Name: generation of dynamical environmental conditions using a high-throughput microfluidic device
Uploaded: 2021-04-17T13:00:00
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Die Autoren würdigen die technische Unterstützung von Zhifeng Cheng von Chansn Instrument (China) LTD. Diese Arbeit wurde durch Stipendien unterstützt (National Natural Science Foundation of China,51927804).

1. Mikrofluidische Chips Design
<ol><li>Entwerfen Sie den mikrofluidischen Multiplexer, der aus 18 Einlässe besteht, die jeweils über ein einzelnes Ventil und eine Peristaltikpumpe gesteuert werden. Um das durch den Pumpzyklus angetriebene Flüssigkeitsvolumen zu erhöhen, müssen die Peristaltikpumpe aus 3 Steuerkanälen bestehen, die absichtlich auf 200 m erweitert wurden, und 10 angeschlossenen Durchflussleitungen.</li>
	<li>Gestalten Sie die scherfreie Kulturkammer. Die Replikation der 2-stufigen Kultureinheit be...

<ol>
	<li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+platform+for+quantitative+high-throughput+screening.">A robotic platform for quantitative high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).</li><li>Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+automation+using+elastomeric+valves+and+droplets:+reducing+reliance+on+external+controllers.">Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers.</a> Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).</li><li>Melin, J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration:+the+evolution+of+design+rules+for+biological+automation.">Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).</li><li>Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-assisted+in+vitro+drug+screening+and+carrier+production.">Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).</li><li>Junkin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+quantification+of+single-cell+immune+dynamics.">High-content quantification of single-cell immune dynamics.</a> Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).</li><li>Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells:+origin,+heterogeneity+and+regulation+in+the+adult+mammalian+brain.">Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain.</a> Development. 146 (4), (2019).</li><li>Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+neural+stem+cells+by+bHLH+factors.">Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors.</a> Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-multiplexed+analysis+of+single-cell+dynamics+reveals+logic+rules+in+differentiation.">Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li><li>Quake, S. R., Scherer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+micro-to+nanofabrication+with+soft+materials.">From micro-to nanofabrication with soft materials.</a> Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).</li><li>Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surface+micromachining+technologies+for+microfluidics+and+BioMEMS.">Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS.</a> Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).</li><li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+reprograms+resident+astrocytes+into+neural+progenitors+in+the+adult+brain.">SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).</li><li>Sarkar, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+differentiated+&#946;-endorphin+neurons+promote+immune+function+and+prevent+prostate+cancer+growth.">Cyclic adenosine monophosphate differentiated &#946;-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).</li><li>Watanabe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-induced+differentiation+of+embryonic+neural+stem+cells+into+astrocytes+is+mediated+via+the+&#946;+isoform+of+protein+kinase.">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the &#946; isoform of protein kinase.</a> C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).</li><li>Watanabe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+PACAP-induced+differentiation+of+neural+stem+cells+into+astrocytes.">Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li><li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+docking+inside+microwells+within+reversibly+sealed+microfluidic+channels+for+fabricating+multiphenotype+cell+arrays.">Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays.</a> Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).</li><li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+microfluidic+devices+fabricated+in+layered+paper+and+tape.">Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+analysis+on+a+droplet-in-oil+PCR+array.">DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array.</a> Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).</li><li>Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+microwell+device+for+immunomagnetic+single-cell+trapping.">A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).</li><li>Galler, K., Br&#228;utigam, K., Gro&#223;e, C., Popp, J., Neugebauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+big+thing+of+a+small+cell-recent+advances+in+single+cell+analysis.">Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis.</a> Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).</li><li>Gr&#252;nberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microfluidics:+opportunity+for+bioprocess+development.">Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development.</a> Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).</li><li>Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comet+assay+for+testing+genotoxicity+of+chemicals.">In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals.</a> Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).</li><li>Bai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+water+collection+on+integrative+bioinspired+surfaces+with+star-shaped+wettability+patterns.">Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns.</a> Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).</li><li>Zhao, J., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+or+against+topographic+wettability+gradient:+movements+of+droplets+on+a+micropatterned+surface.">Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface.</a> Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).</li><li>Theberge, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+combinatorial+synthesis+in+picolitre+droplets.">Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+ceramic+microspheres+by+diffusion-induced+sol-gel+reaction+in+double+emulsions.">Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).</li><li>Moerman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+in+nanoliter+wells+by+prefilling+of+wells+using+electrospray+deposition+followed+by+sample+introduction+with+a+coverslip+method.">Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method.</a> Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).</li><li>Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+dispensing+method+by+degassed+poly+(dimethylsiloxane)+microchannels+and+its+application+in+protein+crystallization.">Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization.</a> Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).</li></ol>

