Name: generation of dynamical environmental conditions using a high-throughput microfluidic device
Uploaded: 2021-04-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device at JoVE.com

המחברים מכירים בתמיכה הטכנית של ג'יפנג צ'אנג מצ'אנסן אינסטרומנט (סין) בע"מ. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים (הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין,51927804).

1. עיצוב שבבים מיקרופלואידיים
<ol><li>עיצוב מולטיפלקסר microfluidic המורכב 18 מפרצון, שכל אחד מהם נשלט על ידי שסתום בודד משאבה peristaltic. כדי להגדיל את נפח הנוזל מונע על ידי כל מחזור שאיבה, יש את המשאבה peristaltic להיות מורכב 3 ערוצי בקרה, אשר הורחב בכוונה ל 200 מיקרומטר, ו 10 קווי זרימה מחוברים.</li>
	<li>עצבו את תא ה...

<ol>
	<li>Michael, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robotic+platform+for+quantitative+high-throughput+screening.">A robotic platform for quantitative high-throughput screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 6 (5), 637-657 (2008).</li><li>Kim, S. J., Lai, D., Park, J. Y., Yokokawa, R., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+automation+using+elastomeric+valves+and+droplets:+reducing+reliance+on+external+controllers.">Microfluidic automation using elastomeric valves and droplets: reducing reliance on external controllers.</a> Small. 8 (19), 2925-2934 (2012).</li><li>Melin, J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration:+the+evolution+of+design+rules+for+biological+automation.">Microfluidic large-scale integration: the evolution of design rules for biological automation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 213-231 (2007).</li><li>Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-assisted+in+vitro+drug+screening+and+carrier+production.">Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (11-12), 1575-1588 (2013).</li><li>Junkin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-content+quantification+of+single-cell+immune+dynamics.">High-content quantification of single-cell immune dynamics.</a> Cell Reports. 15 (2), 411-422 (2016).</li><li>Obernier, K., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cells:+origin,+heterogeneity+and+regulation+in+the+adult+mammalian+brain.">Neural stem cells: origin, heterogeneity and regulation in the adult mammalian brain.</a> Development. 146 (4), (2019).</li><li>Kageyama, R., Shimojo, H., Ohtsuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+neural+stem+cells+by+bHLH+factors.">Dynamic control of neural stem cells by bHLH factors.</a> Neuroscience Research. 138, 12-18 (2019).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-multiplexed+analysis+of+single-cell+dynamics+reveals+logic+rules+in+differentiation.">Ultra-multiplexed analysis of single-cell dynamics reveals logic rules in differentiation.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li><li>Quake, S. R., Scherer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+micro-to+nanofabrication+with+soft+materials.">From micro-to nanofabrication with soft materials.</a> Science. 290 (5496), 1536-1540 (2000).</li><li>Okandan, M., Galambos, P., Mani, S. S., Jakubczak, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surface+micromachining+technologies+for+microfluidics+and+BioMEMS.">Development of surface micromachining technologies for microfluidics and BioMEMS.</a> Microfluidics and BioMEMS. 4560, 133-139 (2001).</li><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition. , (1983).</li><li>Niu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+reprograms+resident+astrocytes+into+neural+progenitors+in+the+adult+brain.">SOX2 reprograms resident astrocytes into neural progenitors in the adult brain.</a> Stem Cell Reports. 4 (5), 780-794 (2015).</li><li>Sarkar, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+adenosine+monophosphate+differentiated+&#946;-endorphin+neurons+promote+immune+function+and+prevent+prostate+cancer+growth.">Cyclic adenosine monophosphate differentiated &#946;-endorphin neurons promote immune function and prevent prostate cancer growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (26), 9105-9110 (2008).</li><li>Watanabe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-induced+differentiation+of+embryonic+neural+stem+cells+into+astrocytes+is+mediated+via+the+&#946;+isoform+of+protein+kinase.">Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-induced differentiation of embryonic neural stem cells into astrocytes is mediated via the &#946; isoform of protein kinase.</a> C. Journal of Neuroscience Research. 84 (8), 1645-1655 (2006).