesi è innescata da specifici stimoli ambientali (ad esempio, fame di nutrienti, stress ossidativi o di membrana). La maggior parte degli sRNA regola più mRNA di destinazione a livello post-trascrizionale attraverso l'accoppiamento di base breve e non contiguo. Di solito impediscono l'avvio della traduzione competendo con i ribosomi per le regioni di iniziazione allatraduzione 4. La formazione di duplex sRNA:mRNA spesso si traduce anche nella degradazione attiva dell'mRNA bersaglio mediante reclutamento di specifiche RNasi.
La caratterizzazione di un targetome di sRNA (cioè l'intero insieme dei suoi RNA bersaglio) consente l'identificazione delle vie metaboliche in cui interviene e del potenziale segnale a cui risponde. Di conseguenza, le funzioni di uno specifico sRNA possono generalmente essere dedotte dal suo targetome. A tal fine, sono stati sviluppati diversi strumenti di previsione del silico come IntaRNA e CopraRNA5,6,7. In particolare si basano sulla complementarità delle sequenze, sull'accoppiamento dell'energia e sull'accessibilità del potenziale sito di interazione per determinare i partner di sRNA putativi. Tuttavia, gli algoritmi di previsione non integrano tutti i fattori che influenzano l'accoppiamento di base in vivo come il coinvolgimento degli RNA chaperones8 favorendo interazioni non ottimali o la co-espressione di entrambi i partner. A causa dei loro limiti intrinseci, il tasso falso positivo di strumenti di previsione rimane elevato. La maggior parte degli approcci sperimentali su larga scala si basano sulla co-purificazione delle coppie sRNA:mRNA che interagiscono con una proteina taggata di legame RNA (RBP)6,9. Ad esempio, il metodo RNA Interaction by Ligation and sequencing (RIL-seq) ha identificato duplex di RNA co-purificati con chaperones di RNA come Hfq e ProQ in Escherichia coli10,11. Una tecnologia simile chiamata UV-Crosslinking, Ligation And Sequencing of Hybrids (CLASH) è stata applicata agli SRNA associati a RNasi E- e Hfq in E. coli12,13. Nonostante i ruoli ben descritti di Hfq e ProQ nella regolazione mediata da sRNA in più batteri8,14,15, la regolazione a base di sRNA sembra essere indipendente dall'RNA in diversi organismi come S. aureus16,17,18. Anche se la purificazione dei duplex RNA in associazione con le RNasi è fattibile come dimostrato da Waters e colleghi13, questo rimane difficile poiché le RNasi innescano il loro rapido degrado. Pertanto, l'approccio MS2-Affinity Purification accoppiato con RNA Sequencing (MAPS)19,20 costituisce una solida alternativa in tali organismi.
A differenza dei metodi sopra menzionati, MAPS utilizza uno sRNA specifico come esca per catturare tutti gli RNA interagenti e quindi non si basa sul coinvolgimento di un RBP. L'intero processo è illustrato nella figura 1. In breve, l'sRNA viene taggato a 5' con l'aptamero di RNA MS2 che è specificamente riconosciuto dalla proteina del mantello MS2. Questa proteina è fusa con la proteina legante del maltosio (MBP) da immobilizzare su una resina amilosio. Pertanto, MS2-sRNA e i suoi partner RNA vengono mantenuti sulla colonna cromatografica di affinità. Dopo l'eluizione con maltosio, gli RNA co-purificati vengono identificati utilizzando il sequenziamento dell'RNA ad alta produttività seguito da analisi bioinformatiche (Figura 2). La tecnologia MAPS alla fine disegna una mappa interattiva di tutte le potenziali interazioni che si verificano in vivo.
La tecnologia MAPS è stata originariamente implementata nel batterio Gram-negativo non patogeno E. coli21. Sorprendentemente, MAPS ha aiutato a identificare un frammento derivato dal tRNA che interagisce specificamente con gli sRNA RyhB e RybB e prevenire qualsiasi rumore trascrizionale di sRNA per regolare gli obiettivi di mRNA in condizioni non induttivo. Successivamente, MAPS è stato applicato con successo ad altri E. coli sRNA come DsrA22, RprA23, CyaR23 e GcvB24 (tabella 1). Oltre a confermare obiettivi precedentemente noti, MAPS ha esteso il targetome di questi noti SRNA. Recentemente, MAPS è stato eseguito in Salmonella Typhimurium e ha rivelato che SraL sRNA si lega a rho mRNA, codificando per un fattore di terminazione di trascrizione25. Attraverso questo accoppiamento, SraL protegge rho mRNA dalla terminazione prematura della trascrizione innescata da Rho stessa. È interessante notare che questa tecnologia non è limitata agli sRNA e può essere applicata a qualsiasi tipo di RNA cellulare, come esemplificato dall'uso di un frammento derivato da tRNA26 e di una regione non tradotta di 5'di mRNA22 (Tabella 1).
Il metodo MAPS è stato adattato anche al batterio gram-positivo patogeno S. aureus19. In particolare, il protocollo di lysis è stato ampiamente modificato per rompere efficacemente le cellule a causa di una parete cellulare più spessa rispetto ai batteri Gram-negativi e per mantenere l'integrità dell'RNA. Questo protocollo adattato ha già svelato l'interactome di RsaA27,RsaI28 e RsaC29. Questo approccio ha fornito approfondimenti sul ruolo cruciale di questi sRNA nei meccanismi regolatori delle proprietà della superficie cellulare, dell'assorbimento del glucosio e delle risposte allo stress ossidativo.
Il protocollo sviluppato e implementato in E. coli nel 2015 è stato recentemente descritto in dettaglio30. Qui, forniamo il protocollo MAPS modificato, che è particolarmente adatto per lo studio delle reti normative sRNA nei batteri Gram-positivi (parete cellulare più spessa) sia non patogeni che patogeni (precauzioni di sicurezza).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="834">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:187px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.690.001</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:187px;">Starstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2939BA</td>
			<td>RNA quantity and quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">250 mL culture flask</td>
			<td style="width:187px;">Dominique Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">2515074</td>
			<td>Bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352051</td>
