Name: ms2-affinity purification coupled with rna sequencing in gram-positive bacteria
Uploaded: 2021-02-23T15:00:00
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이 작품은 "기관 내셔널 드 라 레체쉬"(ANR, 그랜트 ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH 및 ANR-18-CE12-0025-04, 코노코, PR)에 의해 지원되었다. 또한 향후 프로그램에 대한 투자의 일환으로 ANR이 관리하는 국가의 자금 지원으로 LabEx NetRNA ANR-10-LABX-0036및 ANR-17-EURE-0023 (PR)의 프레임 워크에 따라 출판되었습니다. DL은 마리 스크와도우스카-퀴리 보조금 계약 제753137-SaRNAReg에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 지원되었다. E. Massé Lab의 작업은 캐나다 보건 연구소 (CIHR), 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC), 및 건강 NIH 팀 그랜트 R01 GM01 GM092830-06A1의 국립 연구소로부터 보조금을 운영함으로써 지원되었습니다.

1. 버퍼 및 미디어
<ol><li>MAPS 실험의 경우 다음 버퍼 및 미디어를 준비합니다. - 버퍼 A (150mM KCl, 20m Tris-HCl pH 8, 1 mM MgCl2 및 1 mM DTT) - 버퍼 E (250 mM KCl, 20 mM Tris-HCl pH 8, 12 mM 말토세, 0.1% 트리톤, 1 mM MgCl2 및 1 mM DTT) - RNA 적재 버퍼 (0.025 % 자일렌 시안올 및 0.025 % 브로모페놀 블루 8 M 우레아) - 뇌 심장 주입 (BHI) 매체 (종아리 뇌 12.5 g, 펩톤 10 g, 쇠고기 심장 5 g, NaCl 5 g, N...

