Name: 4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy
Uploaded: 2020-10-08T13:00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

Los autores desean agradecer el apoyo de la Fundación Rioja Salud (Fondos FEDER) y del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Beca PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda está financiada por una beca de la AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).

1. Cultiva C. elegans en placas de Petri
<ol><li>Preparar platos NGM y sembrarlos con E. coli OP50 como fuente de alimento (Figura 1). Cultivar y mantener C. elegans como se describe17. Guarde las placas de semillas a 4 °C durante un máximo de un mes.</li>
	<li>Ajuste las placas a la temperatura deseada antes de agregar los gusanos.<ol>
<li>Para transferir los gusanos, retire un trozo de agar de un plato viejo y colóquelo en un plato fresco.</li>
		<li>Alternativamente, capture animales individuales con un recolector de gusanos estéril (una pieza de 1 pulgada de alambre de platino de calibre 32 con una punta aplanada, montada en la punta de una pipeta Pasteur) y colóquelos en la nueva placa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultive los gusanos a la temperatura deseada.<ol>
<li>Cultive gusanos C. elegans a 20 °C, la temperatura estándar. Sin embargo, para analizar el desarrollo de mutantes termosensibles, realice una incubación nocturna, generalmente a 25 ° C. Ajuste la duración y la temperatura de esta incubación según sea necesario, dependiendo del mutante específico.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Preparar el registro de microscopía 4D antes de montar los embriones (Figura 2)
<ol><li>Configure el microscopio y los controles de temperatura antes de preparar el embrión. Los embriones de C. elegans se dividen muy rápidamente. Prepárese para comenzar a grabar inmediatamente después de montar los embriones.</li>
	<li>Ajuste la temperatura de registro a 15 °C, 20 °C o 25 °C.<ol>
<li>Registre rutinariamente los embriones a 25 °C. Registre mutantes termosensibles a la temperatura restrictiva para mostrar sus fenotipos. Registre un control WT (si se realiza en una preparación diferente) a la misma temperatura que los mutantes. NOTA: Los embriones WT se desarrollan más rápido a 25 °C y más lento a 15 °C sin diferencias adicionales en el linaje celular. Coloque los microscopios en una habitación con temperatura controlada. El control adicional mediante el enfriamiento o el calentamiento de la corredera es muy deseable. Esto se puede lograr haciendo circular el agua a una temperatura específica a través de un anillo de metal alrededor del objetivo del microscopio y el condensador. El objetivo y la preparación están en contacto directo a través del aceite de inmersión y la transferencia de temperatura es eficiente. Este sistema permite un control preciso de la temperatura de registro y la realización de cambios de temperatura durante el desarrollo embrionario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Defina los parámetros de registro en el software de microscopía.<ol>
<li>Para una grabación estándar de C. elegans (sin escaneos fluorescentes), seleccione: z-stacks de 30 planos focales, a una distancia de 1 micra cada uno. Intervalos de 30 segundos entre el comienzo de cada pila z. 1500 z-stacks (12,5 horas de registro). NOTA: Tanto los programas de control de microscopios comerciales como los de código abierto se pueden utilizar para definir este flujo de trabajo para capturar imágenes. Ahora el microscopio está listo para grabar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Preparar y montar los embriones
<ol><li>Prepare una almohadilla de agar delgada y homogénea como primer paso para obtener una imagen agradable (Figura 3).<ol>
<li>Preparar 50 ml de una solución de agar al 4,5% en agua desionizada. Calentar hasta hervir en el microondas y verter 0,5 – 1 ml en tubos de vidrio de 3 ml.</li>
		<li>Selle cuidadosamente los tubos con película de cera para evitar la desecación. Los tubos de agar sellados se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta por dos meses.</li>
		<li>En el banco de laboratorio, tenga un bloque de calor a 80 ° C con: un tubo de ensayo de vaselina pura (derretida), con un pincel fino en su interior. un tubo de ensayo con agua destilada que contiene una pipeta Pasteur. NOTA: Esto asegura que todos los materiales requeridos estarán calientes y que el agar no se solidificará en el proceso de fabricación de la almohadilla.</li>
