Name: isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells
Uploaded: 2021-05-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells at JoVE.com

Forfatterne takker Curtis Vande Stouwe for teknisk assistanse. Forskningen som ligger til grunn for utviklingen av protokollene ble støttet av tilskudd fra National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 og 1F31AA028459-01).

Alle oppnådde vev og prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Louisiana State University Health Sciences Center og ble utført i samsvar med retningslinjene fra National Institute of Health (NIH-publikasjon nr. 85-12, revidert 1996).
1. Fremstilling av buffere og løsninger
<ol><li>Klargjør steril 5-fosfatbufret saltvannsvaskebuffer (5-PBS) løsning ved å tilsette 5% penicillin / streptomycin (penn / strep) og 0,25 μg / ml sopphemmer til 1x PBS. Klargjø...

<ol>
	<li>Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+interleukins+and+other+inflammatory+cytokines+by+human+adipose+tissue+is+enhanced+in+obesity+and+primarily+due+to+the+nonfat+cells.">Release of interleukins and other inflammatory cytokines by human adipose tissue is enhanced in obesity and primarily due to the nonfat cells.</a> Vitamins and Hormones. 74, 443-477 (2006).</li><li>Ibrahim, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+and+visceral+adipose+tissue:+structural+and+functional+differences.">Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences.</a> Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).</li><li>Wang, P., Mariman, E., Renes, J., Keijer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secretory+function+of+adipocytes+in+the+physiology+of+white+adipose+tissue.">The secretory function of adipocytes in the physiology of white adipose tissue.</a> Journal of Cellular Physiology. 216 (1), 3-13 (2008).</li><li>Zuk, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+adipose+tissue+is+a+source+of+multipotent+stem+cells.">Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).</li><li>Via, A. G., Frizziero, A., Oliva, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+mesenchymal+Stem+Cells+from+different+sources.">Biological properties of mesenchymal Stem Cells from different sources.</a> Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 2 (3), 154-162 (2012).</li><li>Horwitz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarification+of+the+nomenclature+for+MSC:+The+International+Society+for+Cellular+Therapy+position+statement.">Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement.</a> Cytotherapy. 7 (5), 393-395 (2005).</li><li>Zuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells+in+tissue+regeneration:+A+Review.">Adipose-derived stem cells in tissue regeneration: A Review.</a> International Scholarly Research Notices Stem Cells. 2013, 713959 (2013).</li><li>Smith, U., Kahn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+regulates+insulin+sensitivity:+role+of+adipogenesis,+de+novo+lipogenesis+and+novel+lipids.">Adipose tissue regulates insulin sensitivity: role of adipogenesis, de novo lipogenesis and novel lipids.</a> Journal of Internal Medicine. 280 (5), 465-475 (2016).</li><li>Laclaustra, M., Corella, D., Ordovas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+syndrome+pathophysiology:+the+role+of+adipose+tissue.">Metabolic syndrome pathophysiology: the role of adipose tissue.</a> Nutrition, Metabolism &amp; Cardiovascular Disease. 17 (2), 125-139 (2007).</li><li>Grundy, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+and+metabolic+syndrome:+too+much,+too+little+or+neither.">Adipose tissue and metabolic syndrome: too much, too little or neither.</a> European Journal of Clinical Investigation. 45 (11), 1209-1217 (2015).</li><li>Neeland, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysfunctional+adiposity+and+the+risk+of+prediabetes+and+type+2+diabetes+in+obese+adults.">Dysfunctional adiposity and the risk of prediabetes and type 2 diabetes in obese adults.</a> Journal of the American Medical Association. 308 (11), 1150-1159 (2012).</li><li>Kahn, C. R., Wang, G., Lee, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+adipose+tissue+and+adipocyte+function+in+the+pathogenesis+of+metabolic+syndrome.">Altered adipose tissue and adipocyte function in the pathogenesis of metabolic syndrome.</a> Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 3990-4000 (2019).</li><li>Sarjeant, K., Stephens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipogenesis.">Adipogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (9), 008417 (2012).</li><li>Ford, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+chronic+binge+alcohol+and+antiretroviral+therapy+to+metabolic+dysregulation+in+SIV-infected+male+macaques.">Differential contribution of chronic binge alcohol and antiretroviral therapy to metabolic dysregulation in SIV-infected male macaques.</a> American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 315 (5), 892-903 (2018).</li><li>Gagliardi, C., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rhesus+adipose-derived+stem+cells.">Isolation and culture of rhesus adipose-derived stem cells.</a> Methods in Molecular Biology. 702, 3-16 (2011).</li><li>Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+isolation,+expansion+and+differentiation.">Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation.</a> Methods. 45 (2), 115-120 (2008).</li><li>Bourin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+cells+from+the+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+and+culture+expanded+adipose+tissue-derived+stromal/stem+cells:+a+joint+statement+of+the+International+Federation+for+Adipose+Therapeutics+and+Science+(IFATS)+and+the+International+Society+for+Cellular+Therapy+(ISCT).">Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT).</a> Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).</li><li>Wang, Q. A., Scherer, P. E., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+methodologies+for+the+study+of+adipose+biology:+insights+gained+and+opportunities+ahead.">Improved methodologies for the study of adipose biology: insights gained and opportunities ahead.</a> Journal of Lipid Research. 55 (4), 605-624 (2014).</li></ol>

