Name: 4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy
Uploaded: 2020-10-08T13:00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra Rioja Salud Foundation (Fondos FEDER) og den spanske ministeren de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda er finansiert av et fellesskap fra AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).

1. Vokse C. elegans på Petri retter
<ol><li>Klargjør NGM-plater og frø dem med E. coli OP50 som matkilde (figur 1). Vokse og vedlikeholde C. elegans som beskrevet17. Oppbevar frøplater ved 4 °C i opptil én måned.</li>
	<li>Juster platene til ønsket temperatur før du legger til ormene.<ol>
<li>For å overføre ormene, fjern en del av agar fra en gammel tallerken og legg den på en frisk tallerken.</li>
		<li>Alternativt kan du fange enkeltdyr med en steril ormplukker (et 1-tommers stykke 32-gauge platinatråd med en flatt spiss, montert på spissen av en Pasteur pipette) og plassere dem på den nye platen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vokse ormene ved ønsket temperatur.<ol>
<li>Vokse C. elegans ormer ved 20 °C, standardtemperaturen. Men for å analysere utviklingen av termofølsomme mutanter, utfør en overnatting inkubasjon, vanligvis ved 25 °C. Juster varigheten og temperaturen på denne inkubasjonen etter behov, avhengig av den spesifikke mutanten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Klargjør 4D-mikroskopiopptaket før du monterer embryoene (figur 2)
<ol><li>Sett opp mikroskopet og temperaturkontrollene før du forbereder embryoet. C. elegans embryoer deler seg veldig raskt. Vær forberedt på å begynne å registrere umiddelbart etter montering av embryoene.</li>
	<li>Juster opptakstemperaturen til enten 15 °C, 20 °C eller 25 °C.<ol>
<li>Registrer embryoene rutinemessig ved 25 °C. Registrer termofølsomme mutanter ved den restriktive temperaturen for å vise fenotypene. Registrer en WT-kontroll (hvis det gjøres i et annet preparat) ved samme temperatur som mutantene. MERK: WT-embryoer utvikler seg raskere ved 25 °C og langsommere ved 15 °C uten ytterligere forskjeller i celleavledning. Plasser mikroskoper i et temperaturkontrollert rom. Ytterligere kontroll ved kjøling eller oppvarming av lysbildet er svært ønskelig. Dette kan oppnås ved å sirkulere vann ved en bestemt temperatur gjennom en metallring rundt mikroskopmålet og kondensatoren. Målet og preparatet er i direkte kontakt gjennom nedsenkningsoljen og temperaturoverføringen er effektiv. Dette systemet gir presis kontroll over registreringstemperaturen og for å utføre temperaturskift under embryoutvikling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definer postparameterne i mikroskopiprogramvaren.<ol>
<li>For et standard C. elegans-opptak (uten fluorescerende skanninger) velger du: z-stabler med 30 fokalplan, i en avstand på 1 mikron hver. 30 sekunders intervaller mellom begynnelsen av hver z-stabel. 1500 z-stabler (12,5 timer post). MERK: Både kommersielle og åpen kildekode mikroskop kontrollprogrammer kan brukes til å definere denne arbeidsflyten for å fange bilder. Nå er mikroskopet klart til å ta opp.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Forbered og monter embryoene
<ol><li>Forbered en tynn, homogen agarpute som det første trinnet for å få et fint bilde (figur 3).<ol>
<li>Forbered 50 ml av en 4,5% agaroppløsning i deionisert vann. Varm til koking i mikrobølgeovnen og hell 0,5 - 1 ml i 3 ml glassrør.</li>
		<li>Tett rørene forsiktig med voksfilm for å unngå uttørking. Forseglede agarrør kan lagres ved romtemperatur i opptil to måneder.</li>
		<li>På labbenken, ha en varmeblokk ved 80 °C med: et reagensrør av ren petroleumjell (smeltet), med en fin pensel inni. et reagensrør med destillert vann som inneholder en Pasteur pipette. MERK: Dette sikrer at alle nødvendige materialer blir varme, og agaren vil ikke størkne i ferd med å lage puten.</li>