</li><li>Watanabe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+protein+kinase+C+in+the+PACAP-induced+differentiation+of+neural+stem+cells+into+astrocytes.">Involvement of protein kinase C in the PACAP-induced differentiation of neural stem cells into astrocytes.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1070 (1), 597-601 (2006).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li><li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+docking+inside+microwells+within+reversibly+sealed+microfluidic+channels+for+fabricating+multiphenotype+cell+arrays.">Cell docking inside microwells within reversibly sealed microfluidic channels for fabricating multiphenotype cell arrays.</a> Lab on a Chip. 5 (12), 1380-1386 (2005).</li><li>Martinez, A. W., Phillips, S. T., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+microfluidic+devices+fabricated+in+layered+paper+and+tape.">Three-dimensional microfluidic devices fabricated in layered paper and tape.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (50), 19606-19611 (2008).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+analysis+on+a+droplet-in-oil+PCR+array.">DNA methylation analysis on a droplet-in-oil PCR array.</a> Lab on a Chip. 9 (8), 1059-1064 (2009).</li><li>Huang, N. T., Hwong, Y. J., Lai, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+microwell+device+for+immunomagnetic+single-cell+trapping.">A microfluidic microwell device for immunomagnetic single-cell trapping.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 22 (2), 16 (2018).</li><li>Galler, K., Br&#228;utigam, K., Gro&#223;e, C., Popp, J., Neugebauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+big+thing+of+a+small+cell-recent+advances+in+single+cell+analysis.">Making a big thing of a small cell-recent advances in single cell analysis.</a> Analyst. 139 (6), 1237-1273 (2014).</li><li>Gr&#252;nberger, A., Wiechert, W., Kohlheyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microfluidics:+opportunity+for+bioprocess+development.">Single-cell microfluidics: opportunity for bioprocess development.</a> Current Opinion in Biotechnology. 29, 15-23 (2014).</li><li>Lin, H., Mei, N., Manjanatha, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comet+assay+for+testing+genotoxicity+of+chemicals.">In vitro comet assay for testing genotoxicity of chemicals.</a> Optimization in Drug Discovery. , 517-536 (2014).</li><li>Bai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+water+collection+on+integrative+bioinspired+surfaces+with+star-shaped+wettability+patterns.">Efficient water collection on integrative bioinspired surfaces with star-shaped wettability patterns.</a> Advanced Materials. 26 (29), 5025-5030 (2014).</li><li>Zhao, J., Chen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+or+against+topographic+wettability+gradient:+movements+of+droplets+on+a+micropatterned+surface.">Following or against topographic wettability gradient: movements of droplets on a micropatterned surface.</a> Langmuir. 33 (21), 5328-5335 (2017).</li><li>Theberge, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platform+for+combinatorial+synthesis+in+picolitre+droplets.">Microfluidic platform for combinatorial synthesis in picolitre droplets.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1320-1326 (2012).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+ceramic+microspheres+by+diffusion-induced+sol-gel+reaction+in+double+emulsions.">Fabrication of ceramic microspheres by diffusion-induced sol-gel reaction in double emulsions.</a> ACS Applied Materials &amp; Interfaces. 5 (22), 11489-11493 (2013).</li><li>Moerman, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+in+nanoliter+wells+by+prefilling+of+wells+using+electrospray+deposition+followed+by+sample+introduction+with+a+coverslip+method.">Quantitative analysis in nanoliter wells by prefilling of wells using electrospray deposition followed by sample introduction with a coverslip method.</a> Analytical Chemistry. 77 (1), 225-231 (2005).</li><li>Zhou, X., Lau, L., Lam, W. W. L., Au, S. W. N., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+dispensing+method+by+degassed+poly+(dimethylsiloxane)+microchannels+and+its+application+in+protein+crystallization.">Nanoliter dispensing method by degassed poly (dimethylsiloxane) microchannels and its application in protein crystallization.</a> Analytical Chemistry. 79 (13), 4924-4930 (2007).</li></ol>

מכשירים מיקרופלואידיים שונים פותחו לביצוע ניסויים מולטיפלקסים ומורכבים17,18,19,20. לדוגמה, microwells עשוי מערך של גושים טופולוגיים יכול ללכוד תאים בודדים ללא שימוש בכוח חיצוני, מראה תווים יתרון כולל גודל מדגם קטן, parallelization, על?...