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	<li>Carrier, M. C., Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broadening+the+Definition+of+Bacterial+Small+RNAs:+Characteristics+and+Mechanisms+of+Action.">Broadening the Definition of Bacterial Small RNAs: Characteristics and Mechanisms of Action.</a> Annual Review of Microbiology. 72, 141-161 (2018).</li><li>H&#246;r, J., Matera, G., Vogel, J., Gottesman, S., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-Acting+Small+RNAs+and+Their+Effects+on+Gene+Expression+in+Escherichia+coli+and+Salmonella+enterica.">Trans-Acting Small RNAs and Their Effects on Gene Expression in Escherichia coli and Salmonella enterica.</a> EcoSal Plus. 9 (1), (2020).</li><li>Desgranges, E., Marzi, S., Moreau, K., Romby, P., Caldelari, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+RNA.">Noncoding RNA.</a> Microbiology Spectrum. 7 (2), (2019).</li><li>Adams, P. 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P., Zhang, A., Zhang, H., Storz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-RNA+Interactomes+of+ProQ+and+Hfq+Reveal+Overlapping+and+Competing+Roles.">RNA-RNA Interactomes of ProQ and Hfq Reveal Overlapping and Competing Roles.</a> Molecular Cell. 77 (2), 411-425 (2020).</li><li>Melamed, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Mapping+of+Small+RNA-Target+Interactions+in+Bacteria.">Global Mapping of Small RNA-Target Interactions in Bacteria.</a> Molecular Cell. 63 (5), 884-897 (2016).</li><li>Iosub, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hfq+CLASH+uncovers+sRNA-target+interaction+networks+linked+to+nutrient+availability+adaptation.">Hfq CLASH uncovers sRNA-target interaction networks linked to nutrient availability adaptation.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Waters, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+RNA+interactome+of+pathogenic+E.+revealed+through+crosslinking+of+RNase+E.">Small RNA interactome of pathogenic E. revealed through crosslinking of RNase E.</a> The EMBO Journal. 36 (3), 374-387 (2017).</li><li>Dos Santos, R. F., Arraiano, C. M., Andrade, J. 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C., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DsrA+regulatory+RNA+represses+both+hns+and+rbsD+mRNAs+through+distinct+mechanisms+in+Escherichia+coli.">DsrA regulatory RNA represses both hns and rbsD mRNAs through distinct mechanisms in Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 98 (2), 357-369 (2015).</li><li>Lalaouna, D., Prevost, K., Laliberte, G., Houe, V., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+silencing+mechanisms+of+the+same+target+mRNA+by+two+regulatory+RNAs+in+Escherichia+coli.">Contrasting silencing mechanisms of the same target mRNA by two regulatory RNAs in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Research. 46 (5), 2600-2612 (2018).</li><li>Lalaouna, D., Eyraud, A., Devinck, A., Prevost, K., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GcvB+small+RNA+uses+two+distinct+seed+regions+to+regulate+an+extensive+targetome.">GcvB small RNA uses two distinct seed regions to regulate an extensive targetome.</a> Molecular Microbiology. 111 (2), 473-486 (2019).</li><li>Silva, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SraL+sRNA+interaction+regulates+the+terminator+by+preventing+premature+transcription+termination+of+rho+mRNA.">SraL sRNA interaction regulates the terminator by preventing premature transcription termination of rho mRNA.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (8), 3042-3051 (2019).</li><li>Lalaouna, D., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+sRNA+interacting+with+a+transcript+of+interest+using+MS2-affinity+purification+coupled+with+RNA+sequencing+(MAPS)+technology.">Identification of sRNA interacting with a transcript of interest using MS2-affinity purification coupled with RNA sequencing (MAPS) technology.</a> Genomics Data. 5, 136-138 (2015).</li><li>Tomasini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+targetome+of+Staphylococcus+aureus+non-coding+RNA+RsaA:+impact+on+cell+surface+properties+and+defense+mechanisms.">The RNA targetome of Staphylococcus aureus non-coding RNA RsaA: impact on cell surface properties and defense mechanisms.</a> Nucleic Acids Research. 45 (11), 6746-6760 (2017).</li><li>Bronesky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifaceted+small+RNA+modulates+gene+expression+upon+glucose+limitation+in+Staphylococcus+aureus.">A multifaceted small RNA modulates gene expression upon glucose limitation in Staphylococcus aureus.</a> The EMBO Journal. 38 (6), (2019).</li><li>Lalaouna, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RsaC+sRNA+modulates+the+oxidative+stress+response+of+Staphylococcus+aureus+during+manganese+starvation.">RsaC sRNA modulates the oxidative stress response of Staphylococcus aureus during manganese starvation.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 9871-9887 (2019).</li><li>Carrier, M. C., Laliberte, G., Masse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+New+Bacterial+Small+RNA+Targets+Using+MS2+Affinity+Purification+Coupled+to+RNA+Sequencing.">Identification of New Bacterial Small RNA Targets Using MS2 Affinity Purification Coupled to RNA Sequencing.</a> Methods in Molecular Biology. 1737, 77-88 (2018).</li><li>Garibyan, L., Avashia, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction.">Polymerase chain reaction.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (3), 1-4 (2013).</li><li>Revie, D., Smith, D. W., Yee, T. 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R., Backofen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IntaRNA+2.0:+enhanced+and+customizable+prediction+of+RNA-RNA+interactions.">IntaRNA 2.0: enhanced and customizable prediction of RNA-RNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 45, 435-439 (2017).</li><li>Georg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+of+cooperation:+Experimental+and+computational+approaches+in+the+functional+characterization+of+bacterial+sRNAs.">The power of cooperation: Experimental and computational approaches in the functional characterization of bacterial sRNAs.</a> Molecular Microbiology. 113 (3), 603-612 (2020).</li></ol>

그람 양성 박테리아에 대한 수정된 프로토콜 MAPS의 초기 프로토콜은 모델 유기체대장균(20)및30에서sRNA 상호작용을 연구하기 위해 개발되었다. 여기서, 우리는 기회성 인간 병원체 S. 아우레우스에서 sRNA 의존적인 규제 네트워크의 특성화에 적합하고 확실히 그밖 그람 양성 박테리아, 병원성 또는 아닙니다 에 이식할 수 있는...

