Name: 4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy
Uploaded: 2020-10-08T13:00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra Rioja Salud Foundation (Fondos FEDER) og den spanske Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda er finansieret af et stipendium fra AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).

1. Dyrk C. elegans på petriskåle
<ol><li>Forbered NGM-plader og frø dem med E. coli OP50 som fødekilde (figur 1). Dyrk og vedligehold C. elegans som beskrevet17. Opbevar såede plader ved 4 ° C i op til en måned.</li>
	<li>Juster pladerne til den ønskede temperatur, inden ormene tilsættes.<ol>
<li>For at overføre ormene skal du fjerne et stykke agar fra en gammel tallerken og placere den på en frisk tallerken.</li>
		<li>Alternativt kan du fange enkeltdyr med en steril ormeplukker (et 1-tommers stykke 32-gauge platintråd med en flad spids, monteret på spidsen af en Pasteur-pipette) og placere dem på den nye plade.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dyrk ormene ved den ønskede temperatur.<ol>
<li>Dyrk C. elegans orme ved 20 °C, standardtemperaturen. For at analysere udviklingen af termofølsomme mutanter skal du dog udføre en inkubation natten over, normalt ved 25 °C. Juster varigheden og temperaturen af denne inkubation efter behov, afhængigt af den specifikke mutant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Forbered 4D-mikroskopioptagelsen, før embryonerne monteres (figur 2)
<ol><li>Opsæt mikroskopet og temperaturkontrollerne, inden embryoet forberedes. C. elegans embryoner deler sig meget hurtigt. Vær forberedt på at begynde at optage umiddelbart efter montering af embryonerne.</li>
	<li>Registreringstemperaturen justeres til enten 15 °C, 20 °C eller 25 °C.<ol>
<li>Registrer rutinemæssigt embryonerne ved 25 °C. Optag termofølsomme mutanter ved den restriktive temperatur for at vise deres fænotyper. Optag en WT-kontrol (hvis den udføres i et andet præparat) ved samme temperatur som mutanterne. BEMÆRK: WT-embryoner udvikler sig hurtigere ved 25 °C og langsommere ved 15 °C uden yderligere forskelle i celleslægt. Placer mikroskoper i et temperaturstyret rum. Yderligere kontrol ved afkøling eller opvarmning af diaset er yderst ønskeligt. Dette kan opnås ved at cirkulere vand ved en bestemt temperatur gennem en metalring omkring mikroskopets mål og kondensator. Målet og præparatet er i direkte kontakt gennem nedsænkningsolien, og temperaturoverførslen er effektiv. Dette system giver mulighed for præcis kontrol af registreringstemperaturen og for at udføre temperaturskift under embryonudvikling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definer postparametrene i mikroskopisoftwaren.<ol>
<li>For en standard C. elegans-optagelse (uden fluorescerende scanninger) skal du vælge: z-stakke med 30 brændvidder i en afstand af 1 mikron hver. 30 sekunders intervaller mellem begyndelsen af hver z-stak. 1500 z-stakke (12,5 timers rekord). BEMÆRK: Både kommercielle såvel som open source mikroskopkontrolprogrammer kan bruges til at definere denne arbejdsgang til optagelse af billeder. Nu er mikroskopet klar til at optage.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Forbered og monter embryonerne
<ol><li>Forbered en tynd, homogen agarpude som det første skridt i at opnå et flot billede (figur 3).<ol>
<li>Forbered 50 ml af en 4,5% agaropløsning i deioniseret vand. Varm op til kogning i mikrobølgeovnen og hæld 0,5 - 1 ml i 3 ml glasrør.</li>
		<li>Forsegl forsigtigt rørene med voksfilm for at undgå udtørring. Forseglede agarrør kan opbevares ved stuetemperatur i op til to måneder.</li>
		<li>På laboratoriebænken skal du have en varmeblok ved 80 °C med: et reagensglas af ren vaselin (smeltet) med en fin pensel indeni. et reagensglas med destilleret vand indeholdende en Pasteur-pipette. BEMÆRK: Dette sikrer, at alle de nødvendige materialer bliver varme, og agaren størkner ikke i processen med at fremstille puden.</li>