טכניקות תפוקה גבוהה חיוניות למחקרים ביו-רפואיים וקליניים. על ידי ביצוע מקביל של מיליוני בדיקות כימיות, גנטיות או חיות של תאים ואורגנואידים, החוקרים יכולים לזהות במהירות גנים המווסתים מסלול ביו-מולקולרי, ולהתאים אישית קלט תרופתי רציף לצרכים הספציפיים של האדם. רובוטיקה1 ושבבים מיקרופלואידיים בשילוב עם תוכנית בקרת מכשיר מאפשרים הליכים ניסיוניים מורכבים להיות אוטומטיים, כיסוי מניפולציה תא / רקמות, טיפול נוזלי, הדמיה, ועיבוד נתונים /שליטה 2,3. לכן, מאות ואלפי תנאים ניסיוניים יכולים להישמר על שבב אחד, על פי התפוקה הרצויה4,5. 
בפרוטוקול זה תיארנו את הליך התכנון וההמצאה של מכשיר מיקרופלואידי, המורכב מ-1500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטלטיות משופרות ומודולוס ערבוב באתר. תא תרבית התאים הדו-מפלס מונע גזירה מיותרת במהלך חילופי דברים בינוניים, המבטיחה סביבת תרבות ללא הפרעה להדמיית תאים חיים לטווח ארוך. המחקרים מראים כי המכשיר המיקרופלואידי המוצע הוא פלטפורמה מתאימה למחקרי תפוקה גבוהה על מכונות החיים המורכבות. יתר על כן, התכונות המתקדמות של השבב המיקרופלואידי מאפשרות שחזור אוטומטי של תנאי מיקרו-וירוס מורכבים ודינמיים מאוד ב- vivo, כמו ציטוקינים משתנים והרכבי רצועות6,7, שהשלמתם לוקחת חודשים לפלטפורמות קונבנציונליות כמו צלחת 96 באר.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2713 Loker Avenue West</td>
			<td>Torrey pines scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AZ-50X</td>
			<td>AZ Electronic Materials, Luxembourg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 Incubator HP151</td>
			<td>Heal Force</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14</td>
			<td>Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g</td>
			<td>Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronection 0.25 mg/mL</td>
			<td>Millipore, Austria</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Incubator BGG-9240A</td>
			<td>Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Model Eclipse Ti2-E</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner PDC-002</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polydimethylsiloxane(PDMS)</td>
			<td>Momentive</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polylysine 0.01%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater ARE-310</td>
			<td>Awatori Rentaro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater TDZ5-WS</td>
			<td>Cence</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin coater WH-SC-01</td>
			<td>Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3025</td>
			<td>MicroChem, Westborough, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 3075</td>
			<td>MicroChem, Westborough, MA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of dynamical environmental conditions using a high-throughput microfluidic device

חיקוי התנאים הסביבתיים vivo הוא חיוני למחקרים במבחנה על מכונות חיים מורכבות. עם זאת, טכניקות הנוכחי מיקוד תאים חיים ואיברים הם גם יקר מאוד, כמו רובוטיקה, או חסר נפח nanoliter ודיוק זמן אלפית שנייה במניפולציה נוזלית. אנו מציגים בזאת את העיצוב וההמצאה של מערכת מיקרופלואידית, המורכבת מ-1,500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטליות משופרות ומודולוס ערבוב באתר. כדי להדגים את היכולות של המכשיר המיקרופלואידי, כדוריות תאי גזע עצביים (NSC) נשמרות במערכת המוצעת. ראינו שכאשר תחום המל"ל נחשף ל- CXCL ביום 1 ו- EGF ביום 2, הקונפורמציה העגולה מתוחזקת היטב. שונות בסדר הקלט של 6 תרופות גורמת לשינויים מורפולוגיים בתחום המל"ל ולסמן הייצוגי ברמת הביטוי עבור גזעים של המל"ל (כלומר, Hes5 ו- Dcx). תוצאות אלו מצביעות על כך שלתנאים סביבתיים דינמיים ומורכבים יש השפעות רבות על הבידול וההתחדשות העצמית של המל"ל, והמכשיר המיקרופלואידי המוצע הוא פלטפורמה מתאימה למחקרי תפוקה גבוהים על מכונות החיים המורכבות.

