Name: generation of dynamical environmental conditions using a high-throughput microfluidic device
Uploaded: 2021-04-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device at JoVE.com

Forfattere anerkender den tekniske støtte fra Zhifeng Cheng af Chansn Instrument (Kina) LTD. Dette arbejde blev støttet af tilskud (National Natural Science Foundation of China,51927804).

1. Design af mikrofluidiske chips
<ol><li>Design den mikrofluidiske multiplexer bestående af 18 indløb, som hver især styres af en individuel ventil og en peristaltisk pumpe. For at øge væskevolumen drevet af per pumpecyklus, har peristaltic pumpen bestå af 3 kontrolkanaler, som med vilje blev udvidet til 200 μm, og 10 tilsluttede flow linjer.</li>
	<li>Design det forskydningsfri kulturkammer. Replikationen af 2-niveaus kulturenheden består af et lavere cellekulturkammer (400 μm x 400 μm x 150 μm) og et høj...

<ol>
	<li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+platform+for+quantitative+high-throughput+screening.">A robotic platform for quantitative high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).</li><li>Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+automation+using+elastomeric+valves+and+droplets:+reducing+reliance+on+external+controllers.">Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers.</a> Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).</li><li>Melin, J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration:+the+evolution+of+design+rules+for+biological+automation.">Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).</li><li>Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-assisted+in+vitro+drug+screening+and+carrier+production.">Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).</li><li>Junkin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+quantification+of+single-cell+immune+dynamics.">High-content quantification of single-cell immune dynamics.</a> Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).</li><li>Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells:+origin,+heterogeneity+and+regulation+in+the+adult+mammalian+brain.">Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain.</a> Development. 146 (4), (2019).</li><li>Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+neural+stem+cells+by+bHLH+factors.">Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors.</a> Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-multiplexed+analysis+of+single-cell+dynamics+reveals+logic+rules+in+differentiation.">Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li><li>Quake, S. R., Scherer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+micro-to+nanofabrication+with+soft+materials.">From micro-to nanofabrication with soft materials.</a> Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).</li><li>Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surface+micromachining+technologies+for+microfluidics+and+BioMEMS.">Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS.</a> Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).</li><li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+reprograms+resident+astrocytes+into+neural+progenitors+in+the+adult+brain.">SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).</li><li>Sarkar, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+differentiated+&#946;-endorphin+neurons+promote+immune+function+and+prevent+prostate+cancer+growth.">Cyclic adenosine monophosphate differentiated &#946;-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).</li><li>Watanabe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-induced+differentiation+of+embryonic+neural+stem+cells+into+astrocytes+is+mediated+via+the+&#946;+isoform+of+protein+kinase.">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the &#946; isoform of protein kinase.</a> C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).</li><li>Watanabe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+PACAP-induced+differentiation+of+neural+stem+cells+into+astrocytes.">Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li><li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+docking+inside+microwells+within+reversibly+sealed+microfluidic+channels+for+fabricating+multiphenotype+cell+arrays.">Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays.</a> Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).</li><li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+microfluidic+devices+fabricated+in+layered+paper+and+tape.">Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+analysis+on+a+droplet-in-oil+PCR+array.">DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array.</a> Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).</li><li>Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+microwell+device+for+immunomagnetic+single-cell+trapping.">A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).</li><li>Galler, K., Br&#228;utigam, K., Gro&#223;e, C., Popp, J., Neugebauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+big+thing+of+a+small+cell-recent+advances+in+single+cell+analysis.">Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis.</a> Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).</li><li>Gr&#252;nberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microfluidics:+opportunity+for+bioprocess+development.">Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development.</a> Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).</li><li>Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comet+assay+for+testing+genotoxicity+of+chemicals.">In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals.</a> Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).</li><li>Bai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+water+collection+on+integrative+bioinspired+surfaces+with+star-shaped+wettability+patterns.">Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns.</a> Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).</li><li>Zhao, J., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+or+against+topographic+wettability+gradient:+movements+of+droplets+on+a+micropatterned+surface.">Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface.</a> Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).</li><li>Theberge, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+combinatorial+synthesis+in+picolitre+droplets.">Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+ceramic+microspheres+by+diffusion-induced+sol-gel+reaction+in+double+emulsions.">Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).</li><li>Moerman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+in+nanoliter+wells+by+prefilling+of+wells+using+electrospray+deposition+followed+by+sample+introduction+with+a+coverslip+method.">Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method.</a> Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).</li><li>Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+dispensing+method+by+degassed+poly+(dimethylsiloxane)+microchannels+and+its+application+in+protein+crystallization.">Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization.</a> Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).</li></ol>

Forskellige mikrofluidiske enheder er udviklet til at udføre multiplekserede og komplekse eksperimenter17,18,19,20. For eksempel kan mikrowells lavet af en række topologiske fordybninger fange individuelle celler uden brug af ekstern kraft, der viser fordelagtige tegn, herunder lille prøvestørrelse, parallelisering, lavere materialeomkostninger, hurtigere respons, høj følsomhed<sup class=...