		<li>Fjern voksfilmen fra toppen af et af agarrørene, og opvarm den forsigtigt over en alkoholbrænder for at smelte agaren. Vær forsigtig, da varm agar, der udvises fra glasrøret, kan forårsage forbrændinger.</li>
		<li>Når agaren er smeltet, skal du placere røret i varmeblokken for at holde agaren i flydende form.</li>
		<li>Alternativt kan du placere agarrørene i varmeblokken 1 time før eksperimentet for at smelte dem uden at bruge en brænder. Den smeltede agar skal kasseres efter en dag.</li>
		<li>Placer et mikroskop dias (Slide A) mellem to andre på et stykke plastik.</li>
		<li>Tag et andet dias (Slide B), og hold det med fingrene i den ene hånd.</li>
		<li>Med den anden hånd skal du placere en lille dråbe smeltet agar i midten af Slide A ved hjælp af den varme Pasteur-pipette.</li>
		<li>Tryk straks på skub B på agarfaldet for at skabe en meget tynd pude mellem slides A og B. Hold disse dias klemt sammen indtil trin 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monter embryonerne.<ol>
<li>Saml 5-10 gravide hermafroditter med plukkeren og læg dem i et urmagerglas fyldt med vand.</li>
		<li>Brug en skalpel til at skære hermafroditnematoderne op og ekstrahere tidlige æg (1-4 celler) fra livmoderen under stereomikroskopet.</li>
		<li>Tag glideren fra trin 3.1.10, og skub forsigtigt Slide B af for at afsløre agarpuden på Slide A.</li>
		<li>Placer et tidligt æg i midten af agarpuden ved pipettering med et kapillarrør.</li>
		<li>Alternativt pipette en dråbe indeholdende et sæt embryoner på agarpuden og derefter søge efter tidlige embryoner. Gør dette trin under stereomikroskopet.</li>
		<li>Flyt om nødvendigt ægget ved at skubbe det med en øjenvipper limet til enden af et tandstikker.</li>
		<li>Fjern overskydende vand med kapillærpipetten. BEMÆRK: En kapillærpipette kan let fremstilles ved at opvarme en Pasteur-pipette over en alkoholbrænder og trække den fra begge ender.</li>
		<li>Dæk forsigtigt præparatet med en dækseddel. For at undgå luftbobler skal du placere den ene kant af dækslippet på glideren og forsigtigt skubbe en skalpel langs den tilstødende kant for langsomt og skråt at drapere dækslippet på præparatet.</li>
		<li>Brug en pipette til at fylde 3/4 af rummet omkring agarpuden med vand. Forlad 1/4 af rummet med luft.</li>
		<li>Forsegl dækselslipsen med vaselin for at undgå udtørring i lange optagelsesperioder.</li>
		<li>Brug den fine børste til at forlænge et tyndt lag smeltet vaselin rundt om kanten af dæksedlen. BEMÆRK: Nu er forberedelsen klar til optagelse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Juster DIC, og start 4D-mikroskopioptagelsen
<ol><li>Placer diaset på mikroskopstadiet. Fokuser embryoet ved hjælp af målet med lav forstørrelse (5x eller 10x).</li>
	<li>Skift til 100x nedsænkningsmålet.</li>
	<li>Juster mikroskopets optiske komponenter for at få et Nomarski-billede.<ol>
<li>Fokuser kondensatoren.</li>
		<li>Åbn kondensatorens blænde helt, og luk feltmembranen (dette vil give en højere numerisk blænde og derfor større opløsning).</li>
		<li>Kontroller, at begge polarisatorer på mikroskopet er orienteret for at forårsage den maksimale lysudryddelse.</li>
		<li>Drej Wollaston-prismet for at få et flot tredimensionelt billede af embryoet, oplyst på den ene side. Drej prismet i den anden retning for at få effekten af at have embryoet oplyst på den anden side. BEMÆRK: Disse trin kan udføres på en testprøve før optagelsen, så der kun kræves finjustering på den prøve, der analyseres.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Start billedoptagelsen i mikroskopet.</li>
</ol>5. Analyser 4D-filmen (figur 4).
BEMÆRK: Når optagelsen er afsluttet, skal du bruge cellelinjesporingssoftware til at rekonstruere og analysere cellestamning.
