Name: 4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy
Uploaded: 2020-10-08T13:00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

Författarna vill erkänna stöd från Rioja Salud Foundation (Fondos FEDER) och spanska Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU) (Grant PGC2018-094276-B-I00). Cristina Romero Aranda finansieras av ett stipendium från AECC (Asociación Española Contra el Cáncer).

1. Odla C. elegans på petriskålar
<ol><li>Förbered NGM-plattor och frö dem med E. coli OP50 som matkälla (Figur 1). Odla och underhålla C. elegans enligt beskrivningen17. Förvara sådda plattor vid 4 °C i upp till en månad.</li>
	<li>Justera plattorna till önskad temperatur innan du tillsätter maskarna.<ol>
<li>För att överföra maskarna, ta bort en bit agar från en gammal tallrik och lägg den på en ny tallrik.</li>
		<li>Alternativt kan du fånga enskilda djur med en steril maskplockare (en 1-tums bit 32-gauge platinatråd med en platt spets, monterad på spetsen av en Pasteur-pipett) och placera dem på den nya plattan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Växa maskarna vid önskad temperatur.<ol>
<li>Odla C. elegans maskar vid 20 ° C, standardtemperaturen. Men för att analysera utvecklingen av termokänsliga mutanter, utför en inkubation över natten, vanligtvis vid 25 ° C. Justera varaktigheten och temperaturen för denna inkubation efter behov, beroende på den specifika mutanten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Förbered 4D-mikroskopiinspelningen innan embryona monteras (Figur 2)
<ol><li>Ställ in mikroskopet och temperaturkontrollerna innan du förbereder embryot. C. elegans embryon delar sig mycket snabbt. Var beredd att börja spela in omedelbart efter montering av embryon.</li>
	<li>Justera inspelningstemperaturen till antingen 15 °C, 20 °C eller 25 °C.<ol>
<li>Registrera embryona rutinmässigt vid 25 °C. Registrera termokänsliga mutanter vid den restriktiva temperaturen för att visa deras fenotyper. Spela in en WT-kontroll (om den görs i en annan beredning) vid samma temperatur som mutanterna. OBS: WT-embryon utvecklas snabbare vid 25 ° C och långsammare vid 15 ° C utan ytterligare skillnader i celllinje. Placera mikroskop i ett temperaturkontrollerat rum. Ytterligare kontroll genom kylning eller uppvärmning av bilden är mycket önskvärt. Detta kan uppnås genom att cirkulera vatten vid en specifik temperatur genom en metallring runt mikroskopmålet och kondensorn. Målet och beredningen är i direkt kontakt genom nedsänkningsoljan och temperaturöverföringen är effektiv. Detta system möjliggör exakt kontroll av inspelningstemperaturen och för att utföra temperaturförskjutningar under embryoutveckling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definiera postparametrarna i mikroskopiprogramvaran.<ol>
<li>För en standard C. elegans-inspelning (utan fluorescerande skanningar), välj: z-staplar med 30 fokalplan, på ett avstånd av 1 mikron vardera. 30 sekunders intervall mellan början av varje z-stack. 1500 z-staplar (12,5 timmars rekord). OBS: Både kommersiella och open source-mikroskopkontrollprogram kan användas för att definiera detta arbetsflöde för att fånga bilder. Nu är mikroskopet redo att spela in.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Förbered och montera embryon
<ol><li>Förbered en tunn, homogen agarplatta som det första steget för att få en fin bild (Figur 3).<ol>
<li>Förbered 50 ml av en 4,5% agarlösning i avjoniserat vatten. Värm till kokning i mikrovågsugnen och häll 0,5 – 1 ml i 3 ml glasrör.</li>
		<li>Försegla försiktigt rören med vaxfilm för att undvika uttorkning. Förseglade agarrör kan förvaras vid rumstemperatur i upp till två månader.</li>
		<li>På labbbänken, ha ett värmeblock vid 80 ° C med: ett provrör av ren vaselin (smält), med en fin pensel inuti. ett provrör med destillerat vatten innehållande en Pasteurpipett. OBS: Detta säkerställer att alla nödvändiga material blir heta och agaren stelnar inte i processen att göra dynan.</li>