		<li>Fjern voksfilmen fra toppen av et av agarrørene, og varm den forsiktig over en alkoholbrenner for å smelte agaren. Vær forsiktig da varm agar utvist fra glassrøret kan forårsake brannskader.</li>
		<li>Når agaren er smeltet, plasser røret i varmeblokken for å holde agaren i flytende form.</li>
		<li>Alternativt kan du plassere agarrørene i varmeblokken 1t før eksperimentet for å smelte dem uten å bruke en brenner. Den smeltede agaren skal kastes etter en dag.</li>
		<li>Plasser et mikroskopsklie (skyv A) mellom to andre på et stykke plast.</li>
		<li>Ta et nytt lysbilde (skyv B) og hold det med fingrene i den ene hånden.</li>
		<li>Med den annen side, plasser en liten dråpe smeltet agar i midten av Slide A ved hjelp av den varme Pasteur pipetten.</li>
		<li>Trykk umiddelbart B på agardråpen for å opprette en veldig tynn pute mellom lysbilde A og B. Hold disse lysbildene sammen til trinn 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Monter embryoene.<ol>
<li>Samle 5-10 gravid hermafroditter med plukkeren og plasser dem i en urmaker glass fylt med vann.</li>
		<li>Bruk en skalpell til å kutte opp hermafroditt nematoder og trekke ut tidlige egg (1-4 celler) fra livmoren, under stereomikroskopet.</li>
		<li>Ta lysbildet fra trinn 3.1.10 og skyv forsiktig Skyv B av for å vise agarputen på lysbilde A.</li>
		<li>Legg et tidlig egg i midten av agarputen ved å pipettere med et kapillærrør.</li>
		<li>Alternativt kan du pipette en dråpe som inneholder et sett med embryoer på agarputen og deretter søke etter tidlige embryoer. Gjør dette trinnet under stereomikroskopet.</li>
		<li>Om nødvendig, flytt egget ved å skyve det med en øyenvippe limt til enden av en tannpirker.</li>
		<li>Fjern overflødig vann med kapillærpipetten. MERK: En kapillær pipette kan enkelt tilberedes ved å varme opp en Pasteur pipette over en alkoholbrenner og trekke den fra begge ender.</li>
		<li>Dekk forsiktig preparatet med en dekslelip. For å unngå luftbobler, plasser den ene kanten av dekslene på lysbildet og skyv forsiktig en skalpell langs den tilstøtende kanten for å sakte og skråt drapere dekslene på preparatet.</li>
		<li>Bruk en pipette til å fylle 3/4 av plassen rundt agarputen med vann. La 1/4 av rommet stå med luft.</li>
		<li>Forsegle dekslene med petroleumjell for å unngå uttørking i lange opptaksperioder.</li>
		<li>Bruk den fine børsten til å strekke ut et tynt lag smeltet petroleumjell rundt kanten av dekslene. MERK: Nå er forberedelsen klar for opptak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Juster DIC og start 4D-mikroskopiopptaket
<ol><li>Plasser lysbildet på mikroskopstadiet. Fokuser embryoet ved hjelp av det lave forstørrelsesmålet (5x eller 10x).</li>
	<li>Bytt til 100x nedsenkningsmålet.</li>
	<li>Juster de optiske komponentene i mikroskopet for å få et Nomarski-bilde.<ol>
<li>Fokuser kondensatoren.</li>
		<li>Åpne kondensatoren helt og lukk feltmembranen (dette vil gi en høyere numerisk blenderåpning og derfor større oppløsning).</li>
		<li>Kontroller at begge polarisatorene på mikroskopet er orientert for å forårsake maksimal lysutryddelse.</li>
		<li>Vri Wollaston prisme for å få et fint tredimensjonalt bilde av embryoet, opplyst på den ene siden. Vri prismet i den andre retningen for å få effekten av å få embryoet opplyst på den andre siden. MERK: Disse trinnene kan utføres på en testprøve før opptaket, slik at det bare kreves finjustering på prøven som analyseres.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Start bildeopptaket i mikroskopet.</li>
</ol>5. Analyser 4D-filmen (figur 4).
MERK: Når opptaket er fullført, bruker du programvare for sporing av celleavledning til å rekonstruere og analysere celleavledning.