Software til sporing af celleafstamning er et kraftfuldt værktøj til at udføre detaljerede analyser af embryonal udvikling eller dynamik i cellekulturer eller vævsfragmenter. Programmet udtrækker og kvantificerer flere datasæt om prøvens cellulære dynamik, der omfatter generering af den komplette celleafstamning af hver eneste registrerede celle, herunder celledelinger, cellecykluslængde, migration eller apoptose samt dens kinetik. Derudover kan celledifferentiering scores ved cellens morfologiske ændringer eller ved ekspression af specifikke markører. Grundlæggende viser softwareskærmen to vinduer: I venstre vindue kan 4D-filmen afspilles frem og tilbage eller op og ned til enten de øverste eller nederste niveauer, så hver celle kan følges i tid og rum under hele optagelsen. På højre enke genereres celleslægten. Ved at klikke på en cellekerne i 4D-filmen genereres et punkt i afstamningsvinduet, der gemmer oplysningerne om cellenavn, skæbne og rumlige koordinater. Celleafstamningen af en bestemt celle genereres ved at afspille 4D-filmen fremad og klikke periodisk på kernen for at markere mitosen af den specifikke celle over tid. Gentagelse af denne proces for hver af de registrerede celler genererer embryoets eller prøvens komplette celleafstamning. De lagrede oplysninger for rumlige koordinater for hver celle bruges senere til at rekonstruere 3D-embryomodeller og cellemigrationsstier.
<ol><li>Åbn afstamningssporingssoftwaren, og opret et nyt projekt ved at gå til menuen øverste bjælke og vælge: | fil Nyt projekt.</li>
	<li>Vælg celleafstamningsskabelonen afhængigt af optagelsestemperaturen: DB08 til optagelse ved 25 °C, DB10 til optagelse ved 20 °C og DB12 til optagelse ved 15 °C.</li>
	<li>Indstil optagelsesparametrene i det nye vindue: scanningsantal (normalt 1500), tid mellem scanninger (30 sekunder), niveauantal (30) og afstand mellem niveauer (1 mikron).</li>
	<li>Vælg billedfilen og formatet.<ol>
<li>Vælg den billedmappe, hvor billederne blev gemt.</li>
		<li>Vælg, om billeder skal gemmes som enkeltbilleder (ét billede pr. niveau og tid) eller som z-stakke med flere billeder.</li>
		<li>Bestem filnavngivning og billedformat. Rutinemæssigt gemmes enkeltbilleder under følgende navne: X0000L00C1 (til scanning 0, niveau 0, kanal 1) X0000L01C1 (til scanning 0, niveau 1, kanal 1) X0000L02C1 (til scanning 0, niveau 2, kanal 1) ... X0001L00C1 (til scanning 1, niveau 0, kanal 1) X0001L01C1 (til scanning 1, niveau 1, kanal 1) ... X0300L04C1 (til scanning 300, niveau 4, kanal 1) ... BEMÆRK: Hvis du gemmer billederne i et komprimeret format, sparer du plads på harddisken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definer lyskanalerne: 1 til DIC-optik, 2 til GFP, 3 til RFP osv. Tilføj dem, der blev brugt i 4D-optagelsen. Klik på "kanalbehandling aktiveret" for at registrere dem.</li>
	<li>Begynd at spore embryoets celleafstamning. Skærmen indeholder nu to store vinduer: videovinduet og celleafstamningsvinduet.<ol>
<li>I afstamningsvinduet skal du vælge en afstamningsgren og bruge musen til at klikke på cellekernen, der svarer til denne celle i videovinduet.</li>
		<li>Følg cellen rumligt og over tid ved at afspille 4D-filmen fremad, bagud eller op eller ned ad et niveau ved hjælp af piletasterne.</li>
		<li>Klik regelmæssigt på cellekernen. Dette genererer et punkt i slægtsgrenen og registrerer cellens rumlige koordinater på dette tidspunkt. Som følge heraf skrider celleafstamning frem, og 3D-rekonstruktioner af embryoet er mulige.</li>
		<li>Marker mitose ved at klikke på returtasten. Vælg derefter en af dattercellerne, og følg den som før.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gentag processen (trin 5.6.1 til 5.6.4) for resten af embryonale celler for at spore den komplette celleafstamning eller for at følge specifikke celler af interesse, såsom dem, der gennemgår apoptose.</li>
	<li>Sammenlign den mutante slægt med den stereotype WT C. elegans celleafstamning.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+cell+lineage+tracing+method+for+obtaining+systematic+spatiotemporal+gene+expression+patterns+in+Caenorhabditis+elegans.">A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).</li><li>Nieto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ccz-1+mediates+the+digestion+of+apoptotic+corpses+in+C.+elegans.">ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans.</a> Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).</li><li>Cabello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDR-1/hParkin+negatively+regulates+the+phagocytosis+of+apoptotic+cell+corpses+in+Caenorhabditis+elegans.">PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1120 (2014).</li><li>Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Acetylcholine+Signaling+Reduces+Cell+Clearance+Deficiencies+in+Caenorhabditis+elegans.">Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).</li><li>S&#225;enz-Narciso, B., G&#243;mez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+developmental+networks+by+Rac/Rho+small+GTPases:+How+cytoskeletal+changes+during+embryogenesis+are+orchestrated.">Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated.</a> Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).</li><li>Zheleva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+mRNA+export+unmasks+different+tissue+sensitivities+to+low+mRNA+levels+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development.</a> PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+Embryos+using+an+Epifluorescent+Microscope+and+Open+Source+Software.">Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).</li><li>Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Microscopy+of+Early+Embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).</li><li>Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+neuroblast+formation,+mitotic+domains+and+proneural+gene+expression+during+early+brain+development+in+Drosophila.">The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila.</a> Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).</li><li>Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buccal+capsule+development+as+a+consideration+for+phylogenetic+analysis+of+Rhabditida+(Nemata).">Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata).</a> Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).</li><li>Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cell+lineage+of+the+marine+nematode+Pellioditis+marina.">Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina.</a> Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eutardigrade+Thulinia+stephaniae+has+an+indeterminate+development+and+the+potential+to+regulate+early+blastomere+ablations.">The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations.</a> Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+a+couple+of+dimensions+can+do+for+you:+Comparative+developmental+studies+using+4D+microscopy-examples+from+tardigrade+development.">What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development.</a> Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).</li><li>Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+embryonic-abembryonic+axis+of+the+mouse+blastocyst:+relationships+between+orientation+of+early+cleavage+divisions+and+pattern+of+symmetric/asymmetric+divisions.">Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions.</a> Development. 135 (5), 953-962 (2008).</li><li>Mora-Lorca, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+reductase+gsr-1+is+an+essential+gene+required+for+Caenorhabditis+elegans+early+embryonic+development.">Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

En af de store udfordringer i moderne biologi er at forstå udviklingen af flercellede organismer. C. elegans har vist sig som en af de bedst egnede modeller til at studere den fine koordinering mellem celleproliferation og celledifferentiering i det udviklende embryo. Fra et optisk synspunkt gør dens gennemsigtige krop og dens lille størrelse denne nematode til en ideel prøve til DIC-mikroskopi. Andre organismer med lignende egenskaber har også været udsat for 4D-mikroskopianalyse 11,12,13,14,15,16.
For disse udviklingsundersøgelser giver geninaktivering ved enten fremadrettet eller omvendt genetik et fingerpeg om dets involvering i embryogenese. Når et gen har vist sig at spille en rolle i udviklingen, er det næste skridt at definere dets nøjagtige rolle i etableringen af den korrekte kropsplan. Immunstaining er den valgte tilgang til de fleste modeller. Denne teknik belyser problemer med celledifferentiering eller ekspression af specifikke markører. En væsentlig begrænsning ved denne tilgang er imidlertid, at den kun giver et statisk billede af udtrykket af en enkelt eller flere markører på et fast punkt i udviklingen. Et dynamisk billede af disse markører gennem hele udviklingen kan kun opnås ved at farve forskellige embryoner på forskellige tidspunkter. Derudover er rekonstruktion af celleafstamning ikke mulig i sådanne faste prøver.
4D-mikroskopi er en komplementær tilgang til at studere embryonal udvikling. Denne teknik afslører udviklingsdynamik ved en celleniveauopløsning. Enhver defekt i embryoet, såsom problemer i spindelorientering, cellemigration, apoptose, celleskæbnespecifikation osv., Vil dukke op i en 4D-film, der kan visualiseres frem og tilbage, kvantificeres og scores af forskeren. Ved hjælp af denne teknik kan stort set hver eneste celle i embryoet følges op til det øjeblik, embryoet begynder at bevæge sig. Embryoner, der udsættes for 4D-mikroskopi med kun synligt lys og Nomarski-optik, pådrager sig ikke fotoskader. Fluorescerende scanninger kan også interkaleres i optagelsen for at detektere, hvornår og hvor et gen udtrykkes. Embryoner, der lider af betydelig fotoskade, identificeres ved cellecyklusforlængelsen, der forårsager stærk UV-bestråling sammenlignet med et standard WT-afstamningsembryo. I så fald kan fotoskader reduceres ved at sænke UV-lampens intensitet og øge kameraets følsomhed eller eksponeringstid. Morfologiske egenskaber og molekylære markører kan hjælpe med at afklare den embryonale udvikling af enhver mutant.