			<td>Culture centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:187px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">20821.321</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Allegra X-12R Centrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bacterial pelleting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ampicilin (amp)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9518-5G</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Amylose resin</td>
			<td style="width:187px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">E8021S</td>
			<td>MS2-affinity purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Anti-dioxigenin AP Fab fragment</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11093274910</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autoradiography cassette</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-212-726</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">BamHI</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0051</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">BHI (Brain Heart Infusion) Broth</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">53286</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11096176001</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">CDP-Star</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11759051001</td>
			<td>Northern blot assays (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Centrifuge 5415 R</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform</td>
			<td style="width:187px;">Dominique Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">508320-CER</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">DIG-RNA labelling mix</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11277073910</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">DNase I</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td>DNase treatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythromycin (ery)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Fluka 45673</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPrep device</td>
			<td style="width:187px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">116004500</td>
			<td>Mechanical lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidium Thiocyanate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9277-250G</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Hybridization Hoven Hybrigene</td>
			<td style="width:187px;">Techne</td>
			<td style="width:119px;">FHB4DD</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Hybridization tubes</td>
			<td style="width:187px;">Techne</td>
			<td style="width:119px;">FHB16</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A/6960/08</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">LB (Lysogeny Broth)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Matrix B Bulk</td>
			<td style="width:187px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">6540-428</td>
			<td>Mechanical lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:187px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652100</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Milli-Q water device</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA/DNA quantity and quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:187px;">Dominique Dutsher</td>
			<td style="width:119px;">10600002</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Phembact Neutre</td>
			<td style="width:187px;">PHEM Technologies</td>
			<td style="width:119px;">BAC03-5-11205</td>
			<td>Cleaning and decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Phenol</td>
			<td style="width:187px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">38.2</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:187px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">pMBP-MS2</td>
			<td style="width:187px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">65104</td>
			<td>MS2-MBP production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Poly-Prep chromatography column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td style="width:119px;">7311550</td>
			<td>MS2-affinity purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PstI</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0615</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit 3 Fluorometer</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15387293</td>
			<td>RNA quantity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">RNAPro Solution</td>
			<td style="width:187px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">6055050</td>
			<td>Mechanical lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ScriptSeq Complete Kit</td>
			<td style="width:187px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">BB1224</td>
			<td>Preparation of cDNA librairies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Spectrophotometer Genesys 20</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11972278</td>
			<td>Bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">SpeedVac Savant vacuum device</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DNA120</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Stratalinker UV Crosslinker 1800</td>
			<td style="width:187px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;">400672</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EL0014</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">TBE (Tris-Borate-EDTA)</td>
			<td style="width:187px;">Euromedex</td>
			<td style="width:119px;">ET020-C</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ThermalCycler T100</td>
			<td style="width:187px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1861096</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416-100ML</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-ray film processor</td>
			<td style="width:187px;">hu.q</td>
			<td style="width:119px;">HQ-350XT</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">X-ray films Super RX-N</td>
			<td style="width:187px;">FujiFilm</td>
			<td style="width:119px;">4741019318</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ms2-affinity purification coupled with rna sequencing in gram-positive bacteria