		<li>Retire la película de cera de la parte superior de uno de los tubos de agar y caliéntela cuidadosamente sobre un quemador de alcohol para derretir el agar. Tenga cuidado ya que el agar caliente expulsado del tubo de vidrio podría causar quemaduras.</li>
		<li>Una vez que el agar se derrita, coloque el tubo en el bloque de calor para mantener el agar en forma líquida.</li>
		<li>Alternativamente, coloque los tubos de agar en el bloque de calor 1 hora antes del experimento para derretirlos sin usar un quemador. El agar derretido debe desecharse después de un día.</li>
		<li>Coloque un portaobjetos de microscopio (diapositiva A) entre otros dos sobre un trozo de plástico.</li>
		<li>Tome otra diapositiva (diapositiva B) y sosténgala con los dedos en una mano.</li>
		<li>Por otro lado, coloque una pequeña gota de agar derretido en el centro de la diapositiva A utilizando la pipeta caliente Pasteur.</li>
		<li>Presione inmediatamente la diapositiva B sobre la gota de agar para crear una almohadilla muy delgada entre las diapositivas A y B. Mantenga estas diapositivas intercaladas hasta el paso 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montar los embriones.<ol>
<li>Recoge 5-10 hermafroditas grávidas con el recolector y colócalas en un vaso relojero lleno de agua.</li>
		<li>Use un bisturí para abrir los nematodos hermafroditas y extraer los óvulos tempranos (1-4 células) del útero, debajo del estereomicroscopio.</li>
		<li>Tome la diapositiva del paso 3.1.10 y deslice suavemente la diapositiva B para exponer la almohadilla de agar en la diapositiva A.</li>
		<li>Coloque un huevo temprano en el centro de la almohadilla de agar pipeteando con un tubo capilar.</li>
		<li>Alternativamente, pipetee una gota que contenga un conjunto de embriones en la almohadilla de agar y luego busque embriones en etapa temprana. Haga este paso debajo del estereomicroscopio.</li>
		<li>Si es necesario, mueva el huevo empujándolo con una pestaña pegada al extremo de un palillo de dientes.</li>
		<li>Retire el exceso de agua con la pipeta capilar. NOTA: Una pipeta capilar se puede preparar fácilmente calentando una pipeta Pasteur sobre un quemador de alcohol y tirando de ella de ambos extremos.</li>
		<li>Cubra cuidadosamente la preparación con un cubrebocas. Para evitar burbujas de aire, coloque un borde de la cubierta en la corredera y deslice suavemente un bisturí a lo largo del borde adyacente para cubrir lenta y oblicuamente la cubierta sobre la preparación.</li>
		<li>Use una pipeta para llenar 3/4 del espacio que rodea la almohadilla de agar con agua. Deje 1/4 del espacio con aire.</li>
		<li>Selle el estuche con vaselina para evitar la desecación durante largos períodos de registro.</li>
		<li>Use el cepillo fino para extender una capa delgada de vaselina derretida alrededor del borde de la cubierta. NOTA: Ahora la preparación está lista para la grabación.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Ajuste el DIC e inicie la grabación de microscopía 4D
<ol><li>Coloque el portaobjetos en el escenario del microscopio. Enfocar el embrión usando el objetivo de bajo aumento (5x o 10x).</li>
	<li>Cambie al objetivo de inmersión 100x.</li>
	<li>Ajuste los componentes ópticos del microscopio para obtener una imagen de Nomarski.<ol>
<li>Enfoca el condensador.</li>
		<li>Abra completamente la apertura del condensador y cierre el diafragma de campo (esto proporcionará una mayor apertura numérica y, por lo tanto, una mayor resolución).</li>
		<li>Compruebe que ambos polarizadores en el microscopio están orientados a causar la máxima extinción de la luz.</li>
		<li>Gire el prisma de Wollaston para obtener una bonita imagen tridimensional del embrión, iluminada por un lado. Gire el prisma en la otra dirección para obtener el efecto de tener el embrión iluminado en el otro lado. NOTA: Estos pasos se pueden realizar en una muestra de prueba antes de la grabación para que solo se requiera un ajuste fino en la muestra que se está analizando.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inicie la captura de imagen en el microscopio.</li>
</ol>5. Analice la película 4D (Figura 4).
NOTA: Una vez completada la grabación, utilice el software de rastreo de linaje celular para reconstruir y analizar el linaje celular.