המשאבה peristaltic על השבב הקונבנציונלי תוארה לראשונה על ידי סטיבן Quake בשנת 2000, באמצעותו peristalsis היה מופעל על ידי דפוס 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10. המספר 0 ו- 1 מציינים "פתוח" ו"קרוב" של 3 קווי הבקרה האופקיים. מחקרים באמצעות יותר מ 3 שסתומים (למשל, חמישה) דווחו גם11. למ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device at JoVE.com

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

אנו מציגים מערכת מיקרופלואידית למחקרי תפוקה גבוהה על מכונות חיים מורכבות, המורכבת מ-1500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטליות משופרות ומודולוס ערבוב באתר. השבב המיקרופלואידי מאפשר ניתוח של התנאים המיקרו-סביבתיים המורכבים והדינמיים ביותר ב-vivo.

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Microenvironment לאפשר מורכב מאוד דינמי כולל ציטוקינים המשתנים ללא הרף, ריכוז רצועות והרכב. כדי ליצור סביבת תרבות דומה חיונית למחקרים במבחנה על מכונות חיים מורכבות כגון בידול תאי גזע, תגובות חיסוניות ופיתוח איברים בפלטפורמות שבבים. אבל כדי ליצור ולספק אותות כימיים של נפח nanoliter ודיוק אלפיות שנייה קשה באמצעות גישות ביו-רפואיות קונבנציונליות כמו pipetting.כדי לעמוד באתגרים, פלטפורמת תרבות המסוגלת ליצור יצירת תמונה חלופית של תשומות איתות קומבינטוריות ורציף דינמיות היא לפי דרישה גבוהה. בפרוטוקול זה מוצג הליך התכנון וההמצאה של מכשיר מיקרופלואידי. השבב המיקרופלואידי המוצע מורכב מ-1500 יחידות תרבות, מערך של משאבות פריסטליות משופרות ומודולוס ערבוב באתר.אנו מראים כי הפלטפורמה מתאימה למחקרים על תאים בודדים אוכלוסיות תאים דו מימדיות וספירות עצביות תלת מימדיות. לתנאים הסביבתיים המורכבים והדינמיים על השבב יש השפעות רבות על בידול תאי גזע עצביים ועל ההתחדשות העצמית. הפרטים של הליכי עיצוב והפיה הם כדלקמן.תכנון השבב בוצע באמצעות תוכנת AutoCAD. כדי להתאים לגודל של מחזיק הצלחת במיקרוסקופ, השבב המיקרופלואידי הוא בערך שבעה על חמישה סנטימטרים בגודל והוא מורכב 1, 500 תאי תרבות. אחת התכונות החשובות היא שיש לו משאבה פריסטלית המורכבת משמונה ערוצי זרימה ו-200 ערוצי בקרה רחבים מיקרומטר.הגידול באזור החופף בין שליטה לערוץ הזרימה גדל פי 16 בהשוואה למשאבה פריסטלית, שהוצעה על ידי סטיבן רעידת אדמה בשנת 2002, לכ -15 ננו-ליטרים נוזליים לכל מחזור שאיבה ולהספיק לצרכים לשמור על 1, 500 תנאי סביבה עצמאיים במקביל על שבב. חלק חשוב נוסף של המכשיר הוא תא תרבות דו שכבתי, אשר יכול לשמור על סביבת תרבות ללא גזירה. מתח הגזירה הלא רצוי נמנע על ידי הפנייתו במהירות דרך השכבה העליונה.התאים, הרקמות והבינון המותנה החיוני נשארים ללא שינוי בשכבה התחתונה. סימולציה מספרית מצביעה על כך שכאשר הנוזלים מופנים דרך תאי תרבות, משמאל לימין. ניתן למנוע ביעילות את כוחות הגזירה.אפילו בקצב זרימת קלט של 10 מילימטר לתא שני או לרקמה בגודל מיקרומטר נשארים ללא הפרעה בתחתית יחידת התרבות. אנחנו מפוברק דפוס העתק או רקיק סיליקון באמצעות ליתוגרפיה UV. הערוצים הנוזליים של 25 מיקרומטר בגובה ו-100 מיקרומטרים במשקל מיוצרים באמצעות פוטורסיסט שלילי SU-8 3025.