		<li>Ta bort vaxfilmen från toppen av ett av agarrören och värm den försiktigt över en alkoholbrännare för att smälta agaren. Var försiktig eftersom het agar som utvisas från glasröret kan orsaka brännskador.</li>
		<li>När agaren har smält, placera röret i värmeblocket för att hålla agaren i flytande form.</li>
		<li>Alternativt kan du placera agarrören i värmeblocket 1 timme före experimentet för att smälta dem utan att använda en brännare. Den smälta agaren ska kasseras efter en dag.</li>
		<li>Placera en mikroskopbild (Slide A) mellan två andra på en plastbit.</li>
		<li>Ta en annan bild (slide B) och håll den med fingrarna i ena handen.</li>
		<li>Med den andra handen placerar du en liten droppe smält agar i mitten av slide A med den varma Pasteur-pipetten.</li>
		<li>Tryck omedelbart på bild B på agardroppen för att skapa en mycket tunn dyna mellan bild A och B. Håll dessa bilder inklämda ihop tills steg 3.2.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Montera embryon.<ol>
<li>Samla 5-10 gravida hermafroditer med plockaren och placera dem i ett urmakarglas fyllt med vatten.</li>
		<li>Använd en skalpell för att skära upp hermafroditnematoderna och extrahera tidiga ägg (1-4 celler) från livmodern, under stereomikroskopet.</li>
		<li>Ta bilden från steg 3.1.10 och skjut försiktigt av bild B för att exponera agarplattan på bild A.</li>
		<li>Placera ett tidigt ägg i mitten av agarplattan genom pipettering med ett kapillärrör.</li>
		<li>Alternativt pipettera en droppe som innehåller en uppsättning embryon på agarplattan och sedan söka efter embryon i tidigt skede. Gör detta steg under stereomikroskopet.</li>
		<li>Flytta vid behov ägget genom att knuffa det med en ögonfrans limmad i slutet av en tandpetare.</li>
		<li>Ta bort överflödigt vatten med kapillärpipetten. OBS: En kapillärpipett kan enkelt förberedas genom att värma en Pasteur-pipett över en alkoholbrännare och dra den från båda ändarna.</li>
		<li>Täck försiktigt beredningen med en täckglas. För att undvika luftbubblor, placera en kant av täckglaset på bilden och skjut försiktigt en skalpell längs den intilliggande kanten för att långsamt och snett drapera täckglaset på preparatet.</li>
		<li>Använd en pipett för att fylla 3/4 av utrymmet som omger agarplattan med vatten. Lämna 1/4 av utrymmet med luft.</li>
		<li>Försegla täckglaset med vaselin för att undvika uttorkning under långa inspelningsperioder.</li>
		<li>Använd den fina borsten för att förlänga ett tunt lager smält vaselin runt kanten på täckglaset. OBS: Nu är förberedelserna klara för inspelning.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Justera DIC och starta 4D-mikroskopiinspelningen
<ol><li>Placera bilden på mikroskopsteget. Fokusera embryot med hjälp av målet med låg förstoring (5x eller 10x).</li>
	<li>Byt till 100x nedsänkningsmålet.</li>
	<li>Justera mikroskopets optiska komponenter för att få en Nomarski-bild.<ol>
<li>Fokusera kondensorn.</li>
		<li>Öppna kondensorns bländare helt och stäng fältmembranet (detta ger en högre numerisk bländare och därmed större upplösning).</li>
		<li>Kontrollera att båda polarisatorerna på mikroskopet är inriktade för att orsaka maximal ljusutrotning.</li>
		<li>Vrid Wollaston-prisman för att få en fin tredimensionell bild av embryot, upplyst på ena sidan. Vrid prisman åt andra hållet för att få effekten av att embryot tänds på andra sidan. OBS: Dessa steg kan utföras på ett testprov före inspelningen så att endast finjustering krävs på provet som analyseras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Starta bildtagningen i mikroskopet.</li>
</ol>5. Analysera 4D-filmen (Figur 4).
OBS: När inspelningen är klar, använd programvara för spårning av celllinjer för att rekonstruera och analysera cellinje.