Opsætning af et 4D-mikroskopisystem er let at implementere i laboratoriet og muliggør efter en vis praksis en uovertruffen analyse af celledynamik og afstamningssporing af cellekulturer og levende gennemsigtige prøver på opløsningsniveau for hver eneste celle i mikroskopfeltet. Sporing af celleafstamning på DIC-billeder behandles stadig manuelt. Det er tidskrævende, og selvom softwaren registrerer afstamningsfejl såsom forskellige slægtsgrene, der markerer den samme celle, er fejl mulige. Mens automatisk detektion af GFP-mærkede celler er veludviklet2, er komplementær afstamningssporingssoftware baseret på umærkede celler og billeder af synligt lys stadig i det tidlige stadium og ikke rigtig nyttigt til en fuld embryoanalyse. Uden tvivl vil anvendelse af billedgenkendelsessystemer inden for mikroskopi af synligt lys medføre et stort fremskridt på dette område.

4D-mikroskopi er et multifokalt time-lapse-registreringssystem, der gør det muligt for forskere at registrere og kvantificere celledynamikken i en biologisk prøve både rumligt og over tid. Cellekulturer, gær eller levende væv kan underkastes 4D-analyse, men denne teknik er især velegnet til at analysere udviklingen af levende embryoner. Opløsningen af denne analyse når niveauet for hver enkelt celle i embryoet. Hver celledeling kan detekteres, og cellebevægelser kan spores over tid. Celleskæbner vurderes i henhold til den position og form, som cellerne erhverver. Brugen af Nomarski-optik forbedrer kontrasten mellem ufarvede gennemsigtige prøver ved hjælp af ortogonalt polariserede lysstråler, der forstyrrer brændplanet. De resulterende billeder vises tredimensionelle, belyst på den ene side.
Andre metoder baseret på anvendelse af konfokalmikroskopi og GFP transgene dyr til automatisk påvisning af kerner og generering af celleafstamninger er blevet udviklet 1,2. Fordelen ved disse systemer er indlysende: Softwaren tilsidesætter i høj grad behovet for manuelt at markere hver kerne over en periode (selv om der kræves en vis manuel overvågning i de sene faser). Imidlertid forbliver cellulære processer, der involverer ændringer i celleform eller membrandynamik, såsom dem, der forekommer under celledifferentiering, migration, apoptose eller ligopslugning, skjult som en sort baggrund i de fluorescerende mærkede kernebilleder.
I modsætning hertil viser 4D Nomarski-mikroskopi (også kaldet DIC-mikroskopi, Differential Interference Contrast-mikroskopi) både kerner og celleformændringer, der opstår under udviklingen af vildtype eller mutante dyr. Dette muliggør sporing af celleafstamning ved hjælp af standardmikroskoper, der kun anvender transmitteret lys. Der er ikke noget generelt behov for at anvende transgene dyr undtagen for at vise specifikke ekspressionsmønstre, i hvilket tilfælde fluorescerende scanninger kan interkaleres. Derfor kan dette være den optimale tilgang for mange laboratorier, der arbejder med dynamiske celleprocesser såsom embryogenese eller apoptose, der kan fremhæves under DIC-mikroskopi 3,4,5,6,7.
Flere fleksible og brugervenlige programmer er tilgængelige til optagelse af mikroskopiske billeder og rekonstruktion af celleafstamninger, 3D-modeller, cellemigrationsstier osv. I den optagede prøve. I et standardeksperiment erhverves billeder i en række brændplaner i konstant afstand, hvis antal afhænger af prøvetykkelsen. Tidsmæssig opløsning af analysen kan optimeres ved at øge scanningsfrekvensen. Der er stort set ingen grænse for optagelsens varighed bortset fra computerens lagerkapacitet. For eksempel til en C. elegans embryoudviklingsanalyse erhverver vi rutinemæssigt billeder på 30 fokusplaner (1 mikron-trin hvert 30. sekund i 12 timer.
Disse systemer er blevet anvendt til analyse af flere dyreembryoner såsom Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, andre nematodeembryoner12,13, bjørnedyr14,15 og endda tidlige museembryoner16. Det eneste krav er at have et gennemsigtigt embryo, der er i stand til at udvikle sig på diaspræparatet under mikroskopet.