수백, 아마도 수천 개의 작은 규제 RNA (sRNA)는 대부분의 세균게놈에서 확인되었지만, 그들 중 대다수의 기능은 특징지어지지 않습니다. 전반적으로, sRNA는 짧은 비코딩 분자, 세균성 생리학및변동하는환경에 적응에 있는 중요한 역할을1,2,3. 실제로, 이 거대 분자는 수많은 복잡한 규제 네트워크의 중심에, 신진 대사 경로에 영향을 미치는, 스트레스 반응뿐만 아니라 독성과 항생 저항. 논리적으로, 그들의 합성은 특정 환경 자극에 의해 트리거됩니다 (예를 들어, 영양소 기아, 산화 또는 막 스트레스). 대부분의 sRNA는 짧고 연속적이지 않은 염기 페어링을 통해 전사 후 수준에서 다중 표적 mRNA를 조절합니다. 그들은 일반적으로 번역 개시 영역4에대한 리보솜과 경쟁하여 번역 개시를 방지합니다. sRNA:mRNA 이중제의 형성은 또한 수시로 특정 RNases의 모집에 의하여 표적 mRNA의 적극적인 저하에 초래됩니다.
sRNA 표적(즉, 표적 RNA의 전체 세트)의 특성화는 개입하는 대사 경로의 식별과 응답할 수 있는 잠재적 신호를 허용합니다. 따라서, 특정 sRNA의 기능은 일반적으로 그것의 targetome에서 유추될 수 있습니다. 이를 위해, 실리코 예측 도구중 몇몇은 IntaRNA 및 CopraRNA5,6,7과같은 개발되었다. 특히 시퀀스 상호 보완성, 잠재적 인 상호 작용 부위의 페어링 에너지 및 접근성에 의존하여 putative sRNA 파트너를 결정합니다. 그러나, 예측 알고리즘은 RNA chaperones8의 참여와 같은 생체 내의 기본 페어링에 영향을 미치는 모든 요인을 통합하지 않으며, 이는 하위 최적 상호 작용 또는 두 파트너의 공동 발현을 선호한다. 고유한 제한으로 인해 예측 도구의 잘못된 긍정 비율은 여전히 높습니다. 대부분의 실험적인 대규모 접근법은 태그된 RNA 결합 단백질(RBP)6,9와상호 작용하는 sRNA:mRNA 커플의 공동 정화에기초한다. 예를 들어, 레깅스 및 시퀀싱(RIL-seq) 방법에 의한 RNA 상호작용은 에체리치아 대장균10,11에서Hfq 및 ProQ와 같은 RNA 샤페론과 공동 정제된 RNA 이중균을 규명하였다. 하이브리드의 UV 크로스링크, 리깅 및 시퀀싱(CLASH)이라는 유사한 기술이 대장균12,13의RNase E-및 Hfq 관련 sRNA에 적용되었다. 여러 박테리아에서 sRNA 매개 조절에서 Hfq 및 ProQ의잘 기술된 역할에도 불구하고8,14,15,sRNA 기반 조절은 S. 아우레우스16,17,18과같은 여러 유기체에서 RNA 샤페론 독립적인 것으로 보인다. RNases와 관련하여 RNA 이중화의 정제가 워터스와 동료(13)에의해 입증 된 것처럼 가능하더라도, 이것은 RNases가 급속한 저하를 유발하기 때문에 까다로운 남아있다. 따라서, RNA 염기서열분석(MAPS)접근법(MAPS)과 결합된 MS2-선호도 정화는19,20은 그러한 유기체에서 견고한 대안을 구성한다.
위에서 언급한 방법과 달리 MAPS는 특정 sRNA를 미끼로 사용하여 상호 작용하는 모든 RNA를 캡처하므로 RBP의 참여에 의존하지 않습니다. 전체 프로세스는 그림 1에표시됩니다. 간단히 말해서, sRNA는 MS2 코트 단백질에 의해 특별히 인식되는 MS2 RNA aptamer와 함께 5'에 태그된다. 이 단백질은 아밀로스 수지에 고정되는 말토스 결합 단백질(MBP)과 융합된다. 따라서, MS2-sRNA 및 그 RNA 파트너는 친화성 크로마토그래피 컬럼상에 유지된다. 말토스를 이용한 용출 후, 공동 정제 된 RNA는 생물학적 정보 분석(도 2)에이어 고처리량 RNA 시퀀싱을 사용하여 식별됩니다. MAPS 기술은 궁극적으로 생체 내에서 발생하는 모든 잠재적 상호 작용에 대한 상호 작용 맵을 그립니다.
MAPS 기술은 원래 비 병원성 그람 음성 박테리아 대장균(21)에서구현되었다. 놀랍게도 MAPS는 RyhB 및 Rybb sRNAs와 특히 상호 작용하는 tRNA 유래 단편을 식별하고 비 유도 조건에서 mRNA 표적을 조절하기 위한 sRNA 전사 소음을 방지하는 데 도움을 주었습니다. 그 후, MAPS는 DsrA22,RprA23,CyaR23 및 GcvB24 (표 1)와같은 다른 대장균 sRNA에 성공적으로 적용되었습니다. MAPS는 이전에 알려진 대상을 확인하는 것 외에도 이러한 잘 알려진 sRNA의 대상을 확장했습니다. 최근, MAPS는 살모넬라 타이피무리움에서 수행되었으며 SraL sRNA가 로mRNA에 결합되어 전사 종료 인자(25)를 코딩한다고 밝혔다. 이 페어링을 통해 SraL은 Rho 자체에 의해 유발되는 조기 전사 종료로부터 rho mRNA를 보호합니다. 흥미롭게도, 이러한 기술은 sRNA에 국한되지 않으며 tRNA 유래단편(26)과 mRNA22(표 1)의번역되지 않은 영역의 사용에 의해 예시된 바와 같이 모든 유형의 세포 RNA에 적용될 수 있다.
MAPS 방법은 또한 병원성 그람 양성 박테리아 S. 아우레우스19에적응되었다. 구체적으로, 용해 프로토콜은 그람 음성 박테리아보다 두꺼운 세포벽으로 세포를 효율적으로 분해하고 RNA 무결성을 유지하기 위해 널리 변형되었다. 이 적응 된 프로토콜은 이미 RsaA27,RsaI28 및 RsaC29의상호 작용을 해명했다. 이 접근은 세포 표면 속성, 포도당 섭취 및 산화 스트레스 반응의 규제 메커니즘에서 이러한 sRNAs의 중요한 역할에 대한 통찰력을 제공했습니다.
2015년 대장균에서 개발 및 구현된 프로토콜은 최근30개세부 사항으로 설명되어 있다. 여기서, 당사는 변형된 MAPS 프로토콜을 제공하며, 이는 비병원성 또는 병원성(안전 예방 조치)이 아닌 그람 양성(두꺼운 세포벽) 박테리아에서 sRNA 규제 네트워크를 연구하는 데 특히 적합합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:834px;" width="834">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:187px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.690.001</td>
			<td style="width:247px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">15 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:187px;">Starstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">2100 Bioanalyzer Instrument</td>
			<td style="width:187px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">G2939BA</td>
			<td>RNA quantity and quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">250 mL culture flask</td>
			<td style="width:187px;">Dominique Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">2515074</td>
			<td>Bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">50 mL centrifuge tubes</td>
			<td style="width:187px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352051</td>
			<td>Culture centrifugation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Absolute ethanol</td>
			<td style="width:187px;">VWR Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">20821.321</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Allegra X-12R Centrifuge</td>
			<td style="width:187px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bacterial pelleting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Ampicilin (amp)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A9518-5G</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Amylose resin</td>
			<td style="width:187px;">New England BioLabs</td>
			<td style="width:119px;">E8021S</td>
			<td>MS2-affinity purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Anti-dioxigenin AP Fab fragment</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11093274910</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Autoradiography cassette</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">50-212-726</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">BamHI</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0051</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">BHI (Brain Heart Infusion) Broth</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">53286</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Blocking reagent</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11096176001</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">CDP-Star</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11759051001</td>
			<td>Northern blot assays (substrate)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Centrifuge 5415 R</td>
			<td style="width:187px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Chloroform</td>