Programvara för spårning av celllinjer är ett kraftfullt verktyg för att utföra detaljerade analyser av embryonal utveckling eller dynamik i cellkulturer eller vävnadsfragment. Programmet extraherar och kvantifierar flera dataset om provets cellulära dynamik som inkluderar generering av hela cellinjen för varje registrerad cell, inklusive celldelningar, cellcykellängd, migration eller apoptos samt dess kinetik. Dessutom kan celldifferentiering poängsättas av cellens morfologiska förändringar eller genom uttryck av specifika markörer. I grund och botten visar programvaruskärmen två fönster: i det vänstra fönstret kan 4D-filmen spelas framåt och bakåt eller upp och ner till antingen topp- eller bottennivåerna så att varje cell kan följas i tid och rum under hela inspelningen. På höger änka genereras cellinjen. Att klicka på en cellkärna i 4D-filmen genererar en punkt i härstamningsfönstret som lagrar informationen om cellnamnet, ödet och rumsliga koordinater. Celllinjen för en specifik cell genereras genom att spela 4D-filmen framåt och klicka regelbundet på kärnan för att markera mitosen hos den specifika cellen över tiden. Upprepning av denna process för var och en av de inspelade cellerna genererar embryots eller provets fullständiga cellinje. Den lagrade informationen för rumsliga koordinater för varje cell används senare för att rekonstruera 3D-embryomodeller och cellmigrationsvägar.
<ol><li>Öppna programvaran för härledningsspårning och skapa ett nytt projekt genom att gå till den övre stapelmenyn och välja: | Nytt projekt.</li>
	<li>Välj celllinjemallen beroende på inspelningstemperaturen: DB08 för inspelning vid 25 °C, DB10 för inspelning vid 20 °C och DB12 för inspelning vid 15 °C.</li>
	<li>Ställ in inspelningsparametrarna i det framväxande fönstret: skanningsantal (vanligtvis 1500), tid mellan skanningar (30 sekunder), nivåantal (30) och avstånd mellan nivåer (1 mikron).</li>
	<li>Välj bildfil och format.<ol>
<li>Välj den bildkatalog där bilderna sparades.</li>
		<li>Välj om bilder ska sparas som enskilda bilder (en bild per nivå och tid) eller som z-staplar med flera bilder.</li>
		<li>Bestäm filnamn och bildformat. Rutinmässigt sparas enstaka bilder under följande namn: X0000L00C1 (för skanning 0, nivå 0, kanal 1) X0000L01C1 (för skanning 0, nivå 1, kanal 1) X0000L02C1 (för skanning 0, nivå 2, kanal 1) ... X0001L00C1 (för skanning 1, nivå 0, kanal 1) X0001L01C1 (för skanning 1, nivå 1, kanal 1) ... X0300L04C1 (för skanning 300, nivå 4, kanal 1) ... OBS: Att spara bilderna i ett komprimerat format sparar utrymme på hårddisken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Definiera ljuskanalerna: 1 för DIC-optik, 2 för GFP, 3 för RFP, etc. Lägg till de som användes i 4D-inspelningen. Klicka på "kanalbearbetning aktiverad" för att upptäcka dem.</li>
	<li>Börja spåra embryonets celllinje. Skärmen innehåller nu två stora fönster: videofönstret och celllinjefönstret.<ol>
<li>I härstamningsfönstret väljer du en härstamningsgren och använder musen för att klicka på cellkärnan som motsvarar den här cellen i videofönstret.</li>
		<li>Följ cellen rumsligt och över tid genom att spela upp 4D-filmen framåt, bakåt eller upp eller ner en nivå med hjälp av markörknapparna.</li>
		<li>Klicka regelbundet på cellkärnan. Detta genererar en punkt i härstamningsgrenen och registrerar cellens rumsliga koordinater vid denna tidpunkt. Som ett resultat fortskrider cellinjen, och 3D-rekonstruktioner av embryot är möjliga.</li>
		<li>Markera mitos genom att klicka på returtangenten. Välj sedan en av dottercellerna och följ den som tidigare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Upprepa processen (steg 5.6.1 till 5.6.4) för resten av de embryonala cellerna för att spåra hela celllinjen eller för att följa specifika celler av intresse, såsom de som genomgår apoptos.</li>
	<li>Jämför mutantlinjen med den stereotypa WT C. elegans-cellinjen .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods in Cell Biology. 106, 377-412 (2011).</li><li>Mace, D. L., Weisdepp, P., Gevirtzman, L., Boyle, T., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-fidelity+cell+lineage+tracing+method+for+obtaining+systematic+spatiotemporal+gene+expression+patterns+in+Caenorhabditis+elegans.">A high-fidelity cell lineage tracing method for obtaining systematic spatiotemporal gene expression patterns in Caenorhabditis elegans.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics (Bethesda). 3 (5), 851-863 (2013).</li><li>Nieto, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ccz-1+mediates+the+digestion+of+apoptotic+corpses+in+C.+elegans.">ccz-1 mediates the digestion of apoptotic corpses in C. elegans.</a> Journal of Cell Science. 123 (12), 2001-2007 (2010).</li><li>Cabello, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDR-1/hParkin+negatively+regulates+the+phagocytosis+of+apoptotic+cell+corpses+in+Caenorhabditis+elegans.">PDR-1/hParkin negatively regulates the phagocytosis of apoptotic cell corpses in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death &amp; Disease. 