Sebbene i piccoli RNA regolatori (sRNA) siano diffusi tra il dominio batterico della vita, le funzioni di molti di loro rimangono scarsamente caratterizzate in particolare a causa della difficoltà di identificare i loro obiettivi di mRNA. Qui, abbiamo descritto un protocollo modificato della purificazione ms2-affinity accoppiato con la tecnologia RNA Sequencing (MAPS), con l'obiettivo di rivelare tutti i partner RNA di uno specifico sRNA in vivo. In generale, l'aptamero MS2 è fuso all'estremità 5 ' dell'sRNA di interesse. Questo costrutto viene quindi espresso in vivo, permettendo all'MS2-sRNA di interagire con i suoi partner cellulari. Dopo la raccolta batterica, le cellule vengono leccate meccanicamente. L'estratto grezzo viene caricato in una colonna cromatografica a base di amilosio precedentemente rivestita con la proteina MS2 fusa alla proteina legante del maltosio. Ciò consente l'acquisizione specifica di MS2-sRNA e RNA interagenti. Dopo l'eluizione, gli RNA co-purificati sono identificati dal sequenziamento dell'RNA ad alta produttività e dalla successiva analisi bioinformatica. Il seguente protocollo è stato implementato nell'agente patogeno umano Gram-positivo Staphylococcus aureus ed è, in linea di principio, trasponibile a qualsiasi batterio Gram-positivo. In sintesi, la tecnologia MAPS costituisce un metodo efficiente per esplorare a fondo la rete normativa di un particolare sRNA, offrendo un'istantanea dell'intero targetome. Tuttavia, è importante tenere presente che gli obiettivi putativi identificati da MAPS devono ancora essere convalidati da approcci sperimentali complementari.