			<td style="width:187px;">Dominique Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">508320-CER</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">DIG-RNA labelling mix</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">11277073910</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">DNase I</td>
			<td style="width:187px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">4716728001</td>
			<td>DNase treatment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Erythromycin (ery)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Fluka 45673</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastPrep device</td>
			<td style="width:187px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">116004500</td>
			<td>Mechanical lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidium Thiocyanate</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9277-250G</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Hybridization Hoven Hybrigene</td>
			<td style="width:187px;">Techne</td>
			<td style="width:119px;">FHB4DD</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Hybridization tubes</td>
			<td style="width:187px;">Techne</td>
			<td style="width:119px;">FHB16</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:187px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A/6960/08</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">LB (Lysogeny Broth)</td>
			<td style="width:187px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L3022</td>
			<td>Growth medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lysing Matrix B Bulk</td>
			<td style="width:187px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">6540-428</td>
			<td>Mechanical lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">MicroPulser Electroporator</td>
			<td style="width:187px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1652100</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Milli-Q water device</td>
			<td style="width:187px;">Millipore</td>
			<td style="width:119px;">Z00QSV0WW</td>
			<td>Ultrapure water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">NanoDrop spectrophotometer</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>RNA/DNA quantity and quality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Nitrocellulose membrane</td>
			<td style="width:187px;">Dominique Dutsher</td>
			<td style="width:119px;">10600002</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Phembact Neutre</td>
			<td style="width:187px;">PHEM Technologies</td>
			<td style="width:119px;">BAC03-5-11205</td>
			<td>Cleaning and decontamination</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Phenol</td>
			<td style="width:187px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:119px;">38.2</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:187px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">M0530</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">pMBP-MS2</td>
			<td style="width:187px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">65104</td>
			<td>MS2-MBP production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Poly-Prep chromatography column</td>
			<td>BioRad</td>
			<td style="width:119px;">7311550</td>
			<td>MS2-affinity purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PstI</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0615</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Qubit 3 Fluorometer</td>
			<td style="width:187px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15387293</td>
			<td>RNA quantity</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">RNAPro Solution</td>
			<td style="width:187px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">6055050</td>
			<td>Mechanical lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ScriptSeq Complete Kit</td>
			<td style="width:187px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">BB1224</td>
			<td>Preparation of cDNA librairies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Spectrophotometer Genesys 20</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11972278</td>
			<td>Bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">SpeedVac Savant vacuum device</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">DNA120</td>
			<td>RNA extraction and purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">Stratalinker UV Crosslinker 1800</td>
			<td style="width:187px;">Stratagene</td>
			<td style="width:119px;">400672</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:187px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EL0014</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">TBE (Tris-Borate-EDTA)</td>
			<td style="width:187px;">Euromedex</td>
			<td style="width:119px;">ET020-C</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">ThermalCycler T100</td>
			<td style="width:187px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1861096</td>
			<td>Plasmid construction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:187px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9416-100ML</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-ray film processor</td>
			<td style="width:187px;">hu.q</td>
			<td style="width:119px;">HQ-350XT</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:282px;">X-ray films Super RX-N</td>
			<td style="width:187px;">FujiFilm</td>
			<td style="width:119px;">4741019318</td>
			<td>Northern blot assays</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ms2-affinity purification coupled with rna sequencing in gram-positive bacteria