5, 1120 (2014).</li><li>Pinto, S. M., Almendinger, J., Cabello, J., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Acetylcholine+Signaling+Reduces+Cell+Clearance+Deficiencies+in+Caenorhabditis+elegans.">Loss of Acetylcholine Signaling Reduces Cell Clearance Deficiencies in Caenorhabditis elegans.</a> PLOS One. 11 (2), 0149274 (2016).</li><li>S&#225;enz-Narciso, B., G&#243;mez-Orte, E., Zheleva, A., Gastaca, I., Cabello, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+developmental+networks+by+Rac/Rho+small+GTPases:+How+cytoskeletal+changes+during+embryogenesis+are+orchestrated.">Control of developmental networks by Rac/Rho small GTPases: How cytoskeletal changes during embryogenesis are orchestrated.</a> Bioessays. 38 (12), 1246-1254 (2016).</li><li>Zheleva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+mRNA+export+unmasks+different+tissue+sensitivities+to+low+mRNA+levels+during+Caenorhabditis+elegans+development.">Reduction of mRNA export unmasks different tissue sensitivities to low mRNA levels during Caenorhabditis elegans development.</a> PLOS Genetics. 15 (9), 1008338 (2019).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Developmental Biology. 184 (2), 234-265 (1997).</li><li>Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+C.+elegans+Embryos+using+an+Epifluorescent+Microscope+and+Open+Source+Software.">Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2625 (2011).</li><li>Boyd, L., Hajjar, C., O'Connell, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+Microscopy+of+Early+Embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (54), e2852 (2011).</li><li>Urbach, R., Schnabel, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+neuroblast+formation,+mitotic+domains+and+proneural+gene+expression+during+early+brain+development+in+Drosophila.">The pattern of neuroblast formation, mitotic domains and proneural gene expression during early brain development in Drosophila.</a> Development. 130 (16), 3589-3606 (2003).</li><li>Dolinski, C., Borgonie, G., Schnabel, R., Baldwin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Buccal+capsule+development+as+a+consideration+for+phylogenetic+analysis+of+Rhabditida+(Nemata).">Buccal capsule development as a consideration for phylogenetic analysis of Rhabditida (Nemata).</a> Development Genes and Evolution. 208 (9), 495-503 (1998).</li><li>Houthoofd, W., Jacobsen, K., Mertens, C., Vangestel, S., Coomans, A., Borgonie, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+cell+lineage+of+the+marine+nematode+Pellioditis+marina.">Embryonic cell lineage of the marine nematode Pellioditis marina.</a> Developmental Biology. 258 (1), 57-69 (2003).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+eutardigrade+Thulinia+stephaniae+has+an+indeterminate+development+and+the+potential+to+regulate+early+blastomere+ablations.">The eutardigrade Thulinia stephaniae has an indeterminate development and the potential to regulate early blastomere ablations.</a> Development. 132 (6), 1349-1361 (2005).</li><li>Hejnol, A., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+a+couple+of+dimensions+can+do+for+you:+Comparative+developmental+studies+using+4D+microscopy-examples+from+tardigrade+development.">What a couple of dimensions can do for you: Comparative developmental studies using 4D microscopy-examples from tardigrade development.</a> Integrative and Comparative Biology. 46 (2), 151-161 (2006).</li><li>Bischoff, M., Parfitt, D. E., Zernicka-Goetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+embryonic-abembryonic+axis+of+the+mouse+blastocyst:+relationships+between+orientation+of+early+cleavage+divisions+and+pattern+of+symmetric/asymmetric+divisions.">Formation of the embryonic-abembryonic axis of the mouse blastocyst: relationships between orientation of early cleavage divisions and pattern of symmetric/asymmetric divisions.</a> Development. 135 (5), 953-962 (2008).</li><li>Mora-Lorca, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+reductase+gsr-1+is+an+essential+gene+required+for+Caenorhabditis+elegans+early+embryonic+development.">Glutathione reductase gsr-1 is an essential gene required for Caenorhabditis elegans early embryonic development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 96, 446-461 (2016).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

En av de stora utmaningarna i modern biologi är att förstå utvecklingen av flercelliga organismer. C. elegans har framstått som en av de bäst lämpade modellerna för att studera den fina samordningen mellan cellproliferation och celldifferentiering i det utvecklande embryot. Ur optisk synvinkel gör dess transparenta kropp och dess lilla storlek denna nematod till ett idealiskt prov för DIC-mikroskopi. Andra organismer med liknande egenskaper har också utsatts för 4D-mikroskopianalys 11,12,13,14,15,16.