Cell lineage tracing programvare er et kraftig verktøy for å utføre detaljerte analyser av embryonal utvikling eller dynamikk i cellekulturer eller vev fragmenter. Programmet trekker ut og kvantifiserer flere datasett på prøvens cellulære dynamikk som inkluderer generering av hele cellelinjen til hver registrerte celle, inkludert celledelinger, cellesykluslengde, migrasjon eller apoptose samt kinetikk. I tillegg kan celledifferensiering scores av cellens morfologiske endringer eller ved uttrykk for bestemte markører. I utgangspunktet viser programvareskjermen to vinduer: i venstre vindu kan 4D-filmen spilles fremover og bakover eller opp og ned til enten topp- eller bunnnivåene, slik at hver celle kan følges i tid og rom gjennom hele innspillingen. Til høyre enke genereres cellelinjen. Ved å klikke på en cellekjerne i 4D-filmen genereres et punkt i avstamningsvinduet som lagrer informasjonen om cellenavnet, skjebnen og romlige koordinater. Cellelinjen til en bestemt celle genereres ved å spille 4D-filmen fremover og klikke regelmessig på kjernen for å markere mitose av den spesifikke cellen over tid. Gjentakelse av denne prosessen for hver av de registrerte cellene genererer fullstendig cellelinje av embryoet eller prøven. Den lagrede informasjonen for romlige koordinater for hver celle brukes senere til å rekonstruere 3D-embryomodeller og cellemigrasjonsbaner.
<ol><li>Åpne programvaren for sporing av avstakk og opprett et nytt prosjekt ved å gå til menyen i den øvre linjen og velge: Fil | Nytt prosjekt.</li>
	<li>Velg cellelinjemalen avhengig av opptakstemperaturen: DB08 for opptak ved 25 °C, DB10 for opptak ved 20 °C og DB12 for registrering ved 15 °C.</li>
	<li>Still inn opptaksparametrene i det fremvoksende vinduet: skanneantall (vanligvis 1500), tid mellom skanninger (30 sekunder), nivåantall (30) og avstand mellom nivåer (1 mikron).</li>
	<li>Velg bildefil og format.<ol>
<li>Velg bildekatalogen der bildene ble lagret.</li>
		<li>Velg om bilder skal lagres som enkeltbilder (ett bilde per nivå og tid) eller som z-stabler med flere bilder.</li>
		<li>Bestem filnavn og bildeformat. Enkeltbilder lagres rutinemessig under følgende navn: X0000L00C1 (for skanning 0, nivå 0, kanal 1) X0000L01C1 (for skanning 0, nivå 1, kanal 1) X0000L02C1 (for skanning 0, nivå 2, kanal 1) ... X0001L00C1 (for skanning 1, nivå 0, kanal 1) X0001L01C1 (for skanning 1, nivå 1, kanal 1) ... X0300L04C1 (for skanning 300, nivå 4, kanal 1) ... MERK: Hvis du lagrer bildene i et komprimert format, sparer du plass på harddisken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definer lyskanalene: 1 for DIC-optikk, 2 for GFP, 3 for RFP, etc. Legg til de som ble brukt i 4D-innspillingen. Klikk på "kanalbehandling aktivert" for å oppdage dem.</li>
	<li>Begynn å spore cellelinjen til embryoet. Skjermen inneholder nå to hovedvinduer: videovinduet og cellelinjevinduet.<ol>
<li>I avledningsvinduet velger du en avgren og bruker musen til å klikke cellekjernen som tilsvarer denne cellen i videovinduet.</li>
		<li>Følg cellen romlig og over tid ved å spille av 4D-filmen fremover, bakover eller opp eller ned på et nivå ved hjelp av markørtastene.</li>
		<li>Klikk regelmessig på cellekjernen. Dette genererer et punkt i avstamningsgrenen og registrerer de romlige koordinatene til cellen på dette tidspunktet. Som et resultat utvikler cellelinje, og 3D-rekonstruksjoner av embryoet er mulige.</li>
		<li>Merk mitose ved å klikke på returnøkkelen. Velg deretter en av dattercellene og følg den som før.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gjenta prosessen (trinn 5.6.1 til 5.6.4) for resten av embryonale celler for å spore hele cellelinjen, eller for å følge spesifikke celler av interesse som de som gjennomgår apoptose.</li>
	<li>Sammenlign mutantlinjen med den stereotype WT C. elegans-cellelinjen .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+cell+lineage+tracing+method+for+obtaining+systematic+spatiotemporal+gene+expression+patterns+in+Caenorhabditis+elegans.">A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).</li><li>Nieto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ccz-1+mediates+the+digestion+of+apoptotic+corpses+in+C.+elegans.">ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans.</a> Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).</li><li>Cabello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDR-1/hParkin+negatively+regulates+the+phagocytosis+of+apoptotic+cell+corpses+in+Caenorhabditis+elegans.">PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1120 (2014).</li><li>Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Acetylcholine+Signaling+Reduces+Cell+Clearance+Deficiencies+in+Caenorhabditis+elegans.">Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).</li><li>S&#225;enz-Narciso, B., G&#243;mez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+developmental+networks+by+Rac/Rho+small+GTPases:+How+cytoskeletal+changes+during+embryogenesis+are+orchestrated.">Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated.</a> Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).</li><li>Zheleva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+mRNA+export+unmasks+different+tissue+sensitivities+to+low+mRNA+levels+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development.</a> PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+Embryos+using+an+Epifluorescent+Microscope+and+Open+Source+Software.">Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).</li><li>Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Microscopy+of+Early+Embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).</li><li>Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+neuroblast+formation,+mitotic+domains+and+proneural+gene+expression+during+early+brain+development+in+Drosophila.">The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila.</a> Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).</li><li>Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buccal+capsule+development+as+a+consideration+for+phylogenetic+analysis+of+Rhabditida+(Nemata).">Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata).</a> Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).</li><li>Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cell+lineage+of+the+marine+nematode+Pellioditis+marina.">Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina.</a> Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eutardigrade+Thulinia+stephaniae+has+an+indeterminate+development+and+the+potential+to+regulate+early+blastomere+ablations.">The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations.</a> Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+a+couple+of+dimensions+can+do+for+you:+Comparative+developmental+studies+using+4D+microscopy-examples+from+tardigrade+development.">What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development.</a> Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).</li><li>Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+embryonic-abembryonic+axis+of+the+mouse+blastocyst:+relationships+between+orientation+of+early+cleavage+divisions+and+pattern+of+symmetric/asymmetric+divisions.">Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions.</a> Development. 135 (5), 953-962 (2008).</li><li>Mora-Lorca, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+reductase+gsr-1+is+an+essential+gene+required+for+Caenorhabditis+elegans+early+embryonic+development.">Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

En av de største utfordringene i moderne biologi er å forstå utviklingen av multicellulære organismer. C. elegans har dukket opp som en av de best egnede modellene for å studere den fine koordineringen mellom celleproliferasjon og celledifferensiering i det utviklende embryoet. Fra et optisk synspunkt gjør den gjennomsiktige kroppen og den lille størrelsen denne nematoden til et ideelt eksemplar for DIC-mikroskopi. Andre organismer med lignende egenskaper har også blitt utsatt for 4D-mikroskopianalyse 11,12,13,14,15,16.
For disse utviklingsstudiene gir geninaktivering av enten fremover eller omvendt genetikk en anelse om dens involvering i embryogenese. Når et gen har vist seg å spille en rolle i utviklingen, er neste trinn å definere sin eksakte rolle i etableringen av riktig kroppsplan. Immunostaining er den valgte tilnærmingen for de fleste modeller. Denne teknikken belyser problemer i celledifferensiering eller uttrykk for bestemte markører. En stor begrensning av denne tilnærmingen er imidlertid at den bare gir et statisk syn på uttrykket av en enkelt eller flere markører på et fast tidspunkt i utviklingen. Et dynamisk syn på disse markørene gjennom utviklingen kan bare oppnås ved å farge forskjellige embryoer på forskjellige tidspunkter. I tillegg er cellelinjerekonstruksjon ikke mulig i slike faste prøver.
4D-mikroskopi er en komplementær tilnærming for å studere embryonal utvikling. Denne teknikken viser utviklingsdynamikk ved en cellenivåoppløsning. Enhver feil i embryoet som problemer i spindelorientering, cellemigrasjon, apoptose, celle skjebne spesifikasjon, etc. vil dukke opp i en 4D-film som kan visualiseres fremover og bakover, kvantifisert og scoret av forskeren. Ved hjelp av denne teknikken kan nesten hver celle i embryoet følges opp til det øyeblikket embryoet begynner å bevege seg. Embryoer utsatt for 4D-mikroskopi med bare synlig lys og Nomarski-optikk pådrar seg ikke fotodamage. Fluorescerende skanninger kan også interkaleres i opptaket for å oppdage når og hvor et gen uttrykkes. Embryoer som lider av betydelig fotodamage identifiseres av cellesyklusutvidelsen som forårsaker sterk UV-bestråling sammenlignet med et standard WT-avstamningsembryo. I så fall kan fotodamage reduseres ved å senke UV-lampeintensiteten og øke kameraets følsomhet eller eksponeringstid. Morfologiske egenskaper og molekylære markører kan bidra til å avklare embryonal utvikling av mutant.