El software de rastreo de linaje celular es una herramienta poderosa para realizar análisis detallados del desarrollo o la dinámica embrionaria en cultivos celulares o fragmentos de tejido. El programa extrae y cuantifica varios conjuntos de datos sobre la dinámica celular de la muestra que incluyen la generación del linaje celular completo de todas y cada una de las células registradas, incluidas las divisiones celulares, la duración del ciclo celular, la migración o la apoptosis, así como su cinética. Además, la diferenciación celular puede ser puntuada por los cambios morfológicos de la célula o por la expresión de marcadores específicos. Básicamente, la pantalla del software muestra dos ventanas: en la ventana izquierda, la película 4D se puede reproducir hacia adelante y hacia atrás o hacia arriba y hacia abajo a los niveles superior o inferior para que cada celda se pueda seguir en tiempo y espacio a lo largo de la grabación. En la viuda derecha, se genera el linaje celular. Al hacer clic en un núcleo celular en la película 4D se genera un punto en la ventana de linaje que almacena la información del nombre de la celda, el destino y las coordenadas espaciales. El linaje celular de una célula específica se genera reproduciendo la película 4D hacia adelante y haciendo clic periódicamente en el núcleo para marcar la mitosis de esa célula específica a lo largo del tiempo. La repetición de este proceso para cada una de las células registradas genera el linaje celular completo del embrión o muestra. La información almacenada para las coordenadas espaciales de cada célula se utiliza posteriormente para reconstruir modelos embrionarios 3D y rutas de migración celular.
<ol><li>Abra el software de rastreo de linaje y cree un nuevo proyecto yendo al menú de la barra superior y seleccionando: | de archivos Nuevo proyecto.</li>
	<li>Seleccione la plantilla de linaje celular en función de la temperatura de grabación: DB08 para grabar a 25 °C, DB10 para grabar a 20 °C y DB12 para grabar a 15 °C.</li>
	<li>Establezca los parámetros de grabación en la ventana emergente: recuento de escaneo (generalmente 1500), tiempo entre escaneos (30 segundos), recuento de niveles (30) y distancia entre niveles (1 micra).</li>
	<li>Seleccione el archivo de imagen y el formato.<ol>
<li>Seleccione el directorio de imágenes donde se guardaron las imágenes.</li>
		<li>Elija si las imágenes deben guardarse como imágenes individuales (una imagen por nivel y tiempo) o como pilas z de varias imágenes.</li>
		<li>Determine el nombre del archivo y el formato de la imagen. Rutinariamente, las imágenes individuales se guardan bajo los siguientes nombres: X0000L00C1 (para escaneo 0, nivel 0, canal 1) X0000L01C1 (para escaneo 0, nivel 1, canal 1) X0000L02C1 (para escaneo 0, nivel 2, canal 1) ... X0001L00C1 (para escaneo 1, nivel 0, canal 1) X0001L01C1 (para escaneo 1, nivel 1, canal 1) ... X0300L04C1 (para escaneo 300, nivel 4, canal 1) ... NOTA: Guardar las imágenes en un formato comprimido ahorra espacio en el disco duro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definir los canales de luz: 1 para óptica DIC, 2 para GFP, 3 para RFP, etc. Agregue los que se usaron en la grabación 4D. Haga clic en "procesamiento de canal habilitado" para detectarlos.</li>
	<li>Comience a rastrear el linaje celular del embrión. La pantalla ahora contiene dos ventanas principales: la ventana de video y la ventana de linaje de celdas.<ol>
<li>En la ventana de linaje, seleccione una rama de linaje y utilice el ratón para hacer clic en el núcleo de celda correspondiente a esta celda en la ventana de vídeo.</li>
		<li>Siga la celda espacialmente y a lo largo del tiempo reproduciendo la película 4D hacia adelante, hacia atrás o hacia arriba o hacia abajo en un nivel, utilizando las teclas del cursor.</li>
		<li>Haga clic periódicamente en el núcleo celular. Esto genera un punto en la rama del linaje y registra las coordenadas espaciales de la célula en este momento. Como resultado, el linaje celular progresa y las reconstrucciones 3D del embrión son posibles.</li>
		<li>Marque la mitosis haciendo clic en la tecla de retorno. A continuación, seleccione una de las celdas hijas y sígala como antes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita el proceso (pasos 5.6.1 a 5.6.4) para que el resto de las células embrionarias rastreen el linaje celular completo, o para seguir células específicas de interés como las que sufren apoptosis.</li>
