Name: generation of dynamical environmental conditions using a high-throughput microfluidic device
Uploaded: 2021-04-17T13:00:00
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Les auteurs reconnaissent le soutien technique de Zhifeng Cheng de Chansn Instrument (China) LTD. Ces travaux ont été soutenus par des subventions (National Natural Science Foundation of China,51927804).

1. Conception de puces microfluidiques
<ol><li>Concevoir le multiplexeur microfluidique composé de 18 entrées, chacune d’entre elle est contrôlée par une valve individuelle et une pompe périssaltique. Pour augmenter le volume liquide entraîné par le cycle de pompage, que la pompe périssaliste soit composée de 3 canaux de commande, qui ont été délibérément élargis à 200 μm, et de 10 lignes d’écoulement connectées.</li>
	<li>Concevez la chambre de culture sans cisaillement. La réplication de l’u...

<ol>
	<li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+platform+for+quantitative+high-throughput+screening.">A robotic platform for quantitative high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).</li><li>Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+automation+using+elastomeric+valves+and+droplets:+reducing+reliance+on+external+controllers.">Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers.</a> Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).</li><li>Melin, J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration:+the+evolution+of+design+rules+for+biological+automation.">Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).</li><li>Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-assisted+in+vitro+drug+screening+and+carrier+production.">Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).</li><li>Junkin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+quantification+of+single-cell+immune+dynamics.">High-content quantification of single-cell immune dynamics.</a> Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).</li><li>Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells:+origin,+heterogeneity+and+regulation+in+the+adult+mammalian+brain.">Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain.</a> Development. 146 (4), (2019).</li><li>Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+neural+stem+cells+by+bHLH+factors.">Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors.</a> Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-multiplexed+analysis+of+single-cell+dynamics+reveals+logic+rules+in+differentiation.">Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li><li>Quake, S. R., Scherer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+micro-to+nanofabrication+with+soft+materials.">From micro-to nanofabrication with soft materials.</a> Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).</li><li>Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surface+micromachining+technologies+for+microfluidics+and+BioMEMS.">Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS.</a> Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).</li><li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+reprograms+resident+astrocytes+into+neural+progenitors+in+the+adult+brain.">SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).</li><li>Sarkar, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+differentiated+&#946;-endorphin+neurons+promote+immune+function+and+prevent+prostate+cancer+growth.">Cyclic adenosine monophosphate differentiated &#946;-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).</li><li>Watanabe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-induced+differentiation+of+embryonic+neural+stem+cells+into+astrocytes+is+mediated+via+the+&#946;+isoform+of+protein+kinase.">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the &#946; isoform of protein kinase.</a> C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).</li><li>Watanabe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+PACAP-induced+differentiation+of+neural+stem+cells+into+astrocytes.">Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li><li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+docking+inside+microwells+within+reversibly+sealed+microfluidic+channels+for+fabricating+multiphenotype+cell+arrays.">Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays.</a> Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).</li><li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+microfluidic+devices+fabricated+in+layered+paper+and+tape.">Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+analysis+on+a+droplet-in-oil+PCR+array.">DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array.</a> Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).</li><li>Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+microwell+device+for+immunomagnetic+single-cell+trapping.">A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).</li><li>Galler, K., Br&#228;utigam, K., Gro&#223;e, C., Popp, J., Neugebauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+big+thing+of+a+small+cell-recent+advances+in+single+cell+analysis.">Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis.</a> Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).</li><li>Gr&#252;nberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microfluidics:+opportunity+for+bioprocess+development.">Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development.</a> Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).</li><li>Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comet+assay+for+testing+genotoxicity+of+chemicals.">In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals.</a> Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).</li><li>Bai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+water+collection+on+integrative+bioinspired+surfaces+with+star-shaped+wettability+patterns.">Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns.</a> Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).</li><li>Zhao, J., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+or+against+topographic+wettability+gradient:+movements+of+droplets+on+a+micropatterned+surface.">Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface.</a> Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).</li><li>Theberge, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+combinatorial+synthesis+in+picolitre+droplets.">Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+ceramic+microspheres+by+diffusion-induced+sol-gel+reaction+in+double+emulsions.">Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).</li><li>Moerman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+in+nanoliter+wells+by+prefilling+of+wells+using+electrospray+deposition+followed+by+sample+introduction+with+a+coverslip+method.">Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method.</a> Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).</li><li>Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+dispensing+method+by+degassed+poly+(dimethylsiloxane)+microchannels+and+its+application+in+protein+crystallization.">Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization.</a> Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).</li></ol>

Divers dispositifs microfluidiques ont été développés pour effectuer des expériences multiplexées etcomplexes 17,18,19,20. Par exemple, les microwells faits d’un éventail de cavités topologiques peuvent piéger des cellules individuelles sans l’utilisation de la force externe, montrant des caractères avantageux comprenant la petite taille d’échantillon, la parallélisation, le c...