작은 규제 RNA (sRNA)는 삶의 세균 영역 중 널리 퍼져 있지만, 그들 중 많은 기능은 mRNA 목표를 식별하는 어려움으로 인해 특히 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다. 여기서, 우리는 생체 내특정 sRNA의 모든 RNA 파트너를 드러내는 것을 목표로 RNA 시퀀싱 (MAPS) 기술과 결합된 MS2-선호도 정화의 수정된 프로토콜을 기술했습니다. 광범위하게, MS2 aptamer는 관심의 sRNA의 5'극단에 융합됩니다. 이 구조는 MS2-sRNA가 세포 파트너와 상호 작용할 수 있도록 생체 내에서 발현됩니다. 세균 수확 후, 세포는 기계적으로 lysed. 조추출물은 이전에 말토스 결합 단백질에 융합된 MS2 단백질로 코팅된 아밀로오스 계 크로마토그래피 컬럼에 적재된다. 이를 통해 MS2-sRNA를 특정 캡처하고 RNA를 상호 작용할 수 있습니다. 용출 후, 조정된 RNA는 고처리량 RNA 시퀀싱 및 후속 생물정보 분석으로 확인된다. 다음 프로토콜은 그람 양성 인간 병원체 황색포도상구균에서 구현되었으며, 원칙적으로 모든 그램 양성 박테리아로 변형될 수 있습니다. 요약하자면 MAPS 기술은 특정 sRNA의 규제 네트워크를 깊이 탐구하는 효율적인 방법을 구성하여 전체 대상의 스냅샷을 제공합니다. 그러나 MAPS에서 식별된 대상은 여전히 상호 보완적인 실험 적 접근 방식으로 검증되어야 한다는 점을 명심해야 합니다.