Sammenfattende er DIC-baseret 4D-mikroskopi især nyttig til 1) analyse af embryonal udvikling af små, gennemsigtige dyr: sporing af celleafstamning, cellemigrationsstier, generering af 3D-modeller osv.; 2) definition af genekspressionsmønstre; 3) studere cellekulturdynamik, fra gær til humane celler; 4) analysere vævsdynamik eller embryofragmenter; 5) kvantificering af celledødskinetik og opslugning af lig; og 6) udførelse af komparativ fylogenianalyse baseret på embryonale udviklingsmæssige egenskaber. Hvis der er interesse for et af disse emner (eller lignende), kan 4D-mikroskopi bruges.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (N2)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>N2</td>
			<td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (VZ454)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>VZ454</td>
			<td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lineage Tracing software</td>
			<td>SIMI</td>
			<td>Simi BioCell</td>
			<td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca-R2</td>
			<td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Caenotec</td>
			<td>Time to Live</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel 
			Kleine Dorfstr. 9 38312 B&#246;r&#223;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica DM6000</td>
			<td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

4D-mikroskopi er et uvurderligt værktøj til at optrævle den embryonale udviklingsproces hos forskellige dyr. I løbet af de sidste årtier har Caenorhabditis elegans vist sig som en af de bedste modeller til at studere udvikling. Fra et optisk synspunkt gør dens størrelse og gennemsigtige krop denne nematode til en ideel prøve til DIC (Differential Interference Contrast eller Nomarski) mikroskopi. Denne artikel illustrerer en protokol til dyrkning af C. elegans nematoder, forberedelse og montering af deres embryoner, udførelse af 4D-mikroskopi og sporing af cellestamning. Metoden er baseret på multifokale time-lapse-registreringer af Nomarski-billeder og analyse med specifik software. Denne teknik afslører embryonal udviklingsdynamik på cellulært niveau. Enhver embryonal defekt i mutanter, såsom problemer i spindelorientering, cellemigration, apoptose eller celleskæbnespecifikation, kan effektivt detekteres og scores. Næsten hver eneste celle i embryoet kan følges op til det øjeblik, embryoet begynder at bevæge sig. Sporing af den komplette celleafstamning af et C. elegans embryo ved 4D DIC-mikroskopi er besværligt, men brugen af specifik software letter i høj grad denne opgave. Derudover er denne teknik let at implementere i laboratoriet. 4D-mikroskopi er et alsidigt værktøj og åbner mulighed for at udføre en uovertruffen analyse af embryonal udvikling.

For at karakterisere embryonal udvikling af en C. elegans mutant for genet gsr-1, der koder for enzymet glutathionreduktase, der kræves for at regenerere reduceret glutathion (GSH) og involveret i at opretholde redoxhomeostase i nematoden, udførte vi 4D-mikroskopi af en gsr-1 (tm3574) deletionsmutant, der er et tab af funktionsallel, der forårsager en tidlig embryonal arrestfænotype18. Både WT og afbalanceret gsr-1 (tm3574) mutant C. elegans nematoder blev dyrket på NGM-plader podet med E. coli OP50 som fødekilde17. gsr-1 (tm3574) orme blev dyrket som heterozygote ved 20 °C i to generationer, og derefter blev segregerende homozygote orme (som er i stand til at vokse op til voksenalderen takket være moderens belastning) flyttet til 25 °C for en udrubation natten over inden embryoanalyse. Ormplader blev inkuberet i papkasser for at undgå kondens (figur 1). Gravid nematoder blev skåret op for at ekstrahere unge embryoner.
For at sammenligne embryonal udvikling af mutanten versus den stereotype WT under identiske betingelser blev en WT (som kontrol) og et gsr-1 (tm3574) embryo anbragt på det samme præparat ved siden af hinanden. 4D-mikroskopi workflow blev kørt på et standard motoriseret opretstående mikroskop udstyret med DIC-optik. De valgte optagelsesparametre på mikroskopets kontrolprogram var: z-stakke på 30 brændvidder i 1 mikron afstand hver, 30 sekunders intervaller mellem begyndelsen af hver z-stak og 1500 z-stakke (12,5 timers optagelse). Optagelsestemperaturen blev justeret til 25 °C (både i rummet og på mikroskopscenen) (figur 2).