Høj gennemløbsteknikker er afgørende for biomedicinske og kliniske undersøgelser. Ved parallelt at gennemføre millioner af kemiske, genetiske eller levende celle- og organoidtests kan forskere hurtigt identificere gener, der modulerer en biomolekylær vej, og tilpasse sekventiel lægemiddelinput til ens specifikke behov. Robotteknologi1 og mikrofluidiske chips i kombination med et enhedskontrolprogram gør det muligt at automatisere komplekse eksperimentelle procedurer, der dækker celle-/vævsmanipulation, væskehåndtering, billeddannelse og databehandling/kontrol2,3. Derfor kan hundreder og tusinder af eksperimentelle forhold opretholdes på en enkelt chip i henhold til den ønskedeoverførselshastighed 4,5. 
I denne protokol beskrev vi design- og fabrikationsproceduren for en mikrofluidisk enhed, der består af 1500 kulturenheder, en række forbedrede peristaltiske pumper og blandingsmodulus på stedet. 2-niveaus cellekulturkammeret forhindrer unødvendig forskydning under medium udveksling, hvilket sikrer et uforstyrret kulturmiljø til langsigtet levende cellebilleddannelse. Undersøgelserne viser, at den foreslåede mikrofluidiske enhed er en egnet platform til undersøgelser af høj gennemstrømning af de komplekse livsmaskiner. Desuden giver de avancerede træk ved den mikrofluidiske chip mulighed for automatiseret rekonstituering af meget komplekse og dynamiske mikromiljøforhold in vivo, som de stadigt skiftende cytokiner og ligands sammensætninger6,7, hvis færdiggørelse tager måneder for konventionelle platforme som 96-brønds plade.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2713 Loker Avenue West</td>
			<td>Torrey pines scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ-50X</td>
			<td>AZ Electronic Materials, Luxembourg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator HP151</td>
			<td>Heal Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14</td>
			<td>Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g</td>
			<td>Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronection 0.25 mg/mL</td>
			<td>Millipore, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Incubator BGG-9240A</td>
			<td>Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Model Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner PDC-002</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane(PDMS)</td>
			<td>Momentive</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylysine 0.01%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater ARE-310</td>
			<td>Awatori Rentaro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater TDZ5-WS</td>
			<td>Cence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater WH-SC-01</td>
			<td>Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025</td>
			<td>MicroChem, Westborough, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3075</td>
			<td>MicroChem, Westborough, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of dynamical environmental conditions using a high-throughput microfluidic device

Efterligning in vivo miljøforhold er afgørende for in vitro undersøgelser af komplekse liv maskiner. Men de nuværende teknikker rettet mod levende celler og organer er enten meget dyre, som robotteknologi, eller mangler nanoliter volumen og millisekund tid nøjagtighed i flydende manipulation. Vi præsenterer herved design og fremstilling af et mikrofluidisk system, der består af 1.500 kulturenheder, en række forbedrede peristaltiske pumper og en blandingsmodulus på stedet. For at demonstrere kapaciteten af den mikrofluidiske enhed opretholdes neurale stamcellesfærer (NSC) i det foreslåede system. Vi bemærkede, at når NSC-kuglen udsættes for CXCL i dag 1 og EGF i dag 2, er den runde kropsbygning godt vedligeholdt. Variation i inputrækkefølgen af 6 lægemidler forårsager morfologiske ændringer i NSC-sfæren og udtryksniveauets repræsentative markør for NSC-stængel (dvs. Hes5 og Dcx). Disse resultater tyder på, at dynamiske og komplekse miljøforhold har stor indvirkning på NSC differentiering og selvfornyelse, og den foreslåede mikrofluidiske enhed er en passende platform for høj gennemstrømning undersøgelser af den komplekse levetid maskiner.

Den konventionelle on-chip peristaltic pumpe blev først beskrevet af Stephen Quake i 2000, hvorved peristalsis blev aktiveret af mønsteret 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. Tallet 0 og 1 angiver "åben" og "tæt" på de 3 vandrette styrelinjer. Undersøgelser med mere end 3 ventiler (f.eks. fem) er også blevet rapporteret11. Selvom den peristaltiske pumpe, der består af 3 kontrollinjer og 3 flowlinjer, giver nanoliternøjagtighed, er ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device at JoVE.com

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Vi præsenterer et mikrofluidisk system til undersøgelser af komplekse livsmaskiner, som består af 1500 kulturenheder, en række forbedrede peristaltiske pumper og en blandingsmodulus på stedet. Den mikrofluidiske chip giver mulighed for analyse af de meget komplekse og dynamiske mikromiljøforhold in vivo.