Å sette opp et 4D-mikroskopisystem er enkelt å implementere i laboratoriet, og etter en viss praksis muliggjør en uovertruffen analyse av celledynamikk og avstamningssporing av cellekulturer og levende gjennomsiktige prøver på et oppløsningsnivå av hver celle i mikroskopfeltet. Sporing av cellelinje på DIC-bilder behandles fortsatt for hånd. Det er tidkrevende, og selv om programvaren oppdager avledningsfeil som forskjellige avgrener som markerer samme celle, er feil mulig. Mens automatisk deteksjon av GFP-merkede celler er godt utviklet2, er komplementær linjesporingsprogramvare basert på umerkede celler og synlige lysbilder fortsatt i tidlig fase og ikke veldig nyttig for en full embryoanalyse. Uten tvil vil bruk av bildegjenkjenningssystemer til feltet synlig lysmikroskopi føre til et stort fremskritt på dette feltet.

4D-mikroskopi er et multifokalt tidsforløpopptakssystem som gjør det mulig for forskere å registrere og kvantifisere celledynamikken til en biologisk prøve både romlig og over tid. Cellekulturer, gjær eller levende vev kan bli utsatt for 4D-analyse, men denne teknikken er spesielt egnet for å analysere utviklingen av levende embryoer. Oppløsningen av denne analysen når nivået på hver eneste celle i embryoet. Hver celledeling kan oppdages, og cellebevegelser kan spores over tid. Celle skjebner vurderes i henhold til posisjonen og formen som cellene får. Bruken av Nomarski-optikk forbedrer kontrasten til uoppdagede gjennomsiktige prøver ved hjelp av ortogonalt polariserte lysstråler som forstyrrer brennplanet. De resulterende bildene vises tredimensjonale, opplyst på den ene siden.
Andre metoder basert på bruk av konfektmikroskopi og GFP-transgene dyr for automatisk deteksjon av kjerner og generering av celleavstamninger er utviklet 1,2. Fordelen med disse systemene er åpenbar: programvaren overstyrer i stor grad behovet for manuell merking av hver kjerne over en periode (selv om det kreves noe manuell tilsyn i de sene stadiene). Imidlertid forblir cellulære prosesser som involverer endringer i celleform eller membrandynamikk, for eksempel de som forekommer under celledifferensiering, migrasjon, apoptose eller lik engulfment, skjult som en svart bakgrunn i de fluorescerende merkede nukleibildene.
Derimot viser 4D Nomarski mikroskopi (også kalt DIC mikroskopi, Differensial interferenskontrastmikroskopi) både nuklei- og celleformendringer som oppstår under utviklingen av ville eller mutante dyr. Dette tillater sporing av cellelinje ved hjelp av standard mikroskoper, og bruker bare overført lys. Det er ikke noe generelt behov for å bruke transgene dyr bortsett fra å vise spesifikke uttrykksmønstre, i så fall kan fluorescerende skanninger interkaleres. Derfor kan dette være den optimale tilnærmingen for mange laboratorier som arbeider med dynamiske celleprosesser som embryogenese eller apoptose som kan fremheves under DIC-mikroskopi 3,4,5,6,7.
Flere fleksible og brukervennlige programmer er tilgjengelige for å fange mikroskopiske bilder og rekonstruere celleavstamninger, 3D-modeller, cellemigreringsbaner, etc. i den innspilte prøven. I et standardeksperiment blir bilder anskaffet i en rekke fokusplan, i konstant avstand, hvorav antallet avhenger av prøvetykkelsen. Temporal oppløsning av analysen kan optimaliseres ved å øke skannefrekvensen. Det er praktisk talt ingen grense for varigheten av opptaket annet enn datamaskinens lagringskapasitet. For eksempel, for en C. elegans embryoutviklingsanalyse , kjøper vi rutinemessig bilder på 30 fokalplan (1 mikron-trinn hver), hvert 30.
Disse systemene har blitt brukt på analysen av flere animalske embryoer som Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, andre nematode embryoer12,13, tardigrader14,15 og til og med tidlige museembryoer16. Det eneste kravet er å ha et gjennomsiktig embryo i stand til å utvikle seg på glidepreparatet under mikroskopet.