ADSC-isolasjons-, sprednings- og differensieringsprotokoller er rett frem og reproduserbare, men de krever nøye teknikk for å sikre tilstrekkelig isolasjon, sunn ekspansjon og effektiv differensiering. Et sterilt arbeidsmiljø er kritisk for alle cellekultureksperimenter. Bakterier eller sopp kan bli introdusert i cellekulturer gjennom forurensede verktøy, media eller arbeidsmiljø. Svampkontaminering indikeres av sporevekst i kulturen, mens bakteriell forurensning indikeres av tilstedeværelsen av turbiditet i media....

Fettvev består av en heterogen blanding av celler, hovedsakelig modne adipocytter og en stromal vaskulær fraksjon inkludert fibroblaster, immunceller og fettavledede stamceller (ADSC)1,2,3. Primære ADSC-er kan isoleres direkte fra hvitt fettvev og stimuleres til å differensiere til adipocytter, brusk eller beinceller4. ADSC-er utviser klassiske stamcelleegenskaper som vedlikehold av multipotens in vitro og selvfornyelse; og er tilhenger av plast i kultur 5,6. ADSC er av viktig interesse for bruk i regenerativ medisin på grunn av deres multipotens og evne til lett å høstes i store mengder ved hjelp av ikke-invasive teknikker7. Adipogen differensiering av ADSC produserer celler som funksjonelt etterligner modne adipocytter, inkludert lipidakkumulering, insulinstimulert glukoseopptak, lipolyse og adipokinsekresjon8. Deres likhet med modne adipocytter har ført til utbredt bruk av ADSC for fysiologisk undersøkelse av cellulære egenskaper og metabolsk funksjon av adipocytter. Det er økende bevis som støtter ideen om at utviklingen av metabolsk dysfunksjon og lidelser stammer fra celle- eller vevsnivå 9,10,11,12. Optimal ADSC-differensiering er nødvendig for tilstrekkelig fettvevsutvidelse, riktig adipocyttfunksjon og effektiv metabolsk regulering13.
Protokoller beskrevet i dette manuskriptet er enkle teknikker som benytter standard laboratorieutstyr og grunnleggende reagenser. Manuskriptet beskriver først protokollen for isolering av primære ADSC-er fra ferskt fettvev ved bruk av mekanisk og enzymatisk fordøyelse. Deretter beskrives protokollen for spredning og passasjering av ADSC-er i stromalt medium. Til slutt beskrives protokollen for adipogen differensiering av ADSC. Etter differensiering kan disse cellene brukes til studier for bedre å forstå adipocytmetabolisme og mekanismer for dysfunksjon. Protokollene for bekreftelse av adipogen differensiering og påvisning av lipiddråper ved bruk av oljerød O og bor-dipyrrometen (BODIPY) farging er også beskrevet. Detaljene i disse protokollene fokuserte på primære ADSC-er isolert fra ferskt omentalt fettvev av rhesusmakaker. Vi og andre har brukt denne protokollen til å isolere ADSC-er fra rhesus macaque subkutane og omentale fettvevdepoter14,15. For samme mengde vev som brukes, har vi observert at subkutant fettvev er tettere, tøffere og gir mindre celler fra fordøyelsen sammenlignet med omentalt fettvev. Denne protokollen har også blitt brukt til å isolere ADSC-er fra humane fettprøver16.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4 % trypan blue</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5-ml microcentrifuge tube</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>707-FTG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 % isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1838-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm cell culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-mL plastic conical tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-465-232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70-&#181;m cell strainer</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a-MEM</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>12561056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td>Reynolds Wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>D3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type I</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone-Water Soluble</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide, DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15230162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, USDA-approved</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer with cover slip</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indomethacin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted light microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>DIAPHOT-TMD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz</td>
			<td>Reliable Scientific</td>
			<td>Model 55 Rocking</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral buffered formalin (10 %)</td>
			<td>Pharmco</td>
			<td>8BUFF-FORM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformeldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cell (RBC) lysis buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>158904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipettes, 2 to 25 mL</td>
			<td>Costar Stripettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard humidified cell culture incubator, 37 &#176;C, 5 % CO2</td>
			<td>Sanyo</td>
			<td>MCO-17AIC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells

Fettvev gir en rik og tilgjengelig kilde til multipotente stamceller, som er i stand til å fornye seg selv. Disse fettavledede stamcellene (ADSC) gir et konsistent ex vivo cellulært system som er funksjonelt som for in vivo adipocytter. Bruk av ADSC-er i biomedisinsk forskning muliggjør cellulær undersøkelse av fettvevets metabolske regulering og funksjon. ADSC-differensiering er nødvendig for adekvat adipocyttekspansjon, og suboptimal differensiering er en viktig mekanisme for fettdysfunksjon. Å forstå endringer i ADSC-differensiering er avgjørende for å forstå utviklingen av metabolsk dysfunksjon og sykdom. Protokollene beskrevet i dette manuskriptet, når de følges, vil gi modne adipocytter som kan brukes til flere in vitro funksjonstester for å vurdere ADSC metabolsk funksjon, inkludert men ikke begrenset til analyser som måler glukoseopptak, lipolyse, lipogenese og sekresjon. Rhesus macaques (Macaca mulatta) er fysiologisk, anatomisk og evolusjonært lik mennesker, og som sådan har deres vev og celler blitt brukt mye i biomedisinsk forskning og for utvikling av behandlinger. Her beskriver vi ADSC-isolering ved bruk av ferskt subkutant og omentalt fettvev fra 4–9 år gamle rhesusmakaker. Fettvevsprøver fordøyes enzymatisk i kollagenase etterfulgt av filtrering og sentrifugering for å isolere ADSC fra stromal vaskulær fraksjon. Isolerte ADSC-er prolifereres i stromale medier etterfulgt av ca. 14–21 dagers differensiering ved bruk av en cocktail på 0,5 μg/ml deksametason, 0,5 mM isobutylmetylxanthin og 50 μM indometacin i stromale medier. Eldre adipocytter observeres ved ca. 14 dagers differensiering. I dette manuskriptet beskriver vi protokoller for ADSC-isolering, proliferasjon og differensiering in vitro. Selv om vi har fokusert på ADSC-er fra rhesus macaque fettvev, kan disse protokollene brukes til fettvev hentet fra andre dyr med minimale justeringer.