Når optagelsen var afsluttet, blev billedfilen åbnet, og celleafstamning blev rekonstrueret ved hjælp af afstamningssporingssoftware ved at klikke på cellekerner vist i videovinduet (figur 4). Den sporede gsr-1 (tm3574) mutante embryonale celleafstamning blev sammenlignet med C. elegans WT-slægten afbildet i baggrunden. Et vigtigt resultat var påvisning af en progressiv forsinkelse af cellecyklussen under embryonal udvikling. Som følge heraf arresterede mutante embryoner i mellemstadier, mens WT-embryoner udviklede sig og til sidst klækkede som larver.
Forberedelse og direkte observation af embryoner under mikroskopet eller immunplettering med antistoffer mod sene embryonale markører kan afsløre tilstedeværelsen af en høj procentdel af unge embryoner i mutanten sammenlignet med WT. Embryostop kunne derefter udledes som den mest plausible forklaring. Imidlertid kan direkte bevis og nøjagtig kvantificering af cellecyklusforsinkelsen kun elegant og let vises og kvantificeres gennem et 4D-mikroskopieksperiment. Andre vigtige træk ved embryonal udvikling såsom celledifferentiering eller apoptose (figur 5) kan også visualiseres på en dynamisk måde ved hjælp af 4D-mikroskopi, der giver en detaljeret analyse af flere aspekter af udvikling i et enkelt eksperiment.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> Figur 1: C. elegans nematoder vokser under laboratorieforhold. Nematoder dyrkes på E. coli-frøede NGM-plader, opbevares i papkasser og inkuberes enten ved 15 °C, 20 °C eller 25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> Figur 2: Skærmbillede af 4D-mikroskopioptagelsessoftware. Eksempel på to forskellige mikroskopstyringssoftwareprogrammer (A og B). Disse programmer opretter arbejdsgange til styring af mikroskopet og billedoptagelsen under 4D-mikroskopioptagelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> Figur 3: Serielle fotografier af agarpudeforberedelse og montering af C. elegans embryoet, der vises. A. Forberedte agarrør. B-C. Forberedelse af agarpuden. D. Skub delvist fyldt med vand. E. Forsegling af diaset med vaselin. F. Afsluttende forberedelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> Figur 4: Serielle skærmbilleder af celleafstamningssporingssoftware. Programmet tillader rekonstruktion af den embryonale celleafstamning af en cellecyklusforsinkelsesmutant (venstre) og et WT (højre) C. elegans embryo. En. Et tidligt skridt i udviklingen. B-C. Udviklingen af begge embryoner skrider frem over tid. D. WT embryo udvikler sig korrekt og begynder forlængelse, mens mutanten arresterer. I alle tilfælde viser programmet videovinduet og afstamningsvinduet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> Figur 5: Linserefraktil form af apoptotiske celler i et C. elegans WT-embryo. Celleskæbne, defineret af morfologiske egenskaber, kan vurderes ved 4D-mikroskopi. Billedet viser et C. elegans embryo i bønnestadiet. Levende celler viser glatformede kerner omgivet af en granulær cytoplasma. I modsætning hertil kondenserer apoptotiske celler (gule pile) og vedtager en linselignende, refraktil form. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Her præsenterer vi en protokol til forberedelse og montering af Caenorhabditis elegans embryoner, registrering af udvikling under et 4D-mikroskop og sporing af celleafstamning.

4D-mikroskopi: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonal Development ved hjælp af Nomarski Mikroskopi

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Omfattende vurdering af Kimcellelinje kemiske toksicitet Brug nematoden<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse af Cardiomyocyte Development hjælp Immunofluorescens i embryonale Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom profilering<em&gt; In-vivo</em&gt; Produceret Bovine præimplantationsembryoner Brug To farve Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse af zebrafisk Kidney Udvikling med Time-lapse Imaging Ved hjælp af en dissektionsmikroskop Udstyret til Optical Sektionsinddeling

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Brug Light Sheet Fluorescens mikroskopi til billede zebrafisk Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodal hierarkisk billeddannelse af serielle sektioner for at finde specifikke cellulære mål inden for store mængder

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Vurdering af lysosomale basisk i tarmen af Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsmæssige analyse af Caenorhabditis elegans kønscelleoverførsel at studere Distribution kerner, proteiner og cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk lys-Sheet mikroskopi og automatiseret celle Lineage analyser til kataloget Caenorhabditis elegans Embryogenesis med Subcellular opløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolering af specifikke neuron populationer fra rundorm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...