Verschiedene mikrofluidische Geräte wurden entwickelt, um Multiplex- und komplexe Experimentedurchzuführen 17,18,19,20. Beispielsweise können Mikrobrunnen aus einer Reihe von topologischen Aussparungen einzelne Zellen ohne den Einsatz externer Kraft einfangen, was vorteilhafte Zeichen wie geringe Stichprobengröße, Parallelisierung, geringere Materialkosten, schnellere Reaktion, hohe Empfin...

Hohe Durchsatztechniken sind entscheidend für biomedizinische und klinische Studien. Durch die parallele Durchführung von Millionen chemischer, genetischer oder lebender Zell- und Organoidtests können Forscher schnell Gene identifizieren, die einen biomolekularen Pfad modulieren, und den sequenziellen Medikamenteneinsatz an die spezifischen Bedürfnisse anpassen. Robotik1 und mikrofluidische Chips in Kombination mit einem Gerätesteuerungsprogramm ermöglichen die Automatisierung komplexer experimenteller Verfahren, die zell-/gewebemanipulation, Flüssigkeitshandhabung, Bildgebung und Datenverarbeitung/-steuerung2,3umfassen. Daher können Hunderte und Tausende von experimentellen Bedingungen auf einem einzigen Chip aufrechterhalten werden, nach dem gewünschten Durchsatz4,5. 
In diesem Protokoll beschrieben wir das Design- und Herstellungsverfahren eines mikrofluidischen Geräts, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter peristaltischer Pumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Die 2-stufige Zellkulturkammer verhindert unnötiges Scheren während des mittleren Austauschs, was eine ungestörte Kulturumgebung für die langfristige Live-Zell-Bildgebung sicherstellt. Die Studien zeigen, dass das vorgeschlagene mikrofluidische Gerät eine geeignete Plattform für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen ist. Darüber hinaus ermöglichen die fortschrittlichen Eigenschaften des mikrofluidischen Chips die automatisierte Rekonstitution hochkomplexer und dynamischer Mikroumweltbedingungen in vivo, wie die ständig wechselnden Zytokin- und Ligandenzusammensetzungen6,7, deren Fertigstellung Monate für konventionelle Plattformen wie 96-Well-Platten dauert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2713 Loker Avenue West</td>
			<td>Torrey pines scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ-50X</td>
			<td>AZ Electronic Materials, Luxembourg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator HP151</td>
			<td>Heal Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14</td>
			<td>Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g</td>
			<td>Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronection 0.25 mg/mL</td>
			<td>Millipore, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Incubator BGG-9240A</td>
			<td>Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Model Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner PDC-002</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane(PDMS)</td>
			<td>Momentive</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylysine 0.01%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater ARE-310</td>
			<td>Awatori Rentaro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater TDZ5-WS</td>
			<td>Cence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater WH-SC-01</td>
			<td>Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025</td>
			<td>MicroChem, Westborough, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3075</td>
			<td>MicroChem, Westborough, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of dynamical environmental conditions using a high-throughput microfluidic device