ADSC-ene isolert fra rhesus macaque fettvevsprøver ble sådd på dyrkningsplater og er vist i figur 1. På pletteringsdagen er cellene ikke-klebende og flyter i kulturskålen som vist i figur 1A. Innen 72 timer vil ADSC-er bli 80% sammenflytende og er klare for adipocytdifferensiering (figur 1B). ADSC-er utviser sterke adipogene egenskaper etter kjemisk induksjon. Etter 14 dagers differensiering kan modne adipocytter observeres via...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells (Video) | JoVE

I denne artikkelen beskriver vi isolering av rhesus macaque derived adipose-derived stem cells (ADSCs) ved hjelp av en enzymatisk vevsfordøyelsesprotokoll. Deretter beskriver vi ADSC-spredning som inkluderer celleløsning, telling og plating. Til slutt beskrives ADSC-differensiering ved bruk av spesifikke adipogene induserende midler. I tillegg beskriver vi fargeteknikker for å bekrefte differensiering.

Isolering, proliferasjon og differensiering av Rhesus Macaque fettavledede stamceller

Adipose tissue provides a rich and accessible source of multipotent stem cells, which are able to self-renew. These adipose-derived stem cells (ADSCs) ...

Fettavledet stamcelleisolasjon og spredning produserer et stort antall stamceller som kan brukes til flere nedstrøms applikasjoner og eksperimentelle teknikker. En viktig tiltenkt bruk for differensierte adipocytter i denne protokollen er metabolske analyser som insulinstimulert glukoseopptak, lipogenese og stimulert lipolyse. For å begynne, skape et sterilt arbeidsmiljø ved å desinfisere biosikkerhetshetten og alle verktøyene.Pipette ca 10 milliliter av fem PBS buffer i fire 100 millimeter cellekultur retter. Overfør en 50 gram fettprøve i en av oppvasken og vask den fire ganger ved å overføre den sekvensielt over de andre rettene som inneholder fem PBS. Overfør deretter det vaskede fettvevet til en ren 100 millimeter kulturskål og hakk den grundig med saks eller steril tang.Overfør en en til tre centimeter seksjon av hakket vev til et 50 milliliter konisk rør som inneholder 13 milliliter kollagenasebuffer. Skyll det gjenværende vevet fra kulturskålen med to milliliter kollagenasebuffer for å sikre et totalt volum på 15 milliliter. Bland prøven grundig ved hjelp av en 25 milliliter serologisk pipette og inkuber røret ved 37 grader Celsius på en rocker i 30 til 60 minutter.For å nøytralisere enzymaktiviteten, tilsett 10 milliliter ADSC-vekstmedium i røret etter inkubering og bland det godt med en pipette for å skille eventuelle vevsaggregater. Overfør væskedelen til et nytt sterilt 50 milliliter konisk rør, og la det faste vevet være. Vask vevet tre ganger med syv milliliter av to PBS og overfør væsken til det nye røret.Sentrifuger deretter røret ved 500 ganger G i fem minutter og fjern forsiktig så mye supernatant som mulig uten å forstyrre pelleten. Resuspend pelleten i en milliliter 1X røde blodlegemer eller RBC lysis buffer og inkuber den ved romtemperatur i 10 minutter. Vask deretter cellene to ganger ved å legge til fem milliliter ADSC-vekstmedium til røret og sentrifugering for å fjerne supernatanten.Etter den siste vasken, resuspend pelleten i to milliliter ADSC-vekstmedium og filtrer den gjennom en 70 mikron cellesil i et sterilt 50 milliliter konisk rør. Skyll silen med ytterligere to milliliter av mediet og overfør fire milliliter av suspensjonen til en steril 100 milliliter kulturskål. Skyll det koniske røret to ganger med tre milliliter medium for å samle et totalt volum på 10 milliliter i kulturskålen.Observer de innsamlede cellene under et omvendt mikroskop ved 10X forstørrelse for å se etter flytende celler. Inkuber cellene i 24 timer i en karbondioksidinkubator ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid og 100% relativ fuktighet. For å sikre sterilitet av kulturmediene, ta med en plate med media alene.Etter 24 timer, se cellene under det omvendte mikroskopet for å se etter celleoverholdelse. Fjern og erstatt mediet med varmt medium