Les techniques à haut débit sont cruciales pour les études biomédicales et cliniques. En effectuant parallèlement des millions de tests chimiques, génétiques ou cellulaires vivants et organoïdes, les chercheurs peuvent rapidement identifier les gènes qui modulent une voie biomoléculaire et personnaliser l’apport séquentiel de médicaments en fonction de ses besoins spécifiques. La robotique1 et les puces microfluidiques en combinaison avec un programme de contrôle des périphériques permettent d’automatiser des procédures expérimentales complexes, couvrant la manipulation des cellules et des tissus, la manipulation liquide, l’imagerie et le traitement/contrôledes données 2,3. Par conséquent, des centaines et des milliers de conditions expérimentales peuvent être maintenues sur une seule puce, selon le débitdésiré 4,5. 
Dans ce protocole, nous avons décrit la procédure de conception et de fabrication d’un dispositif microfluidique, qui se compose de 1500 unités de culture, d’un éventail de pompes périsaltiques améliorées et de modules de mélange sur place. La chambre de culture cellulaire à 2 niveaux empêche le cisaillement inutile pendant l’échange moyen, ce qui assure un environnement culturel intact pour l’imagerie cellulaire vivante à long terme. Les études démontrent que le dispositif microfluidique proposé est une plate-forme appropriée pour des études à haut débit sur les machines de vie complexes. En outre, les caractéristiques avancées de la puce microfluidique permettent la reconstitution automatisée de conditions microenvironnementales très complexes et dynamiques in vivo, comme les cytokines et ligands toujours changeantes compositions6,7 , dontl’achèvementprend des mois pour les plates-formes conventionnelles comme la plaque de 96 puits.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2713 Loker Avenue West</td>
			<td>Torrey pines scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ-50X</td>
			<td>AZ Electronic Materials, Luxembourg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator HP151</td>
			<td>Heal Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14</td>
			<td>Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g</td>
			<td>Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronection 0.25 mg/mL</td>
			<td>Millipore, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Incubator BGG-9240A</td>
			<td>Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Model Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner PDC-002</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane(PDMS)</td>
			<td>Momentive</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylysine 0.01%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater ARE-310</td>
			<td>Awatori Rentaro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater TDZ5-WS</td>
			<td>Cence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater WH-SC-01</td>
			<td>Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025</td>
			<td>MicroChem, Westborough, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3075</td>
			<td>MicroChem, Westborough, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of dynamical environmental conditions using a high-throughput microfluidic device

Imiter les conditions environnementales in vivo est crucial pour les études in vitro sur les machines de vie complexes. Cependant, les techniques actuelles ciblant les cellules et les organes vivants sont soit très coûteuses, comme la robotique, soit manquent de volume de nanolitres et de précision milliseconde dans la manipulation liquide. Nous présentons ici la conception et la fabrication d’un système microfluidique, qui se compose de 1500 unités de culture, d’une gamme de pompes périsaltiques améliorées et d’un module de mélange sur place. Pour démontrer les capacités du dispositif microfluidique, les sphères des cellules souches neurales (NSC) sont maintenues dans le système proposé. Nous avons observé que lorsque la sphère de la CSN est exposée au CXCL au jour 1 et au FEM au jour 2, la conformation en forme ronde est bien maintenue. La variation de l’ordre d’entrée de 6 médicaments entraîne des changements morphologiques dans la sphère de la CSN et le marqueur représentatif du niveau d’expression de la stemness NSC (c.-à-d. Hes5 et Dcx). Ces résultats indiquent que les conditions environnementales dynamiques et complexes ont de grands effets sur la différenciation et l’auto-renouvellement de la CSN, et le dispositif microfluidique proposé est une plate-forme appropriée pour les études à haut débit sur les machines de vie complexes.

La pompe périssaltique conventionnelle sur puce a d’abord été décrite par Stephen Quake en 2000, en utilisant laquelle la péristalsis a été actionnée par le modèle 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. Les nombres 0 et 1 indiquent « ouvert » et « proche » des 3 lignes de commande horizontales. Des études utilisant plus de 3 valves (p. ex., cinq) ont également été rapportées11. Même si la pompe périssaltique composée de ...