대표적인 결과는 S. 아우레우스29에서RsaC 표적학의 연구에서 유래. RsaC는 비전통적인 1,116 nt-long sRNA입니다. 그것의 5' 끝은 그것의 3'끝 (544 nt)가 구조적으로 독립적이고 mRNA 표적으로 가진 모든 예측된 상호 작용 사이트를 포함하는 동안 몇몇 반복된 지역을 포함합니다. 이 sRNA의 발현은 망간(Mn)이 부족할 때 유도되며, 이는 종종 숙주 면역 반응의 맥락에서 발생합니다. MAPS ?...

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MS2-Affinity Purification Coupled with RNA Sequencing in Gram-Positive Bacteria

MAPS 기술은 생체 내에서 특정 조절 RNA의 표적을 면밀히 조사하기 위해 개발되었습니다. 관심의 sRNA는 RNA 의 RNA 파트너의 공동 정화및 RNA 시퀀싱에 의한 그들의 식별을 가능하게 하는 MS2 aptamer로 태그됩니다. 이 수정 된 프로토콜은 특히 그램 양성 박테리아에 적합합니다.

그람 양성 박테리아에서 RNA 염기서열분석과 결합된 MS2-선호도 정화

Although small regulatory RNAs (sRNAs) are widespread among the bacterial domain of life, the functions of many of them remain poorly characterized ...