	<li>Compare el linaje mutante con el linaje celular estereotipado wt C. elegans .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+cell+lineage+tracing+method+for+obtaining+systematic+spatiotemporal+gene+expression+patterns+in+Caenorhabditis+elegans.">A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).</li><li>Nieto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ccz-1+mediates+the+digestion+of+apoptotic+corpses+in+C.+elegans.">ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans.</a> Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).</li><li>Cabello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDR-1/hParkin+negatively+regulates+the+phagocytosis+of+apoptotic+cell+corpses+in+Caenorhabditis+elegans.">PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1120 (2014).</li><li>Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Acetylcholine+Signaling+Reduces+Cell+Clearance+Deficiencies+in+Caenorhabditis+elegans.">Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).</li><li>S&#225;enz-Narciso, B., G&#243;mez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+developmental+networks+by+Rac/Rho+small+GTPases:+How+cytoskeletal+changes+during+embryogenesis+are+orchestrated.">Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated.</a> Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).</li><li>Zheleva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+mRNA+export+unmasks+different+tissue+sensitivities+to+low+mRNA+levels+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development.</a> PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+Embryos+using+an+Epifluorescent+Microscope+and+Open+Source+Software.">Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).</li><li>Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Microscopy+of+Early+Embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).</li><li>Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+neuroblast+formation,+mitotic+domains+and+proneural+gene+expression+during+early+brain+development+in+Drosophila.">The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila.</a> Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).</li><li>Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buccal+capsule+development+as+a+consideration+for+phylogenetic+analysis+of+Rhabditida+(Nemata).">Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata).</a> Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).</li><li>Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cell+lineage+of+the+marine+nematode+Pellioditis+marina.">Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina.</a> Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eutardigrade+Thulinia+stephaniae+has+an+indeterminate+development+and+the+potential+to+regulate+early+blastomere+ablations.">The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations.</a> Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+a+couple+of+dimensions+can+do+for+you:+Comparative+developmental+studies+using+4D+microscopy-examples+from+tardigrade+development.">What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development.</a> Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).</li><li>Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+embryonic-abembryonic+axis+of+the+mouse+blastocyst:+relationships+between+orientation+of+early+cleavage+divisions+and+pattern+of+symmetric/asymmetric+divisions.">Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions.</a> Development. 135 (5), 953-962 (2008).</li><li>Mora-Lorca, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+reductase+gsr-1+is+an+essential+gene+required+for+Caenorhabditis+elegans+early+embryonic+development.">Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Uno de los principales desafíos en la biología moderna es comprender el desarrollo de organismos multicelulares. C. elegans se ha convertido en uno de los modelos más adecuados para estudiar la coordinación fina entre la proliferación celular y la diferenciación celular en el embrión en desarrollo. Desde un punto de vista óptico, su cuerpo transparente y su pequeño tamaño hacen de este nematodo un espécimen ideal para la microscopía DIC. Otros organismos con características similares también han sido sometidos a análisis de microscopía 4D 11,12,13,14,15,16.
Para esos estudios de desarrollo, la inactivación de genes por genética directa o inversa proporciona una pista de su participación en la embriogénesis. Una vez que se ha demostrado que un gen desempeña un papel en el desarrollo, el siguiente paso es definir su papel exacto en el establecimiento del plan corporal correcto. La inmunotinción es el enfoque seleccionado para la mayoría de los modelos. Esta técnica dilucida problemas en la diferenciación celular o expresión de marcadores específicos. Sin embargo, una limitación importante de este enfoque es que solo proporciona una vista estática de la expresión de uno o más marcadores en un punto fijo en el desarrollo. Una visión dinámica de estos marcadores a lo largo del desarrollo solo se puede obtener tiñendo diferentes embriones en diferentes puntos temporales. Además, la reconstrucción del linaje celular no es posible en tales muestras fijas.