Oppsummert er DIC-basert 4D-mikroskopi spesielt nyttig for 1) analyse av embryonal utvikling av små, gjennomsiktige dyr: sporing av cellelinje, cellemigrasjonsbaner, generering av 3D-modeller, etc; 2) definere genuttrykksmønstre; 3) studere cellekulturdynamikk, fra gjær til menneskelige celler; 4) analysere vevsdynamikk eller embryofragmenter; 5) kvantifisere celle død kinetikk og lik engulfment; og 6) utføre komparativ fylogeni analyse basert på embryonale utviklingsegenskaper. Hvis det er interesse for noen av disse emnene (eller lignende), kan 4D-mikroskopi brukes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (N2)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>N2</td>
			<td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (VZ454)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>VZ454</td>
			<td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lineage Tracing software</td>
			<td>SIMI</td>
			<td>Simi BioCell</td>
			<td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca-R2</td>
			<td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Caenotec</td>
			<td>Time to Live</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel 
			Kleine Dorfstr. 9 38312 B&#246;r&#223;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica DM6000</td>
			<td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

4D-mikroskopi er et uvurderlig verktøy for å løse opp den embryonale utviklingsprosessen hos forskjellige dyr. I løpet av de siste tiårene har Caenorhabditis elegans dukket opp som en av de beste modellene for å studere utvikling. Fra et optisk synspunkt gjør dens størrelse og gjennomsiktige kropp denne nematoden til en ideell prøve for DIC (Differential Interference Contrast eller Nomarski) mikroskopi. Denne artikkelen illustrerer en protokoll for dyrking av C. elegans nematoder, forbereder og monterer sine embryoer, utfører 4D-mikroskopi og sporing av celleavstamning. Metoden er basert på multifokale time-lapse poster av Nomarski bilder og analyse med spesifikk programvare. Denne teknikken avslører embryonal utviklingsdynamikk på cellenivå. Enhver embryonal defekt i mutanter, for eksempel problemer i spindelorientering, cellemigrasjon, apoptose eller celle skjebnespesifikasjon, kan effektivt oppdages og scores. Nesten hver eneste celle i embryoet kan følges opp til det øyeblikket embryoet begynner å bevege seg. Sporing av hele cellelinjen til et C. elegans embryo av 4D DIC mikroskopi er arbeidskrevende, men bruken av spesifikk programvare letter i stor grad denne oppgaven. I tillegg er denne teknikken lett å implementere i laboratoriet. 4D-mikroskopi er et allsidig verktøy og åpner muligheten for å utføre en enestående analyse av embryonal utvikling.

Å karakterisere embryonal utvikling av en C. elegans mutant for gen gsr-1, som koder enzymet glutathione redductase, som kreves for å regenerere redusert glutathione (GSH) og involvert i å opprettholde redoks homeostase i nematoden, utførte vi 4D-mikroskopi av en gsr-1 (tm3574) sletting mutant som er tap av funksjon allele forårsaker en tidlig embryonal arrest fenotype18. Både WT og balansert gsr-1 (tm3574) mutant C. elegans nematoder ble dyrket på NGM-plater frøet med E. coli OP50 som matkilde17. gsr-1 (tm3574) ormer ble dyrket som heterozygot ved 20 °C i to generasjoner og deretter segregerende homozygote ormer (som er i stand til å vokse opp til voksen alder takket være mors belastning) ble skiftet til 25 °C for en inkubering over natten før embryoanalyse. Ormeplater ble inkubert i pappesker for å unngå kondens (figur 1). Gravide nematoder ble kuttet åpen for å trekke ut unge embryoer.
For å sammenligne embryonal utvikling av mutanten kontra den stereotype WT under identiske forhold, ble en WT (som kontroll) og et gsr-1 (tm3574) embryo plassert på samme preparat ved siden av hverandre. 4D-mikroskopisk arbeidsflyt ble kjørt på et standard motorisert oppreist mikroskop utstyrt med DIC-optikk. De valgte opptaksparametrene på mikroskopkontrollprogrammet var: z-stabler med 30 brennvidder med 1 mikronavstand hver, 30 sekunders intervaller mellom begynnelsen av hver z-stabel og 1500 z-stabler (12,5 timers opptak). Opptakstemperaturen ble justert til 25 °C (både i rommet og på mikroskopstadiet) (figur 2).