Generering af dynamiske miljøforhold ved hjælp af en mikrofluidisk højoverførselsenhed

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Mikromiljø muliggør en meget kompleks og dynamisk, herunder stadigt skiftende cytokiner, ligands koncentration og sammensætning. At skabe et lignende kulturmiljø er afgørende for in vitro-undersøgelser af komplekse livsmaskiner såsom stamcelledifferentiering, immunrespons og udvikling af organer på chipplatforme. Men at generere og levere kemiske signaler af nanoliter volumen og millisekunder nøjagtighed er svært ved hjælp af konventionelle biomedicinske tilgange som pipetter.For at imødekomme udfordringerne er en kulturplatform, der er i stand til alternativ generering af billederhvervelse af dynamiske kombinatoriske og sekventielle signalindgange, på høj efterspørgsel. I denne protokol præsenteres design- og fabrikationsproceduren for en mikrofluidisk enhed. Den foreslåede mikrofluidiske chip består af 1500 kulturenheder, en række forbedrede peristaltiske pumper og blandingsmodulus på stedet.Vi viser, at platformen er egnet til undersøgelser af enkeltceller todimensionelle cellepopulationer og tredimensionelle neurale sfærer. De komplekse og dynamiske miljøforhold på chip har stor effekt på neural stamcelledifferentiering og selvfornyelse. Detaljerne i design- og fremstillingsprocedurerne er som følger.Chipdesign blev udført ved hjælp af AutoCAD-software. For at passe til pladeholderens størrelse på mikroskopet er den mikrofluidiske chip ca. syv og fem centimeter i størrelse Og består af 1.500 kulturkamre. En af de vigtige funktioner er det har peristaltic pumpe, som består af otte flow kanaler og 200 mikrometer brede kontrolkanaler.Stigningen i overlappende område mellem kontrol og flow kanal stige 16 gange i forhold til den peristaltiske pumpe, foreslået af Stephen Quake i 2002, til omkring 15 nanoliter væske og pr pumpecyklus og tilstrækkeligt behov for at opretholde 1.500 uafhængige miljøforhold parallelt på chip. En anden vigtig del af enheden er et tolags kulturkammer, som kan opretholde forskydningsfrit kulturmiljø. Den uønskede forskydningsbelastning forhindres ved at lede den hurtigt gennem det øverste lag.Cellerne, vævene og det afgørende betingede medium forbliver uberørte i det nederste lag. Numerisk simulering tyder på, at når væskerne ledes gennem kulturkamre, fra venstre mod højre. forskydningskræfterne kan effektivt forhindres.Selv ved en inputstrømshastighed på 10 millimeter i sekundet forbliver celle- eller mikrometerstørrelse væv uforstyrret i bunden af kulturenheden. Vi fremstillede replika støbning eller silicium wafer ved hjælp af UV litografi. De flydende kanaler på 25 mikrometer i højden og 100 mikrometer i vægt produceres ved hjælp af SU-8 3025 negativ fotoresist.Kulturkamrene på 75 mikrometer og 150 mikrometer i højden blev fremstillet ved hjælp af SU-8 3075 fotoresist. AZ50X positiv fotoresist bruges til de runde formede brøndfunktioner, der overlapper med kontrolkanalerne for at sikre en god forbindelse. For at producere den mikrofludiske chip blev de mønstrede og blanke siliciumskiver først behandlet med TMCS.Forskellige mængder PDMS 10 til 1 monomer til katalysatorforhold blev grundigt blandet og debubbled i en til to timer i vakuumkammeret ved minus 0,85 megapascal. Kontrollaget blev opnået ved spin coating PDMS ved 2.200 omdrejninger i minuttet. Siliciumskiverne blev derefter overført til inkubatoren og inkuberet i 60 minutter ved 80 centigrade.Forskellige lag blev justeret og bundet sammen ved hjælp af tilpassede optiske enhed og plasma ætsning maskine. Indløbshullerne blev derefter slået efter yderligere to timers termisk binding ved 80 centigrade. Chippen blev bundet til en PDMS-belagt dække slip, som er den samme størrelse af 96-brønd plade og hærdet i mindst 12 timer ved 80 centrigrade før brug.Til drift blev kontrolkanaler forbundet til miniature pneumatiske magnetventiler gennem plastrør. Drejningen af alle penumatiske brønde blev kontrolleret af et brugerdefineret MATLAB-program gennem den grafiske brugergrænseflade. Optimale lukketryk af push-up PDMS membranventiler blev bestemt individuelt for hver chip, som typisk varierer fra 25 til 30 PSI.Ved at dreje alle serier af brønde dynamisk kombinatoriske og sekventielle indgange kan genereres på chip. Cellerne blev høstet ved 80% sammenløb og genbruges med kultur medium DMEM ved en tæthed omkring 10 til den