I risultati rappresentativi derivano dallo studio del targetome RsaC in S. aureus29. RsaC è uno sRNA non convenzionale lungo 1.116 nt. La sua estremità di 5' contiene diverse regioni ripetute mentre la sua estremità di 3 ' (544 nt) è strutturalmente indipendente e contiene tutti i siti di interazione previsti con i suoi obiettivi di mRNA. L'espressione di questo sRNA è indotta quando il manganese (Mn) è scarso, che si incontra spesso nel contesto della risposta immunitaria dell'ospi...

Watch this Scientific Journal Video about MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria at JoVE.com

MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

La tecnologia MAPS è stata sviluppata per esaminare il targetome di uno specifico RNA normativo in vivo. L'sRNA di interesse è contrassegnato con un aptamer MS2 che consente la co-purificazione dei suoi partner di RNA e la loro identificazione tramite sequenziamento dell'RNA. Questo protocollo modificato è particolarmente adatto per i batteri Gram-positivi.

Purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con sequenziamento dell'RNA nei batteri gram-positivi

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

La purificazione dell'affinità MS2 accoppiata con il sequenziamento dell'RNA o MAPS è stata sviluppata per identificare l'intero targetome di qualsiasi RNA di interesse per i batteri. Questa tecnologia consente di identificare qualsiasi tipo di partner sRNA indipendentemente dal meccanismo di regolazione. La caratterizzazione delle reti normative dipendenti dall'sRNA aiuterà a comprendere meglio la produzione di fattori di virulenza, la formazione di biofilm e la sopravvivenza dei batteri all'interno delle cellule ospiti e, in ultima analisi, a combattere le infezioni stafilococco.Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi batterio gram-positivo patogeno o non patogeno. A dimostrare la procedura sarà Noemie Mercier, dottoranda del laboratorio del Dr.Pascal Romby. Per iniziare, far crescere una colonia di ceppi che trasportano pCN51 P3 MS2 sRNA o pCN51 P3 MS2 plasmidi in tre millilitri di mezzo BHI integrati con 10 microgrammi per microliterero eriomicina in duplicati.Diluire ogni coltura notturna in 50 millilitri di mezzo BHI fresco integrato con eringomicina per raggiungere un OD 600 di 0,05. Fai crescere le colture a 37 gradi Celsius tremando a 180 giri/min per sei ore. Trasferire ogni coltura in un tubo di centrifuga da 50 millilitri e centrifugare i tubi a 2.900 volte G per 15 minuti a quattro gradi Celsius, quindi scartare il supernatante, congelarli e conservarli a meno 80 gradi Celsius o mantenere i pellet sul ghiaccio ed eseguire direttamente la lisi meccanica delle celle.Per eseguire la lisi cellulare meccanica, resuspend pellets in cinque millilitri di tampone A e trasferire le cellule rimescolate in tubi di centrifuga da 15 millilitri con 3,5 grammi di perline di silice. Inserire i tubi in uno strumento dilisi a celle meccaniche ed eseguire un ciclo di 40 secondi a quattro metri al secondo. Centrifugare i tubi a 2.900 volte G per 15 minuti, quindi recuperare il supernatante e tenerlo sul ghiaccio.Assicurarsi che il supernatante sia chiaro, ripetendo la centrifugazione in caso di allora. Rimuovere la punta della colonna, quindi inserire una colonna cromatografica in un rack di colonne e lavare la colonna con acqua ultrapura. Aggiungere 300 microlitri di resina amilosio e lavare la colonna con 10 millilitri di tampone A.Diluire 1.200 picamoli di proteine MBP-MS2 in sei millilitri del tampone A e caricarla nella colonna.Lavare la colonna con 10 millilitri di tampone A.Next, eseguire la purificazione dell'affinità MS2. Caricare il lisato della cella nella colonna e raccogliere la frazione flow-through in un tubo di raccolta pulito. Lavare la colonna tre volte con 10 millilitri di tampone A e raccogliere la frazione di lavaggio, quindi eludere la colonna con un millilitro di tampone E e raccogliere la frazione di eluizione in un microtubo da due millilitri.Conservare tutte le frazioni raccolte sul ghiaccio fino all'estrazione dell'RNA. Utilizzare un millilitro di ogni frazione per l'estrazione dell'RNA. Aggiungere un volume di fenolo all'RNA e mescolare vigorosamente, quindi centrifugare la miscela a 16.000 volte G per 10 minuti a 20 gradi Celsius.Trasferire la fase superiore in un microtubo pulito da due millilitri. Aggiungere un volume di alcol isoamilico cloroformio e ripetere