La microscopía 4D es un enfoque complementario para estudiar el desarrollo embrionario. Esta técnica revela la dinámica de desarrollo a una resolución a nivel celular. Cualquier defecto en el embrión, como problemas en la orientación del huso, migración celular, apoptosis, especificación del destino celular, etc., aparecerá en una película 4D que puede ser visualizada hacia adelante y hacia atrás, cuantificada y calificada por el investigador. Usando esta técnica, prácticamente todas y cada una de las células del embrión pueden ser seguidas hasta el momento en que el embrión comienza a moverse. Los embriones sometidos a microscopía 4D con solo luz visible y óptica Nomarski no incurren en fotodaño. Las exploraciones fluorescentes también se pueden intercalar dentro de la grabación para detectar cuándo y dónde se expresa un gen. Los embriones que sufren fotodaño significativo se identifican por la extensión del ciclo celular que causa una fuerte irradiación UV en comparación con un embrión estándar de linaje WT. En ese caso, el fotodaño se puede reducir reduciendo la intensidad de la lámpara UV y aumentando la sensibilidad de la cámara o el tiempo de exposición. Las características morfológicas y los marcadores moleculares pueden ayudar a aclarar el desarrollo embrionario de cualquier mutante.
La configuración de un sistema de microscopía 4D es fácil de implementar en el laboratorio y, después de un poco de práctica, permite un análisis inigualable de la dinámica celular y el rastreo de linaje de cultivos celulares y muestras transparentes vivas a un nivel de resolución de todas y cada una de las células en el campo del microscopio. El rastreo del linaje celular en imágenes DIC todavía se procesa a mano. Lleva mucho tiempo y, aunque el software detecta errores de linaje, como diferentes ramas de linaje que marcan la misma celda, los errores son posibles. Si bien la detección automática de células marcadas con GFP está bien desarrollada2, el software complementario de rastreo de linaje basado en células no marcadas e imágenes de luz visible aún se encuentra en la etapa inicial y no es realmente útil para un análisis embrionario completo. Sin lugar a dudas, la aplicación de sistemas de reconocimiento de imágenes al campo de la microscopía de luz visible supondrá un gran avance en este campo.

La microscopía 4D es un sistema multifocal de registro de lapso de tiempo que permite a los investigadores registrar y cuantificar la dinámica celular de una muestra biológica tanto espacialmente como a lo largo del tiempo. Los cultivos celulares, levaduras o tejidos vivos pueden ser sometidos a análisis 4D pero esta técnica es especialmente adecuada para analizar el desarrollo de embriones vivos. La resolución de este análisis alcanza el nivel de cada célula del embrión. Cada división celular puede ser detectada, y los movimientos celulares pueden ser rastreados a lo largo del tiempo. Los destinos celulares se evalúan de acuerdo con la posición y la forma que adquieren las células. El uso de la óptica Nomarski mejora el contraste de muestras transparentes no teñidas utilizando haces de luz polarizados ortogonalmente que interfieren en el plano focal. Las imágenes resultantes aparecen tridimensionales, iluminadas en un lado.
Se han desarrollado otros métodos basados en el uso de microscopía confocal y animales transgénicos GFP para la detección automática de núcleos y generación de linajes celulares 1,2. La ventaja de esos sistemas es obvia: el software anula en gran medida la necesidad de marcar manualmente cada núcleo durante un período de tiempo (aunque se requiere cierta supervisión manual durante las últimas etapas). Sin embargo, los procesos celulares que implican cambios en la forma celular o la dinámica de la membrana, como los que ocurren durante la diferenciación celular, la migración, la apoptosis o el envolvimiento de cadáveres, permanecen ocultos como un fondo negro en las imágenes de núcleos marcados con fluorescentes.
En contraste, la microscopía 4D Nomarski (también llamada microscopía DIC, microscopía de contraste de interferencia diferencial) muestra cambios en la forma de los núcleos y las células que ocurren durante el desarrollo de animales de tipo salvaje o mutantes. Esto permite el rastreo del linaje celular utilizando microscopios estándar, empleando solo luz transmitida. No hay necesidad general de utilizar animales transgénicos, excepto para mostrar patrones de expresión específicos, en cuyo caso se pueden intercalar las exploraciones fluorescentes. Por lo tanto, este podría ser el enfoque óptimo para muchos laboratorios que trabajan en procesos celulares dinámicos como la embriogénesis o la apoptosis que se pueden destacar bajo la microscopía DIC 3,4,5,6,7.