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Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Nous présentons un système microfluidique pour les études à haut débit sur les machines de vie complexes, qui se compose de 1500 unités de culture, une gamme de pompes périsaltiques améliorées et un module de mélange sur place. La puce microfluidique permet d’analyser in vivo les conditions micro-environnementales très complexes et dynamiques.

Génération de conditions environnementales dynamiques à l’aide d’un dispositif microfluidique à haut débit

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Le microenvironnement permet un cytokines, une concentration et une composition très complexes et dynamiques, y compris des cytokines en constante évolution. Créer un environnement culturel similaire est crucial pour les études in vitro sur des machines de vie complexes telles que la différenciation des cellules souches, les réponses immunitaires et le développement d’organes sur des plates-formes de puces. Mais il est difficile de générer et de délivrer des signaux chimiques de volume nanolimétrique et de précision millisecondes en utilisant des approches biomédicales conventionnelles comme le pipetage.Pour relever les défis, une plate-forme culturelle capable d’alterner la génération d’acquisition d’images d’entrées de signaux combinatoires et séquentielles dynamiques est très demandée. Dans ce protocole, la procédure de conception et de fabrication d’un dispositif microfluidique est présentée. La puce microfluidique proposée se compose de 1500 unités de culture, d’un éventail de pompes périssaltiques améliorées et de modules de mélange sur place.Nous démontrons que la plate-forme est appropriée pour des études sur des cellules simples les populations cellulaires bidimensionnelles et les sphères neurales tridimensionnelles. Les conditions environnementales complexes et dynamiques sur les copeaux ont de grands effets sur la différenciation des cellules souches neurales et l’auto-renouvellement. Le détail des procédures de conception et de fabrication est le suivant.La conception des puces a été effectuée à l’aide du logiciel AutoCAD. Pour s’adapter à la taille du porte-plaques au microscope, la puce microfluidique mesure environ sept à cinq centimètres et se compose de 1500 chambres de culture. Une des caractéristiques importantes est qu’il a pompe périssaliste qui se compose de huit canaux d’écoulement et 200 canaux de contrôle de large micromètre.L’augmentation de la zone de chevauchement entre le contrôle et le canal d’écoulement augmente 16 fois par rapport à la pompe périssaliste, proposée par Stephen Quake en 2002, à environ 15 nanolitres liquides et par cycle de pompage et suffit à maintenir 1500 conditions environnementales indépendantes parallèlement sur puce. Une autre partie importante de l’appareil est une chambre de culture à deux couches, qui peut maintenir un environnement culturel sans cisaillement. Le stress de cisaillement indésirable est évité en le dirigeant rapidement à travers la couche supérieure.Les cellules, les tissus et le milieu conditionnel crucial restent intacts à la couche inférieure. La simulation numérique suggère que lorsque les liquides sont dirigés à travers les chambres de culture, de gauche à droite. les forces de cisaillement peuvent être efficacement empêchées.Même à un débit d’entrée de 10 millimètres par seconde de cellule ou de tissu de la taille d’un micromètre, il n’est pas perturbé au fond de l’unité de culture. Nous avons fabriqué la réplique moulage ou plaquette de silicium en utilisant la lithographie UV. Les canaux fluidiques de 25 micromètres de hauteur et de 100 micromètres de poids sont produits à l’aide d’un photorésistant négatif SU-8 3025.Les chambres de culture de 75 micromètres et de 150 micromètres de hauteur ont été fabriquées à l’aide du photorésistant SU-8 3075. AZ50X photorésiste positif est utilisé pour les caractéristiques de puits en forme ronde qui se chevauchent avec les canaux de contrôle pour assurer une bonne connexion. Pour produire la puce microfludique, les plaquettes de silicium à motifs et vierges ont d’abord été traitées avec TMCS.Différentes quantités de PDMS 10 à 1 de rapport monomère/catalyseur ont été complètement mélangées et débobbleées pendant une à deux heures dans la chambre à vide à moins 0,85 mégapascal. La couche de commande a été obtenue par pdms de revêtement de spin à 2,200 RPM. Les plaquettes de silicium ont ensuite été transférées à l’incubateur et incubées pendant 60 minutes à 80 centigrades.Différentes couches ont été alignées et collées ensemble à l’aide d’un dispositif optique personnalisé et d’une machine à graver le plasma. Les trous d’entrée ont ensuite été perforés après deux autres heures de liaison thermique à 80 centigrades. La puce a été collée à un glissement de couvercle recouvert de PDMS, qui est de la même taille de