För dessa utvecklingsstudier ger geninaktivering av antingen framåt eller omvänd genetik en ledtråd till dess engagemang i embryogenes. När en gen har visat sig spela en roll i utvecklingen är nästa steg att definiera dess exakta roll i upprättandet av rätt kroppsplan. Immunfärgning är det valda tillvägagångssättet för de flesta modeller. Denna teknik belyser problem i celldifferentiering eller uttryck av specifika markörer. En stor begränsning med detta tillvägagångssätt är dock att det bara ger en statisk bild av uttrycket av en enda eller flera markörer vid en fast punkt i utvecklingen. En dynamisk bild av dessa markörer under hela utvecklingen kan endast erhållas genom färgning av olika embryon vid olika tidpunkter. Dessutom är rekonstruktion av celllinje inte möjlig i sådana fasta prover.
4D-mikroskopi är ett kompletterande tillvägagångssätt för att studera embryonal utveckling. Denna teknik avslöjar utvecklingsdynamik vid en upplösning på cellnivå. Eventuella defekter i embryot som problem i spindelorientering, cellmigration, apoptos, cellödesspecifikation etc. kommer att dyka upp i en 4D-film som kan visualiseras framåt och bakåt, kvantifieras och poängsättas av forskaren. Med hjälp av denna teknik kan praktiskt taget varje cell i embryot följas upp till det ögonblick som embryot börjar röra sig. Embryon som utsätts för 4D-mikroskopi med endast synligt ljus och Nomarski-optik drabbas inte av fotoskador. Fluorescerande skanningar kan också interkaleras inom inspelningen för att detektera när och var en gen uttrycks. Embryon som drabbas av betydande fotoskador identifieras av cellcykelförlängningen som orsakar stark UV-bestrålning jämfört med ett vanligt WT-härstamningsembryo. I så fall kan fotoskador minskas genom att sänka UV-lampans intensitet och öka kamerans känslighet eller exponeringstid. Morfologiska egenskaper och molekylära markörer kan hjälpa till att klargöra den embryonala utvecklingen av någon mutant.
Att inrätta ett 4D-mikroskopisystem är lätt att implementera i laboratoriet och möjliggör efter viss övning en oöverträffad analys av celldynamik och härstamningsspårning av cellkulturer och levande transparenta prover på en upplösningsnivå för varje cell i mikroskopfältet. Spårning av cellinjer på DIC-bilder bearbetas fortfarande för hand. Det är tidskrävande och även om programvaran upptäcker härstamningsfel som olika härstamningsgrenar som markerar samma cell, är misstag möjliga. Medan automatisk detektion av GFP-märkta celler är välutvecklad2, är kompletterande härstamningsspårningsprogramvara baserad på omärkta celler och bilder av synligt ljus fortfarande i ett tidigt skede och inte riktigt användbart för en fullständig embryoanalys. Utan tvekan kommer tillämpningen av bildigenkänningssystem på området synlig ljusmikroskopi att medföra ett stort framsteg inom detta område.

4D-mikroskopi är ett multifokalt time-lapse-inspelningssystem som gör det möjligt för forskare att registrera och kvantifiera celldynamiken i ett biologiskt prov både rumsligt och över tid. Cellkulturer, jäst eller levande vävnader kan utsättas för 4D-analys men denna teknik är särskilt lämpad för att analysera utvecklingen av levande embryon. Upplösningen av denna analys når nivån på varje enskild cell i embryot. Varje celldelning kan detekteras och cellrörelser kan spåras över tiden. Cellöden bedöms enligt den position och form som cellerna förvärvar. Användningen av Nomarski-optik förbättrar kontrasten hos ofärgade transparenta prover med hjälp av ortogonalt polariserade ljusstrålar som stör vid fokalplanet. De resulterande bilderna verkar tredimensionella, upplysta på ena sidan.