Die Nachahmung von in vivo-Umweltbedingungen ist entscheidend für In-vitro-Studien an komplexen Lebensmaschinen. Aktuelle Techniken, die auf lebende Zellen und Organe abzielen, sind jedoch entweder sehr teuer, wie Robotik, oder es fehlt an Nanolitervolumen und Millisekunden-Zeitgenauigkeit bei der Flüssigkeitsmanipulation. Wir präsentieren hierdas Design und die Herstellung eines mikrofluidischen Systems, das aus 1.500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter peristaltischer Pumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Um die Kapazitäten des mikrofluidischen Geräts zu demonstrieren, werden neuronale Stammzellkugeln (NSC) im vorgeschlagenen System beibehalten. Wir haben beobachtet, dass die runden konforme Konformation gut erhalten bleibt, wenn die NSC-Kugel CXCL in Tag 1 und EGF in Tag 2 ausgesetzt ist. Die Variation der Eingangsreihenfolge von 6 Medikamenten bewirkt morphologische Veränderungen der NSC-Sphäre und des ausdrucksrepräsentativen Markers für NSC-Stammheit (d. h. Hes5 und Dcx). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dynamische und komplexe Umgebungsbedingungen große Auswirkungen auf die NSC-Differenzierung und Selbsterneuerung haben, und das vorgeschlagene mikrofluidische Gerät ist eine geeignete Plattform für Hochdurchsatzstudien an den komplexen Lebensmaschinen.

Die konventionelle On-Chip-Peristaltikpumpe wurde erstmals von Stephen Quake im Jahr 2000 beschrieben, mit der die Peristaltik nach dem Muster 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10betätigt wurde. Die Zahlen 0 und 1 zeigen "öffnen" und "schließen" der 3 horizontalen Steuerlinien an. Studien mit mehr als 3 Ventilen (z.B. fünf) wurden ebenfalls berichtet11. Obwohl die peristaltische Pumpe aus 3 Steuerleitungen und 3 Durchflusslinien Nanoliter...

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Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Wir präsentieren ein mikrofluidisches System für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter Peristaltikpumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Der mikrofluidische Chip ermöglicht die Analyse der hochkomplexen und dynamischen Mikro-Umgebungsbedingungen in vivo.