Når opptaket var fullført, ble bildefilen åpnet, og cellelinje ble rekonstruert ved hjelp av avledningssporingsprogramvare ved å klikke på cellekjerner som vises i videovinduet (figur 4). Den sporede gsr-1 (tm3574) mutant embryonale cellelinjen ble sammenlignet med C. elegans WT-avstamning avbildet i bakgrunnen. Et viktig resultat var påvisning av en progressiv forsinkelse av cellesyklusen under embryonal utvikling. Som en konsekvens ble mutante embryoer arrestert i mellomliggende stadier mens WT-embryoer utviklet seg og til slutt klekket ut som larver.
Forberedelse og direkte observasjon av embryoer under mikroskopet eller immunostaining med antistoffer mot sene embryonale markører kan avsløre tilstedeværelsen av en høy prosentandel av unge embryoer i mutanten sammenlignet med WT. Embryo-arrestasjonen kan da utledes som den mest sannsynlige forklaringen. Imidlertid kan direkte bevis og nøyaktig kvantifisering av cellesyklusforsinkelsen bare vises elegant og enkelt og kvantifiseres gjennom et 4D-mikroskopieksperiment. Andre viktige trekk ved embryonal utvikling som celledifferensiering eller apoptose (figur 5) kan også visualiseres på en dynamisk måte ved hjelp av 4D-mikroskopi som gir en detaljert analyse av flere aspekter ved utvikling i et enkelt eksperiment.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> Figur 1: C. elegans nematoder vokser under laboratorieforhold. Nematoder dyrkes på E. coli-seeded NGM-plater, lagret i pappesker og inkuberes enten ved 15 °C, 20 °C eller 25 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> Figur 2: Skjermbilde av 4D-mikroskopiopptaksprogramvare. Eksempel på to forskjellige mikroskopkontrollprogrammer (A og B). Disse programmene lager arbeidsflyter for å kontrollere mikroskopet og bildeopptaket under 4D-mikroskopiopptak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> Figur 3: Serielle fotografier av agarputeforberedelse og montering av C. elegans-embryoet som vises. A. Forberedte agarrør. B-C. Forberedelse av agar pad. D. Skyv delvis fylt med vann. E. Forsegle lysbildet med petroleumjell. F. Endelig forberedelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> Figur 4: Seriebilder av sporingsprogramvare for celleavledning. Programmet tillater rekonstruksjon av embryonal cellelinje av en celle syklus forsinkelse mutant (venstre) og en WT (høyre) C. elegans embryo. En. Et tidlig skritt i utviklingen. B-C. Utviklingen av begge embryoene utvikler seg over tid. D. WT embryo utvikler seg riktig og starter forlengelse mens mutanten arresterer. I alle tilfeller viser programmet videovinduet og avledningsvinduet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> Figur 5: Linse refractile form av apoptotiske celler i en C. elegans WT embryo. Celle skjebne, definert av morfologiske egenskaper, kan vurderes ved 4D mikroskopi. Bildet viser et C. elegans embryo i bønnestadiet . Levende celler viser glattformede kjerner omgitt av en granulær cytoplasma. I motsetning til dette kondenserer apoptotiske celler (gule piler) og vedtar en linselignende, refraktil form. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Her presenterer vi en protokoll for å forberede og montere Caenorhabditis elegans embryoer, registrere utvikling under et 4D-mikroskop og spore cellelinje.

4D Mikroskopi: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development ved hjelp av Nomarski Mikroskopi

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Helhetlig vurdering av kimbane Chemical Toxicity Bruke Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analyse av cardiomyocyte Development hjelp Immunfluorescens i Embryonic Mouse Hjerte

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom profilering av<em&gt; In-Vivo</em&gt; Produserte Bovine Pre-implantasjon Embryoet ved hjelp av to-farge microarray plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse av Sebrafisk Nyre Development med Time-lapse Imaging Ved hjelp av en dissekere mikroskop Utstyrt for Optical Seksjonering

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Ved hjelp av lys Sheet Fluorescensmikroskopi til bilde Sebrafisk Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Flere hierarkisk Imaging av føljetong delene for å finne konkrete mobilnettet mål i store volumer

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Vurdere lysosomale Alkalinization i tarmen Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropic lys-ark mikroskopi og automatisert Cell Lineage analyser til katalog Caenorhabditis elegans embryogenesis med Subcellulære oppløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolering av spesifikke Nevron populasjoner fra roundworm Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...