effekt seks pr milliliter, som derefter blev indlæst i chippen ved at presse cellen indeholder opløsning. For både vedhængende og suspensionskulturen af neurostamceller blev celler indsamlet, og kuglerne blev direkte indlæst i chippen.Til billederhvervelse blev der anvendt et omvendt mikroskop med en automatisk translationel fase og det digitale komplementære metaloxid-halvlederkamera. Scenen og billedet erhvervelse blev kontrolleret via softwaren viser øverste venstre hjørne og nederste højre hjørne kamre som valgpunkter og flytte translationelle fase til de punkter, velordnet at få den foreløbige billedbehandling med 4x objektiv linse. Skift 4x objektiv linse med 20x en og justere billeddannelse parametre, herunder lysintensitet, udsætte tid, osv.Find derefter udvælgelsespunkterne, så placeringen af hvert kammer, der forlader 13 af 15 kammermatrix eller skal defineres af programmet automatisk. Ved fastsættelsen af kamrenes koordinater flyttes oversættelsesfasen til hvert kammer, hvor X, Y, Z-brændplanet kan finjusteres. Angiv intervallet og varigheden af billedcyklussen.Gem stien, og start derefter billedbehandling. Dette system er tilgængeligt til forskellige måldynamiske sporing, såsom neurale stamceller differentiering i brightfield og fluorescensfeltet i processen med neurale stamceller sfæredannelse. Dataanalyse.Skift formatet i nd2 til Tif ved hjælp af det brugerdefinerede MATLAB-program. Og del dataene efter punkter. Vælg objekt, der skal analyseres, er celle eller væv.Angiv den tærskel, objektstørrelse og støjstørrelse, der skal analyseres. Eller du kan vælge trinvis analyse for at opnå optimale parametre. Og derefter analysere alle data.Når resultatet er gemt i MAT-format, skal du bruge plottet til at tegne resultaterne eller sporene. I dette papir beskrev vi protokollen for og kulturen i mikrofluidisk chipsystem med høj gennemløb baseret på fotolitografiteknologien til dynamisk styring af levende cellemikromiljø. Vi beskrev også nogle parametre, som man omhyggeligt bør kontrollere, såsom lukketrykket af PDMS-membranventiler og spinkontrol af væske parallelt med kammeret.I traditionel cellein vitro-kultur udføres behandlingen af cellekulturmiljø manuelt, hvilket er tidskrævende og besværligt, og væskefyldt er ikke let at standardisere kontrol. Især minutter af opløsning. Der er nogle problemer såsom generering af input, immunmedicinkoncentration og stort forbrug.Men ved hjælp af vores mikrofluidiske system er det muligt at gentage det som stimulator ved en fast dosis enkelt væske lige stor mængde ensartet koncentration, sammenligne forskellige kulturer i forskellige kulturkamre på samme tid. Anderledes med nogle miniature tidsmæssige opløsning tilbage stimulus og med subsetting opløsningen ved at regulere væsken. Derudover kan vores system opnå et stort antal komparative eksperimentelle resultater ved enkle operationer.Vores system er baseret på princippet om diffusion, skaber minimal mekanisk forstyrrelse af det cellulære mikromiljø. For mere stabile cellulære mikromiljøchips kan du øge listen over bufferlaget som dybden af kulturlaget eller reducere inputvæsken til medium udveksling, det vil sige reducere trykket, som vil være her for forskningen i celleadfærd. Det skal bemærkes, at denne undersøgelse kun har undersøgt kulturen i 3T3- og NSC-celler.For andre celler eller cellelinjer kan kulturbetingelserne sammenlignes med vores parametre for at justere det.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

En mikrofluid enhed for at studere flere forskellige stammer

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Lipiddobbeltlaget Vesikel Generation Brug Mikrofluid højtryksspuler

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protokol for Biofilm Streamer Dannelse i en mikrofluidindretning med Micro-søjler

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Anvendelse af et High-throughput<em&gt; In vitro</em&gt; Mikrofluidsystem at udvikle Oral Multi-arter biofilm

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Dobbelt Emulsion Generation Ved hjælp af en Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

En Mikrofluid platform for High-throughput Single-celle Isolering og Kultur

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

Mekanostimulering af flercellede organismer gennem et mikrofluidisk kompressionssystem med høj kapacitet

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...