Varios programas flexibles y fáciles de usar están disponibles para capturar imágenes microscópicas y reconstruir linajes celulares, modelos 3D, rutas de migración celular, etc. en la muestra grabada. En un experimento estándar, las imágenes se adquieren en una serie de planos focales, a una distancia constante, cuyo número depende del grosor de la muestra. La resolución temporal del análisis se puede optimizar aumentando la frecuencia de escaneo. Prácticamente no hay límite para la duración de la grabación que no sea la capacidad de almacenamiento de la computadora. Por ejemplo, para un análisis de desarrollo embrionario de C. elegans , adquirimos rutinariamente imágenes en 30 planos focales (1 micrón-paso cada uno), cada 30 segundos durante 12 horas.
Estos sistemas se han aplicado al análisis de varios embriones animales como Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, otros embriones de nematodos12,13, tardígrados14,15 e incluso embriones tempranos de ratón16. El único requisito es tener un embrión transparente capaz de desarrollarse en la preparación del portaobjetos bajo el microscopio.
En resumen, la microscopía 4D basada en DIC es especialmente útil para 1) analizar el desarrollo embrionario de animales pequeños y transparentes: rastrear linaje celular, rutas de migración celular, generar modelos 3D, etc;; 2) definir patrones de expresión génica; 3) estudiar la dinámica del cultivo celular, desde la levadura hasta las células humanas; 4) analizar la dinámica tisular o fragmentos embrionarios; 5) cuantificar la cinética de muerte celular y el envolvimiento de cadáveres; y 6) realizar análisis comparativos de filogenia basados en las características del desarrollo embrionario. Si hay interés en alguno de estos temas (o similares), se puede utilizar la microscopía 4D.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (N2)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>N2</td>
			<td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (VZ454)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>VZ454</td>
			<td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lineage Tracing software</td>
			<td>SIMI</td>
			<td>Simi BioCell</td>
			<td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca-R2</td>
			<td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Caenotec</td>
			<td>Time to Live</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel 
			Kleine Dorfstr. 9 38312 B&#246;r&#223;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica DM6000</td>
			<td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

La microscopía 4D es una herramienta invaluable para desentrañar el proceso de desarrollo embrionario en diferentes animales. En las últimas décadas, Caenorhabditis elegans se ha convertido en uno de los mejores modelos para estudiar el desarrollo. Desde un punto de vista óptico, su tamaño y cuerpo transparente hacen de este nematodo un espécimen ideal para microscopía DIC (Differential Interference Contrast o Nomarski). Este artículo ilustra un protocolo para cultivar nematodos de C. elegans , preparar y montar sus embriones, realizar microscopía 4D y rastreo de linaje celular. El método se basa en registros de lapso de tiempo multifocales de imágenes de Nomarski y análisis con software específico. Esta técnica revela la dinámica del desarrollo embrionario a nivel celular. Cualquier defecto embrionario en los mutantes, como problemas en la orientación del huso, la migración celular, la apoptosis o la especificación del destino celular, se puede detectar y puntuar de manera eficiente. Prácticamente todas las células del embrión pueden ser seguidas hasta el momento en que el embrión comienza a moverse. Rastrear el linaje celular completo de un embrión de C. elegans mediante microscopía 4D DIC es laborioso, pero el uso de software específico facilita enormemente esta tarea. Además, esta técnica es fácil de implementar en el laboratorio. La microscopía 4D es una herramienta versátil y abre la posibilidad de realizar un análisis sin igual del desarrollo embrionario.

Para caracterizar el desarrollo embrionario de un mutante de C. elegans para el gen gsr-1, que codifica la enzima glutatión reductasa, requerida para regenerar el glutatión reducido (GSH) e implicada en el mantenimiento de la homeostasis redox en el nematodo, se realizó microscopía 4D de un mutante de deleción gsr-1 (tm3574) que es un alelo de pérdida de función que causa un fenotipo18 de paro embrionario temprano. Tanto los nematodos C. elegans mutantes WT como Gsr-1 (tm3574) se cultivaron en placas NGM sembradas con E. coli OP50 como fuente de alimento17. Los gusanos gsr-1 (tm3574) se cultivaron como heterocigotos a 20 ° C durante dos generaciones y luego los gusanos homocigotos segregantes (que pueden crecer hasta la edad adulta gracias a la carga materna) se cambiaron a 25 ° C para una incubación nocturna antes del análisis embrionario. Las placas de gusano se incubaron dentro de cajas de cartón para evitar la condensación (Figura 1). Los nematodos grávidos se abrieron para extraer embriones jóvenes.