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Mikroumgebungen ermöglichen eine hochkomplexe und dynamische Umgebung, einschließlich sich ständig verändernder Zytokine, Ligandenkonzentration und Zusammensetzung. Die Schaffung einer ähnlichen Kulturumgebung ist entscheidend für In-vitro-Studien an komplexen Lebensmaschinen wie Stammzelldifferenzierung, Immunantworten und die Entwicklung von Organen auf Chipplattformen. Aber chemische Signale von NanoliterVolumen und MillisekundenGenauigkeit zu erzeugen und zu liefern, ist mit herkömmlichen biomedizinischen Ansätzen wie Pipettierung schwierig.Um den Herausforderungen gerecht zu werden, ist eine Kulturplattform, die in der Lage ist, die Erzeugung dynamischer kombinatorialer und sequentieller Signaleingaben abwechselnd zu erhalten, sehr gefragt. In diesem Protokoll werden das Design- und Herstellungsverfahren eines mikrofluidischen Geräts vorgestellt. Der vorgeschlagene mikrofluidische Chip besteht aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter peristaltischer Pumpen und einem Mischmodul vor Ort.Wir zeigen, dass die Plattform für Studien an einzelligen zweidimensionalen Zellpopulationen und dreidimensionalen neuronalen Sphären geeignet ist. Die komplexen und dynamischen Umgebungsbedingungen auf Chip haben große Auswirkungen auf die Differenzierung neuronaler Stammzellen und die Selbsterneuerung. Die Details der Design- und Herstellungsverfahren sind wie folgt.Das Chipdesign wurde mit AutoCAD-Software durchgeführt. Um die Größe des Plattenhalters auf dem Mikroskop anzupassen, ist der mikrofluidische Chip etwa sieben mal fünf Zentimeter groß und besteht aus 1.500 Kulturkammern. Eines der wichtigsten Merkmale ist es peristaltische Pumpe, die aus acht Strömungskanälen und 200 Mikrometer breite Steuerkanäle besteht.Die Zunahme des überlappenden Bereichs zwischen Steuerung und Durchflusskanal erhöht sich im Vergleich zur peristaltischen Pumpe, die Stephen Quake 2002 vorgeschlagen hat, auf etwa 15 Nanoliter Flüssigkeit und pro Pumpzyklus und reicht aus, um 1.500 unabhängige Umgebungsbedingungen parallel auf dem Chip aufrechtzuerhalten. Ein weiterer wichtiger Teil des Geräts ist eine zweischichtige Kulturkammer, die eine scherfreie Kulturumgebung erhalten kann. Die unerwünschte Scherspannung wird verhindert, indem sie schnell durch die obere Schicht geleitet wird.Die Zellen, Gewebe und das entscheidende konditionelle Medium bleiben an der unteren Schicht unberührt. Numerische Simulation enden darauf, dass, wenn die Flüssigkeiten durch Kulturkammern gerichtet werden, von links nach rechts. die Scherkräfte können effektiv verhindert werden.Selbst bei einer Eingangsdurchflussrate von 10 Millimetern pro Sekunde bleiben Zelle oder mikrometergroßes Gewebe am unteren Rand der Kultureinheit ungestört. Wir fertigten den Replikform- oder Siliziumwafer mit UV-Lithographie. Die Fluidkanäle von 25 Mikrometern Höhe und 100 Mikrometern Gewicht werden mit SU-8 3025 negativem Photoresist hergestellt.Die Kulturkammern von 75 Mikrometern und 150 Mikrometern Höhe wurden mit SU-8 3075 photoresist hergestellt. DER AZ50X positive Photoresist wird für die runden Brunnenmerkmale verwendet, die sich mit den Steuerkanälen überlappen, um eine gute Verbindung zu gewährleisten. Zur Herstellung des mikrofludischen Chips wurden die gemusterten und leeren Siliziumwafer zunächst mit TMCS behandelt.Verschiedene Mengen von PDMS 10 bis 1 des Monomer-Katalysator-Verhältnisses wurden gründlich gemischt und für ein bis zwei Stunden in der Vakuumkammer bei minus 0,85 Megapascal debubbled. Die Kontrollschicht wurde durch Spinbeschichtung PDMS bei 2, 200 U/min erhalten. Die Siliziumwafer wurden dann in den Inkubator überführt und 60 Minuten lang bei 80 Grad Celsius inkubiert.Verschiedene Schichten wurden mit einem kundenspezifischen optischen Gerät und einer Plasmaätzmaschine ausgerichtet und miteinander verbunden. Die Einlasslöcher wurden dann nach weiteren zwei Stunden thermischer Bindung bei 80 Grad Celsius geschlagen. Der Chip wurde mit einem PDMS-beschichteten Deckbelag verbunden, der die gleiche Größe wie 96-Well-Platte hat und vor Gebrauch mindestens 12 Stunden bei 80 Grad Celsius ausgehärtet wurde.Für den Betrieb wurden Steuerkanäle über Kunststoffschläuche an miniaturpneumatische Magnetventile angeschlossen. Das Drehen aller penumatic Brunnen wurde durch ein benutzerdefiniertes MATLAB-Programm über die grafische Benutzeroberfläche gesteuert. Für jeden Chip wurden die optimalen Schließdrücke von Push-up-PDMS-Membranventilen individuell ermittelt, die in der Regel zwischen 25 und 30 PSI liegen.Durch Drehen aller Brunnenserien können dynamisch kombinatorische und sequenzielle Eingänge auf Dem Chip generiert werden. Die Zellen wurden bei 80 % Konfluenz geerntet und mit dem Kulturmedium DMEM mit einer Dichte von etwa 10 bis zur Leistung von sechs Promille resuspendiert, die dann durch Druck auf die zellhaltige Lösung in den Chip geladen wurden. Sowohl für die Anhängs- als