Andra metoder baserade på användning av konfokalmikroskopi och GFP-transgena djur för automatisk detektion av kärnor och generering av cellinjer har utvecklats 1,2. Fördelen med dessa system är uppenbar: programvaran åsidosätter i hög grad behovet av att manuellt markera varje kärna under en tidsperiod (även om viss manuell övervakning krävs under de sena stadierna). Cellulära processer som involverar förändringar i cellform eller membrandynamik, såsom de som uppstår under celldifferentiering, migration, apoptos eller likuppslukning, förblir emellertid dolda som en svart bakgrund i de fluorescerande märkta kärnbilderna.
Däremot visar 4D Nomarski-mikroskopi (även kallad DIC-mikroskopi, differentialinterferenskontrastmikroskopi) både kärnor och cellformförändringar som uppstår under utvecklingen av vilda eller mutanta djur. Detta möjliggör spårning av celllinjer med hjälp av standardmikroskop, som endast använder överfört ljus. Det finns inget allmänt behov av att använda transgena djur förutom att visa specifika uttrycksmönster, i vilket fall fluorescerande skanningar kan interkaleras. Därför kan detta vara det optimala tillvägagångssättet för många laboratorier som arbetar med dynamiska cellprocesser som embryogenes eller apoptos som kan belysas under DIC-mikroskopi 3,4,5,6,7.
Flera flexibla och användarvänliga program finns tillgängliga för att fånga mikroskopiska bilder och rekonstruera cellinjer, 3D-modeller, cellmigrationsvägar etc. i det inspelade provet. I ett standardexperiment förvärvas bilder i en serie fokalplan, på ett konstant avstånd, vars antal beror på provtjockleken. Analysens tidsmässiga upplösning kan optimeras genom att öka skanningsfrekvensen. Det finns praktiskt taget ingen annan gräns för inspelningens varaktighet än datorns lagringskapacitet. Till exempel, för en C. elegans embryoutvecklingsanalys, förvärvar vi rutinmässigt bilder på 30 fokala plan (1 mikronsteg vardera), var 30: e sekund i 12 timmar.
Dessa system har tillämpats på analys av flera djurembryon såsom Caenorhabditis elegans 8,9,10, Drosophila melanogaster11, andra nematodembryon12,13, tardigrades14,15 och till och med tidiga musembryon16. Det enda kravet är att ha ett transparent embryo som kan utvecklas på glidberedningen under mikroskopet.
Sammanfattningsvis är DIC-baserad 4D-mikroskopi särskilt användbar för 1) analys av embryonal utveckling av små, transparenta djur: spårning av celllinje, cellmigrationsvägar, generering av 3D-modeller etc; 2) definiera genuttrycksmönster; 3) studera cellodlingsdynamik, från jäst till mänskliga celler; 4) analysera vävnadsdynamik eller embryofragment; 5) kvantifiering av celldödskinetik och likinflätning; och 6) utföra jämförande fylogenianalys baserad på embryonala utvecklingsegenskaper. Om det finns intresse för något av dessa ämnen (eller liknande) kan 4D-mikroskopi användas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (N2)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>N2</td>
			<td>WT C. elegans strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caenorhabditis elegans (VZ454)</td>
			<td>GCG (Caenorhabditis Genetics Center)</td>
			<td>VZ454</td>
			<td>gsr-1(tm3574) C. elegans mutant strain. Can be requested at GCG (Caenorhabditis Genetics Center): https://cgc.umn.edu/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Lineage Tracing software</td>
			<td>SIMI</td>
			<td>Simi BioCell</td>
			<td>This is the software to reconstruct the embryo cell lineage. For a detailed explanation check at: http://www.simi.com/en/products/cell-research/simi-biocell.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>Orca-R2</td>
			<td>Miscroscope camera for both transmitted and UV light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Caenotec</td>
			<td>Time to Live</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be requested at: Caenotec Prof. Ralf Schnabel 
			Kleine Dorfstr. 9 38312 B&#246;r&#223;um, Germany, Ph: ++49 151 11653356 r.schnabel(at)tu-bs.de</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope control software</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>Micro-manager</td>