hver 48. time til cellene er 80 til 90% sammenflytende. For spredning, fjern vekstmediet fra de sammenflytende ADSC-cellene og vask dem to ganger med to milliliter steril romtemperatur PBS.Aspirer PBS og tilsett to milliliter 0,25% trypsin EDTA i hver kulturplate, som dekker hele overflaten av platen. Inkuber platen i syv minutter ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, og fjern deretter de trypsiniserte cellene mekanisk ved kraftig pipettering. Tilsett to milliliter ADSC-vekstmedium og bland cellene forsiktig.Overfør cellene til et 50 milliliter konisk rør, skyll parabolen med ytterligere to milliliter medium for å sikre maksimal celleutvinning fra platen. Sentrifuger deretter røret ved 500 ganger G i fem minutter ved romtemperatur og dekanterer supernatanten for å oppnå cellepelleten. Resuspend cellepelleten i fem til seks milliliter ADSC-vekstmedium per million celler.Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og plate dem som beskrevet i tekstmanuskriptet. Når cellene når 80 til 90% sammenheng, aspirerer vekstmediet og skyll cellene med steril romtemperatur PBS, og tilsett deretter 10 milliliter ADSC-differensieringsmedium. Bytt medium hver tredje dag i omtrent 14 til 21 dager.Vær oppmerksom på cellene for tilstedeværelse av lipiddråper under det inverterte mikroskopet ved 40X forstørrelse. Eldre adipocytter observeres vanligvis etter 14 dager. På platingdagen var ADSC-ene ikke-tilhenger og fløt i kultur.Cellene ble 80% sammenflytende etter 72 timer og var klare for adipocytdifferensiering. Etter 14 dager med ADSC-differensiering viste modne adipocytter sterke adipogene egenskaper som ble observert under 40X forstørrelse. På dag 14 ble cellene farget og fikset med oljerød O og BODIPY for lipiddråpevisualisering.Differensierte adipocytter kunne observeres under 20X forstørrelse. Når du prøver denne protokollen, er det viktig å huske at et sterilt arbeidsmiljø er avgjørende for sunn isolasjon, tilstrekkelig utvidelse og effektiv differensiering av fettavledede stamceller. Etter denne prosedyren kan disse cellene brukes til flere metabolske analyser som glukoseopptak, lipogenese og lipolyse som er et hovedfokus for vår forskning.Denne teknikken gjør det mulig å undersøke hvordan kronisk alkohol og SIV påvirker adipocytt metabolsk kapasitet.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation, Proliferation and Differentiation of Rhesus Macaque Adipose-Derived Stem Cells

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs (Video) | JoVE

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells (Video) | JoVE

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors (Video) | JoVE

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells (Video) | JoVE

Isolasjon og differensiering av stromale Vaskulær Cells til beige / Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition (Video) | JoVE

Induksjon og analyse av Epiteliale til Mesenchymale Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro (Video) | JoVE

Differensiering av nyfødte mus Skin Avledet stamceller inn Germ-lignende celler<em&gt; In vitro</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates (Video) | JoVE

Manuell Isolering av adipose-avledet stamceller fra menneske Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells

Isolation, Culture, and Transplantation of Muscle Satellite Cells (Video) | JoVE

Isolasjon, Kultur, og Transplantasjon av Muscle satellitt celler

Muscle satellite cells are a stem cell population required for postnatal skeletal muscle development and regeneration, accounting for 2-5% of sublaminal ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart (Video) | JoVE

Isolering og karakterisering differensiering av Cardiac stamceller fra voksen mus hjertet

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolering og identifisering av mesenkymale stamceller avledet fra fettvev av Sprague Dawley-rotter

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...