auch für die Suspensionskultur von Neurostammzellen wurden Zellen gesammelt und die Kugeln direkt in den Chip geladen.Für die Bildaufnahme wurden ein invertiertes Mikroskop mit automatischer Translationsstufe und die digitale komplementäre Metalloxid-Halbleiterkamera eingesetzt. Die Bühnen- und Bildaufnahme wurde über die Software gesteuert, die die obere linke Ecke und die unteren rechten Eckkammern als Auswahlpunkte zeigt und die Übersetzungsstufe zu den Punkten geordnet bewegt, um die vorläufige Bildgebung mit 4x Objektiv zu erhalten. Ändern Sie die 4x Objektivlinse mit der 20x objektiven und passen Sie bildgebende Parameter einschließlich Lichtintensität, Zeit aussetzen, et cetera.Dann lokalisieren Sie die Auswahlpunkte so, dass die Position jeder Kammer 13 mal 15 Kammermatrix verlässt oder automatisch vom Programm definiert wird. Mit der Bestimmung der Koordinaten der Kammern bewegt sich die Translationsstufe in jede Kammer, in der die X-, Y-, Z-Fokalebene fein abgestimmt werden kann. Legen Sie das Intervall und die Dauer des Bildgebungszyklus fest.Speichern Sie den Pfad, und starten Sie dann mit der Bildgebung. Dieses System ist für verschiedene Ziel-Dynamische Tracking, wie neuronale Stammzellen Differenzierung im Hellfeld und das Fluoreszenzfeld des Prozesses der neuronalen Stammzellen Kugelbildung. Datenanalyse.Ändern Sie das Format in nd2 in Tif mit dem benutzerdefinierten MATLAB-Programm. Und teilen Sie die Daten nach Punkten auf. Wählen Sie das zu analysierende Objekt ist Zelle oder Gewebe.Geben Sie den Schwellenwert, die Objektgröße und die Rauschgröße ein, um sie zu analysieren. Oder Sie können eine Schritt-für-Schritt-Analyse nach optimalen Parametern wählen. Und dann alle Daten analysieren.Nachdem Sie das Ergebnis im MAT-Format gespeichert haben, verwenden Sie das Diagramm, um die Ergebnisse oder Ablaufverfolgungen zu zeichnen. In diesem Beitrag haben wir das Protokoll der und Der Kultur des hochdurchsatzigen mikrofluidischen Chipsystems auf Basis der Photolithographie-Technologie für die dynamische Steuerung der Mikroumgebung von Lebendenzellen beschrieben. Wir beschrieben auch einige Parameter, die man sorgfältig kontrollieren sollte, wie den Schließdruck von PDMS-Membranventilen und die Spin-Steuerung von Flüssigkeit parallel zur Kammer.In der traditionellen Zell-In-vitro-Kultur wird die Behandlung der Zellkultur-Umgebung manuell durchgeführt, was zeitaufwändig und mühsam und flüssigkeitsgefüllt ist nicht einfach zu Standard-Kontrolle durchgeführt. Besonders Minuten Lösung. Es gibt einige Probleme wie die Erzeugung von Inputs, Immundrogenkonzentration und großen Verbrauch.Mit unserem mikrofluidischen System ist es jedoch möglich, es als Stimulator in einer festen Dosis Einzelflüssigkeit gleiche Menge an gleichmäßiger Konzentration zu wiederholen, verschiedene Kulturen in verschiedenen Kulturkammern zur gleichen Zeit zu vergleichen. Anders mit einigen Miniatur-Zeitlichen Auflösung zurück Stimulus und mit Untersetzen der Auflösung durch Regulierung der Flüssigkeit. Darüber hinaus kann unser System durch einfache Operationen eine große Anzahl vergleichender Experimenteller Ergebnisse erhalten.Unser System basiert auf dem Prinzip der Diffusion, schafft minimale mechanische Störungen in der zellulären Mikroumgebung. Für stabilere zelluläre Mikroumgebungschips können Sie die Liste der Pufferschicht als Tiefe der Kulturschicht erhöhen oder die Eingangsflüssigkeit des mittleren Austauschs reduzieren, d. h. den Druck reduzieren, der hier für die Erforschung des Zellverhaltens sein wird. Es ist zu beachten, dass diese Studie nur die Kultur von 3T3- und NSC-Zellen untersucht hat.Bei anderen Zellen oder Zelllinien sind die Kulturbedingungen vergleichbar mit unseren Parametern, um sie anzupassen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Mikrofluidik-Vorrichtung für die Neuerstellung eines Tumor-Mikroumgebung<em&gt; In Vitro</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

Forschung

Biotechnik

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

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Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

Einer mikrofluidischen Vorrichtung für ein Studium mehrere verschiedene Stämme

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

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Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protokoll für Biofilm Streamer Formation in einem Mikrofluidik-Gerät mit Micro-Säulen

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

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Doppelemulsion Erstellung Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-Axial Flow Fokus Geräte-

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

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Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

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During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...