plaque de 96 puits et durcie pendant au moins 12 heures à 80 centrigrades avant utilisation.Pour le fonctionnement, les canaux de commande ont été raccordés aux valves solénoïdes pneumatiques miniatures par le tube en plastique. Tous les puits pénitents tournants ont été contrôlés par un programme MATLAB personnalisé à travers l’interface utilisateur graphique. Les pressions de fermeture optimales des valves membranaires PDMS push-up ont été déterminées individuellement pour chaque puce, qui varie généralement de 25 à 30 PSI.En tournant toutes les séries de puits dynamiquement combinatoires et séquentiels, les entrées peuvent être générées sur puce. Les cellules ont été récoltées à 80% confluent et réutilisées avec la culture moyenne DMEM à une densité d’environ 10 à la puissance six par millilitre, qui ont ensuite été chargés dans la puce en pressurisant la cellule contenant la solution. Tant pour l’adhérent que pour la culture de suspension des cellules souches neurologiques, des cellules ont été recueillies et les sphères ont été directement chargées dans la puce.Pour l’acquisition d’images, un microscope inversé avec une étape translationnelle automatique et l’appareil photo semi-conducteur d’oxyde métallique complémentaire numérique ont été utilisés. L’acquisition de l’étape et de l’image ont été contrôlées via le logiciel montre le coin supérieur gauche et les chambres inférieures du coin droit comme points de sélection et déplacer l’étape translationnelle vers les points ordonnés pour obtenir l’imagerie préliminaire avec objectif 4x lentille. Modifiez l’objectif 4x avec le 20x one et ajustez les paramètres d’imagerie, y compris l’intensité lumineuse, exposez le temps, et cetera.Ensuite, localisez les points de sélection de sorte que la position de chaque chambre laissant 13 par 15 matrice de chambre ou d’être défini par le programme automatiquement. Avec la détermination des coordonnées des chambres, l’étape translationnelle se déplace vers chaque chambre où X, Y, Z plan focal peut être peaufiné. Définissez l’intervalle et la durée du cycle d’imagerie.Enregistrez le chemin, puis commencez l’imagerie. Ce système est disponible pour divers suivi dynamique cible, tels que la différenciation des cellules souches neurales dans brightfield et le champ de fluorescence du processus de formation de la sphère des cellules souches neurales. Analyse des données.Modifiez le format en nd2 en Tif en utilisant le programme MATLAB personnalisé. Et diviser les données en fonction des points. Sélectionnez l’objet à analyser est cellule ou tissu.Entrez le seuil, la taille de l’objet, la taille du bruit à l’analyse. Ou vous pouvez choisir l’analyse étape par étape pour des paramètres optimaux. Et puis analyser toutes les données.Après avoir sauvé le résultat dans le format MAT, en utilisant l’intrigue pour dessiner les résultats ou les traces. Dans cet article, nous avons décrit le protocole et la culture du système de puce microfluidique à haut débit basé sur la technologie de photolithographie pour le contrôle dynamique de microenvironnement cellulaire vivant. Nous avons également décrit certains paramètres que l’on devrait contrôler soigneusement, comme la pression de fermeture des valves membranaires PDMS et le contrôle de rotation du fluide en parallèle de la chambre.Dans la culture in vitro cellulaire traditionnelle, le traitement de l’environnement de culture cellulaire est effectué manuellement, ce qui prend beaucoup de temps et laborieux et rempli de liquide n’est pas facile à contrôler standard. En particulier les minutes de solution. Il y a certains problèmes tels que la génération d’intrants, la concentration de médicaments immunitaires et une grande consommation.Cependant, en utilisant notre système microfluidique, il est possible de le répéter comme stimulateur à dose fixe un seul fluide égale quantité de concentration uniforme, comparer différentes cultures dans différentes chambres de culture en même temps. Différent avec une certaine résolution temporelle miniature stimulus arrière et avec subsetting la résolution en régulant le fluide. En outre, notre système peut obtenir un grand nombre de résultats expérimentaux comparatifs par des opérations simples.Notre système est basé sur le principe de diffusion, crée une perturbation mécanique minimale du microenvironnement cellulaire. Pour des puces de microenvironnement cellulaires plus stables, vous pouvez augmenter la liste de la couche tampon comme la profondeur de la couche de culture ou réduire le fluide d’entrée de l’échange moyen, c’est-à-dire réduire la pression, qui sera là pour la recherche sur le comportement cellulaire. Il faut remarquer que cette étude n’a examiné que la culture des cellules 3T3 et NSC.Pour d’autres cellules ou lignées cellulaires, les conditions de culture comparables à nos paramètres pour l’ajuster.

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