Para comparar el desarrollo embrionario del mutante versus el WT estereotipado en condiciones idénticas, se colocaron un WT (como control) y un embrión gsr-1 (tm3574) en la misma preparación uno al lado del otro. El flujo de trabajo de microscopía 4D se ejecutó en un microscopio vertical motorizado estándar equipado con óptica DIC. Los parámetros de grabación seleccionados en el programa de control del microscopio fueron: pilas z de 30 planos focales a una distancia de 1 micra cada una, intervalos de 30 segundos entre el comienzo de cada pila z y 1500 pilas z (12,5 horas de grabación). La temperatura de registro se ajustó a 25 °C (tanto en la sala como en la etapa del microscopio) (Figura 2).
Una vez que se completó la grabación, se abrió el archivo de imágenes y se reconstruyó el linaje celular utilizando el software de rastreo de linaje haciendo clic en los núcleos celulares que se muestran en la ventana de video (Figura 4). El linaje de células embrionarias mutantes gsr-1 (tm3574) trazado se comparó con el linaje C. elegans WT representado en el fondo. Un resultado importante fue la detección de un retraso progresivo del ciclo celular durante el desarrollo embrionario. Como consecuencia, los embriones mutantes se detuvieron en etapas intermedias, mientras que los embriones WT progresaron y finalmente eclosionaron como larvas.
La preparación y observación directa de embriones bajo el microscopio o la inmunotinción con anticuerpos contra marcadores embrionarios tardíos podría revelar la presencia de un alto porcentaje de embriones jóvenes en el mutante en comparación con el WT. La detención embrionaria podría inferirse como la explicación más plausible. Sin embargo, la prueba directa y la cuantificación exacta del retraso del ciclo celular solo se pueden mostrar y cuantificar de manera elegante y fácil a través de un experimento de microscopía 4D. Otras características importantes del desarrollo embrionario como la diferenciación celular o la apoptosis (Figura 5) también se pueden visualizar de forma dinámica mediante microscopía 4D que ofrece un análisis detallado de múltiples aspectos del desarrollo en un solo experimento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> Figura 1: Nematodos de C. elegans que crecen en condiciones de laboratorio. Los nematodos se cultivan en placas NGM con semillas de E. coli, se almacenan en cajas de cartón y se incuban a 15 ° C, 20 ° C o 25 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> Figura 2: Captura de pantalla del software de grabación de microscopía 4D. Ejemplo de dos programas de software de control de microscopio diferentes (A y B). Estos programas crean flujos de trabajo para controlar el microscopio y la captura de imágenes durante la grabación de microscopía 4D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> Figura 3: Muestra de fotografías seriadas de la preparación y montaje de la almohadilla de agar del embrión de C. elegans . A. Tubos de agar preparados. B-C. Preparación de la almohadilla de agar. D. Tobogán parcialmente lleno de agua. E. Sellado del portaobjetos con vaselina. F. Preparación final. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> Figura 4: Capturas de pantalla en serie del software de rastreo de linaje celular. El programa permite la reconstrucción del linaje celular embrionario de un mutante de retraso del ciclo celular (izquierda) y un embrión WT (derecha) de C. elegans . Un. Un primer paso del desarrollo. B-C. El desarrollo de ambos embriones progresa con el tiempo. D. El embrión WT se desarrolla adecuadamente y comienza el alargamiento, mientras que el mutante se detiene. En todos los casos, el programa muestra la ventana de video y la ventana de linaje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> Figura 5: Forma refractaria de lentejas de células apoptóticas en un embrión de C. elegans WT. El destino celular, definido por características morfológicas, puede ser evaluado por microscopía 4D. La imagen muestra un embrión de C. elegans en la etapa de frijol. Las células vivas muestran núcleos de forma lisa rodeados por un citoplasma granular. En contraste, las células apoptóticas (flechas amarillas) se condensan y adoptan una forma refractaria similar a una lenteja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Aquí, presentamos un protocolo para preparar y montar embriones de Caenorhabditis elegans , registrar el desarrollo bajo un microscopio 4D y rastrear el linaje celular.

Microscopía 4D: Desentrañando el desarrollo embrionario de Caenorhabditis elegans usando Microscopía Nomarski

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

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