la centrifugazione, quindi trasferire la fase superiore in un nuovo tubo. Aggiungere 2,5 volumi di etanolo freddo al 100% e 0,1 volume di tre acetati di sodio molare a pH 5,2 e precipitare durante la notte a meno 20 gradi Celsius.Il giorno successivo, centrifuga i tubi per 15 minuti a 16.000 volte G e quattro gradi Celsius. Rimuovere lentamente l'etanolo con una pipetta, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Aggiungere 500 microlitri di etanolo freddo all'80% e centrifuga per cinque minuti.Scartare l'etanolo tubazione lentamente, quindi asciugare il pellet utilizzando un concentratore sottovuoto per cinque minuti in modalità di corsa. Rimescolare il pellet in un volume appropriato di acqua ultrapura. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare il targetome RsaC in S.aureus.Diversi mRNA che interagiscono direttamente con RsaC sono stati identificati utilizzando la tecnologia MAPS, rivelando il suo ruolo cruciale nello stress ossidativo e nelle risposte correlate ai metalli. Per confermare i costrutti di sRNA MS2 e visualizzare il loro modello di espressione, le cellule sono state raccolte dopo due, quattro e sei ore di crescita nel mezzo BHI. L'RNA è stato estratto e l'analisi della macchia settentrionale è stata eseguita utilizzando la sonda DIG specifica di RsaC.Il livello di RsaC endogena è aumentato significativamente dopo sei ore di crescita. È importante sottolineare che il livello di MS2-RsaC 544 e MS2-RsaC 1, 116 era paragonabile a rsac endogeno a sei ore. La purificazione dell'affinità è stata eseguita e gli RRNA sono stati estratti dalle frazioni di estrazione grezza, flusso-through ed eluizione nel ceppo di tipo selvaggio che esprime solo il tag MS2 e il ceppo RsaC mutante che esprime il costrutto MS2-RsaC 544.L'RsaC endogeno lungo 1.116 nucleotidi fu arricchito nella frazione di eluizione, ma interagiva non specificamente con la colonna di affinità a causa della sua lunghezza e della complessa struttura secondaria. L'MS2-RsaC 544 è stato altamente arricchito nella frazione di eluizione dimostrando che è stato mantenuto con successo dalla proteina di fusione MS2-MBP. Un'analisi bioinformatica ha rivelato obiettivi putativi di mRNA in base al cambiamento di piegatura tra il controllo MS2 sRNA e MS2, indicando che sodA era il primo bersaglio putativo.Un'analisi della macchia settentrionale eseguita su sonda DIG specifica di sodA dopo la purificazione dell'affinità MS2 mostra che sodA è stato efficacemente co-arricchito con MS2-RsaC 544 rispetto al controllo MS2. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che l'aggiunta del tag MS2 può influire sulla conferma, la stabilità o la funzione dell'sRNA. Questo dovrebbe essere attentamente monitorato.MAPS fornisce un'istantanea dell'accoppiamento di bersagli sRNA-RNA. Un'ulteriore convalida sperimentale svelerà la loro funzione. Questa tecnica rappresenta un potente strumento per costruire reti di regolazione dell'sRNA in qualsiasi batterio.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Ricerca

Biochimica

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Cristalli della proteina crescente con dimensioni distinte utilizzando automatizzato cristallizzazione accoppiato con In Situ dispersione della luce dinamica

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Single-step purificazione di complessi macromolecolari usando RNA attaccato alla biotina e un Linker foto-spaccabili

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagenesi sito-diretta per In Vitro e In Vivo esperimenti esemplificati con interazioni RNA in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Traduzione della purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per l'isolamento dell'RNA dalle cellule endoteliali In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

Etichettatura metabolica estremamente rapida e specifica dell'RNA In Vivo con 4-Thiouracil (Ers4tU)

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

Estrazione rapida ed economica dell'RNA del tessuto pancreatico ratto

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomica quantitativa di Saccharomyces Cerevisiae mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massa tandem

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

RIBO-seq in Bacteria: un protocollo di raccolta dei campioni e preparazione della biblioteca per il sequenziamento NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...