תאי התרבות של 75 מיקרומטר ו-150 מיקרומטרים בגובה היו מפוברקים באמצעות צילום SU-8 3075. AZ50X פוטורסיסט חיובי משמש עבור תכונות באר בצורת עגול אשר חופפים עם ערוצי הבקרה כדי להבטיח חיבור טוב. כדי לייצר את השבב microfludic, רקיקים סיליקון בדוגמת ריק טופלו תחילה עם TMCS.כמויות שונות של PDMS 10 עד 1 של יחס מונומר כדי זרז היה מעורב ביסודיות debubbled במשך שנה עד שעתיים בתא ואקום במינוס 0.85 מגה פסקל. שכבת הבקרה הושגה על ידי ספין ציפוי PDMS ב 2, 200 סל"ד. לאחר מכן הועברו ופלים הסיליקון לאינקובטור והדגירה במשך 60 דקות ב 80 centigrade.שכבות שונות היו מיושרות ומלוכדות יחד באמצעות מכשיר אופטי מותאם אישית ומכונת תחריט פלזמה. חורי הכניסה היו אז אגרוף לאחר עוד שעתיים מליטה תרמית ב 80 צלזיוס. השבב היה מחובר לתלוש כיסוי מצופה PDMS, שהוא באותו גודל של צלחת 96-באר ונרפא לפחות 12 שעות ב 80 centrigrade לפני השימוש.לצורך הפעולה, ערוצי בקרה היו מחוברים שסתומים סולנואידים פנאומטיים זעירים באמצעות צינורות פלסטיק. הפיכת כל בארות פנומטי נשלטו על ידי תוכנית MATLAB מותאמת אישית באמצעות ממשק המשתמש הגרפי. לחצי סגירה אופטימליים של שסתומי קרום PDMS שכיבות סמיכה נקבעו בנפרד עבור כל שבב, אשר בדרך כלל נע בין 25 ל 30 PSI.על ידי הפיכת כל הסדרות של בארות באופן דינמי קומבינטורית ותשומות רציפות ניתן ליצור על שבב. תאים נקצרו ב 80%confluency ו resuspended עם DMEM בינוני תרבות בצפיפות על 10 כוח שש למיליליטר, אשר לאחר מכן נטענו לתוך השבב על ידי לחיצה על התא המכיל פתרון. הן עבור חסידים והן עבור תרבות ההשעיה של תאי גזע נוירו, תאים נאספו והספירות הועמסו ישירות לתוך השבב.לרכישת תמונה, נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך עם שלב תרגום אוטומטי ומצלמת מוליכים למחצה משלימה דיגיטלית של תחמוצת מתכת. הבמה ורכישת התמונה נשלטו באמצעות התוכנה מראה את הפינה השמאלית העליונה ואת התאים בפינה הימנית התחתונה כנקודות בחירה ולהעביר את השלב התרגום לנקודות מסודר כדי לקבל את ההדמיה הראשונית עם עדשה אובייקטיבית 4x. שנה את העדשה האובייקטיבית 4x עם 20x אחד ולהתאים פרמטרים הדמיה כולל עוצמת האור, לחשוף את הזמן, וכולי.לאחר מכן לאתר את נקודות הבחירה כך המיקום של כל תא עוזב 13 על ידי 15 מטריצה קאמרית או להיות מוגדר על ידי התוכנית באופן אוטומטי. עם קביעת הקואורדינטות של התאים, שלב התרגום עובר לכל תא שבו X, Y, מישור מוקד Z יכול להיות מכוון היטב. הגדר את מרווח הזמן ואת משך מחזור ההדמיה.שמור את הנתיב ולאחר מכן התחל דימות. מערכת זו זמינה למעקב דינמי אחר מטרות שונות, כגון התמיינות תאי גזע עצביים בבהירות ושדה הפלואורסצנטיות של תהליך היווצרות כדוריות תאי גזע עצביים. ניתוח נתונים.שנה את התבנית ב- nd2 ל- Tif באמצעות תוכנית MATLAB המותאמת אישית. ולחלק את הנתונים לפי נקודות. בחר אובייקט שיש לנתח הוא תא או רקמה.הזן את הסף, גודל האובייקט, גודל הרעש לניתוח. לחלופין, באפשרותך לבחור ניתוח שלב אחר שלב לפרמטרים אופטימליים. ואז לנתח את כל הנתונים.