RNA 염기서열 분석 또는 MAPS와 결합된 MS2-친화성 정제는 박테리아에 대한 관심의 모든 RNA의 전체 표적을 식별하기 위해 개발되었다. 이 기술을 통해 모든 종류의 sRNA 파트너를 규제 메커니즘과 독립적으로 식별할 수 있습니다. sRNA 의존적인 규제 네트워크의 특성화는 숙주 세포 내의 박테리아의 더 나은 독성 요인 생산, 생물막 형성 및 생존을 이해하고 궁극적으로 포도상 구균 감염에 맞서 싸우는 데 도움이 될 것입니다.이 프로토콜은 병원성 또는 비 병원성 그램 양성 박테리아에 적용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 파스칼 롬비 박사의 실험실에서 박사 과정 학생인 노미에 메르시에(Noemie Mercier)가 될 것입니다. 시작하려면, 중복마이크로리터 에리스로마이신 당 10 마이크로그램으로 보충 BHI 매체의 3 밀리리터에서 pCN51 P3 MS2 sRNA 또는 pCN51 P3 MS2 플라스미드를 운반하는 균주의 한 식민지를 성장.각 하룻밤 문화를 50 밀리리터의 신선한 BHI 배지로 희석하여 에리스로마이신으로 보충하여 OD 600에 도달합니다. 6시간 동안 180RPM에서 흔들리며 섭씨 37도에서 문화를 성장시다. 각 문화를 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 4도에서 15분 동안 2, 900회 G에서 원심분리기를 한 다음, 상류체를 폐기하고 동결및 보관하거나 얼음위에 펠릿을 보관하고 기계식 셀 용액을 직접 수행합니다.기계식 세포 리시스를 수행하기 위해 완충 A의 5 밀리리터에서 펠릿을 재차 판하고 3.5 그램의 실리카 구슬을 사용하여 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 재중단 된 세포를 전달합니다. 기계식 셀 리시스 기기에 튜브를 삽입하고 초당 4미터에서 40초의 사이클을 실행합니다. 15분 동안 2, 900회 G에서 튜브를 원심분리한 다음, 상체를 복구하고 얼음 위에 보관합니다.상체가 명확하지 않은 경우 원심 분리를 반복하여 명확해야 합니다. 컬럼 팁을 제거한 다음 크로마토그래피 컬럼을 열 랙에 넣고 초순수물로 컬럼을 세척합니다. 300 마이크로리터의 아밀로오스 수지와 10밀리리터의 완충 A.희석 1, 200개의 MBP-MS2 단백질로 열을 완충 A의 6밀리리터에 넣고 컬럼에 적재합니다.버퍼 A.Next의 10 밀리리터로 컬럼을 세척하고 MS2 선호도 정화를 수행합니다. 셀 용액을 컬럼에 로드하고 깨끗한 수집 튜브에서 흐름 관통 분수를 수집합니다. 버퍼 A의 10 밀리리터로 컬럼을 세 번 씻고 세척 분수를 수집한 다음 버퍼 E1 밀리리터로 컬럼을 길게 한 다음 2 밀리리터 마이크로튜브에서 용출 분수를 수집합니다.RNA 추출될 때까지 수집된 모든 분수를 얼음 위에 보관하십시오. RNA 추출에 각 분획의 1 밀리리터를 사용합니다. 1부피를 RNA에 넣고 격렬하게 섞은 다음, 16, 000회 G에서 20°C에서 10분간 혼합물을 원심분리합니다.상부를 깨끗한 2 밀리리터 마이크로튜브로 옮기. 클로로폼 이소아밀 알코올의 한 부피를 추가하고 원심 분리를 반복한 다음 상층을 새로운 튜브로 옮긴다. 2.5권의 100% 차가운 에탄올과 0.1부로 pH 5.2에서 아세테이트 3개소의 아세테이트를 넣고 밤새 섭씨 영하 20도까지 침전시한다.다음 날, 원심분리는 16, 000 배 G와 섭씨 4도에서 15 분 동안 튜브를 분리합니다. 펠릿을 방해하지 않도록 주의하여 파이펫으로 에탄올을 천천히 제거합니다. 5분 동안 80%의 차가운 에탄올과 원심분리기의 500마이크로리터를 추가합니다.에탄올을 천천히 피펫팅하여 버린 다음, 실행 모드에서 5분 동안 진공 농축기로 펠릿을 건조시십시오. 펠릿을 적절한 양의 초순수로 재보펜합니다. 이 프로토콜은 S.aureus에서 RsaC 표적을 연구하는 데 사용되었습니다.RsaC와 직접 상호 작용하는 몇몇 mRNAs는 MAPS 기술을 사용하여 확인되었습니다, 산화 스트레스 및 금속 관련 반응에 있는 중요한 역할을 드러냅니다. MS2 sRNA가 생성되고 그들의 발현 패턴을 시각화하기 위해, 세포는 BHI 배지에서 2시간, 4, 6시간 의 성장 후에 수확되었다. RNA를 추출하였고 북부 블롯 분석은 RsaC 특이적 DIG 프로브를 사용하여 수행되었다.내인성 RsaC의 수준은 성장의 6 시간 후에 현저하게 증가했습니다. 중요한 것은 MS2-RsaC 544 및 MS2-RsaC 1, 116의 수준은 6시간 만에 내인성 RsaC와 비교되었다. 선호도 정제는 MS2 태그를 단독으로 발현하는 야생형 스트레인에서 원유 추출물, 흐름-스루 및 용출 분획에서 추출되었으며 MS2-RsaC 544 구조를 발현하는 돌연변이 RsaC 균주.1, 116 뉴클레오티드 긴 내인성 RsaC는 용출 분획에서 농축되었지만 길이 및 복잡한 이차 구조로 인해 친화성 컬럼과 비특이적 상호 작용되었다. MS2-RsaC 544는 MS2-MBP 융합 단백질에 의해 성공적으로 유지되었다는 것을 보여주는 용출 분획에서 고도로 농축되었다. 생물정보 분석은 MS2 sRNA와 MS2 대조군 사이 접이식 변화에 따라 putative mRNA 표적을 제시했습니다, sodA가 첫번째 putative 표적이었다는 것을 나타내는.MS2 친화 정화 후 sodA 특이적 DIG 프로브를 수행한 북부 블롯 분석은 sodA가 MS2 제어에 비해 MS2-RsaC 544와 효율적으로 공동 농축되었다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜을 시도할 때 MS2 태그를 추가하면 sRNA 확인, 안정성 또는 기능에 영향을 줄 수 있습니다. 이를 주의 깊게 모니터링해야 합니다.MAPS는 sRNA-RNA 표적 페어링의 스냅샷을 제공합니다. 추가 실험 유효성 검사는 해당 기능을 해명합니다. 이 기술은 어떤 박테리아에 있는 sRNA 규제 네트워크를 구축하는 강력한 공구를 나타냅니다.

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Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil (Ers4tU)

Extremely Rapid and Specific Metabolic Labelling of RNA In Vivo with 4-Thiouracil Ers4tU

4-티우라실(Ers4tU)을 가진 생체내 RNA의 매우 신속하고 특정한 대사 라벨링

The nucleotide analogue, 4-thiouracil (4tU), is readily taken up by cells and incorporated into RNA as it is transcribed in vivo, allowing isolation of ...

Rapid and Cost-Effective RNA Extraction of Rat Pancreatic Tissue

쥐 췌장 조직의 신속하고 비용 효율적인 RNA 추출

Regardless of the extraction method, optimized RNA extraction of tissues and cell lines are carried out in four stages: 1) homogenization, 2) effective ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

박테리아의 RIBO-seq: NGS 시퀀싱을 위한 샘플 수집 및 라이브러리 준비 프로토콜

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...