לאחר שמירת התוצאה בתבנית MAT, השתמש בתווית כדי לצייר את התוצאות או המעקבים. במאמר זה תיארנו את הפרוטוקול והתרבות של מערכת שבבים מיקרופלואידית בעלת תפוקה גבוהה המבוססת על טכנולוגיית הפוטוליטוגרפיה לשליטה דינמית במיקרו-וירוס התא החי. תיארנו גם כמה פרמטרים שיש לשלוט בהם בקפידה כגון לחץ הסגירה של שסתומי קרום PDMS ובקרת הספין של הנוזל במקביל לתא.בתרבות התאים המסורתית במבחנה הטיפול בסביבת תרבות התא מבוצע ידנית, שהיא זמן רב ומילוי מייגע ונוזלים אינו קל לשליטה סטנדרטית. במיוחד דקות של פתרון. ישנן כמה בעיות כגון יצירת תשומות, ריכוז תרופות חיסוניות וצריכה גדולה.עם זאת, באמצעות המערכת המיקרופלואידית שלנו, ניתן לחזור על זה כממריץ במינון קבוע כמות שווה של ריכוז אחיד, להשוות תרבויות שונות בתאי תרבות שונים באותו זמן. שונה עם כמה גירויים אחוריים ברזולוציה זמנית מיניאטורית ועם תת-רזולוציה על ידי ויסות הנוזל. בנוסף, המערכת שלנו יכולה להשיג מספר רב של תוצאות ניסיוניות השוואתיות על ידי פעולות פשוטות.המערכת שלנו מבוססת על עקרון הדיפוזיה, יוצרת הפרעה מכנית מינימלית למיקרו-וירוס התאי. עבור שבבי microenvironment הסלולר יציב יותר אתה יכול להגדיל את הרשימה של שכבת החיץ כעומק של שכבת התרבות או להפחית את נוזל הקלט של חילופי בינוני, כלומר להפחית את הלחץ, אשר יהיה כאן למחקר על התנהגות התא. יש לשים לב כי מחקר זה בחן רק את התרבות של 3T3 ותאי המל"ל.עבור תאים אחרים או קווי תאים אחרים, תנאי התרבות דומים לפרמטרים שלנו כדי להתאים אותו.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

מכשיר microfluidic ליצירה מחדש של גידול microenvironment<em&gt; במבחנה</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

גנרטור ביטוי חלבון תפוקה גבוהה באמצעות פלטפורמת Microfluidic

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

High Throughput Microfluidic Rapid and Low Cost Prototyping Packaging Methods

In this work, 3 different packaging and assembly techniques are presented. They can be classified into two categories: one-time use and reusable packaging ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

השומנים bilayer שלפוחיות דור שימוש Microfluidic jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

פרוטוקול ליצירת biofilm Streamer במכשיר microfluidic עם מיקרו עמודים

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms

שימוש בתפוקה גבוהה<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

There are few high-throughput in vitro systems which facilitate the development of multi-species biofilms that contain numerous species commonly detected ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

זוגי אמולסיה דור שימוש בהתקן זרימת פוקוס Co-הצירית polydimethylsiloxane (PDMS)

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Mechanostimulation of Multicellular Organisms Through a High-Throughput Microfluidic Compression System

מכניסטימולציה של אורגניזמים רב-תאיים באמצעות מערכת דחיסה מיקרופלואידית בעלת תפוקה גבוהה

During embryogenesis, coordinated cell movement generates mechanical forces that regulate gene expression and activity. To study this process, tools such ...