			<td>This software controls the microscope to perform the 4D image capture. Can be downloaded at: https://micro-manager.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica DM6000</td>
			<td>Motorized upright microscope to perform 4D microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard equipment in a Molecular Biology lab.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16FA</td>
			<td>Steromicroscope to manipulate nematodes and prepare embryos.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

4d microscopy: unraveling caenorhabditis elegans embryonic development using nomarski microscopy

4D-mikroskopi är ett ovärderligt verktyg för att reda ut den embryonala utvecklingsprocessen hos olika djur. Under de senaste decennierna har Caenorhabditis elegans framstått som en av de bästa modellerna för att studera utveckling. Ur optisk synvinkel gör dess storlek och transparenta kropp denna nematod till ett idealiskt prov för DIC-mikroskopi (Differential Interference Contrast eller Nomarski). Denna artikel illustrerar ett protokoll för odling av C. elegans nematoder, förberedelse och montering av deras embryon, utförande av 4D-mikroskopi och spårning av celllinjer. Metoden bygger på multifokala time-lapse-poster av Nomarski-bilder och analys med specifik programvara. Denna teknik avslöjar embryonal utvecklingsdynamik på cellulär nivå. Varje embryonal defekt hos mutanter, såsom problem i spindelorientering, cellmigration, apoptos eller cellödespecifikation, kan effektivt detekteras och poängsättas. Praktiskt taget varje enskild cell i embryot kan följas upp till det ögonblick som embryot börjar röra sig. Att spåra hela cellinjen hos ett C. elegans-embryo med 4D DIC-mikroskopi är mödosamt, men användningen av specifik programvara underlättar denna uppgift avsevärt. Dessutom är denna teknik lätt att implementera i labbet. 4D-mikroskopi är ett mångsidigt verktyg och öppnar möjligheten att utföra en oöverträffad analys av embryonal utveckling.

För att karakterisera embryonal utveckling av en C. elegans-mutant för genen gsr-1, som kodar för enzymet glutationreduktas, som krävs för att regenerera reducerad glutation (GSH) och involverad i att upprätthålla redoxhomeostas i nematoden, utförde vi 4D-mikroskopi av en gsr-1 (tm3574) deletionsmutant som är en förlust av funktionsallel som orsakar en tidig embryonal arrestering fenotyp18. Både WT och balanserade gsr-1 (tm3574) mutant C. elegans nematoder odlades på NGM-plattor sådda med E. coli OP50 som matkälla17. gsr-1 (tm3574) maskar odlades som heterozygota vid 20 °C i två generationer och sedan separerades homozygota maskar (som kan växa upp till vuxen ålder tack vare moderns belastning) flyttades till 25 °C för en inkubation över natten före embryoanalys. Maskplattor inkuberades i kartonger för att undvika kondens (figur 1). Gravida nematoder skars upp för att extrahera unga embryon.
För att jämföra embryonal utveckling av mutanten kontra den stereotypa WT under identiska förhållanden placerades ett WT (som kontroll) och ett gsr-1 (tm3574) embryo på samma preparat bredvid varandra. Arbetsflödet för 4D-mikroskopi kördes på ett standardmotoriserat upprätt mikroskop utrustat med DIC-optik. De valda inspelningsparametrarna i mikroskopkontrollprogrammet var: z-staplar med 30 fokalplan på 1 mikron avstånd vardera, 30 sekunders intervall mellan början av varje z-stack och 1500 z-stackar (12,5 timmars inspelning). Inspelningstemperaturen justerades till 25 °C (både i rummet och på mikroskopstadiet) (figur 2).
När inspelningen var klar öppnades bildfilen och celllinjen rekonstruerades med hjälp av härstamningsspårningsprogramvara genom att klicka på cellkärnor som visas i videofönstret (figur 4). Den spårade gsr-1 (tm3574) mutanta embryonala celllinjen jämfördes med C. elegans WT-linjen som avbildades i bakgrunden. Ett viktigt resultat var upptäckten av en progressiv fördröjning av cellcykeln under embryonal utveckling. Som en konsekvens arresterades muterade embryon i mellanliggande stadier medan WT-embryon utvecklades och slutligen kläcktes som larver.
Förberedelse och direkt observation av embryon under mikroskopet eller immunfärgning med antikroppar mot sena embryonala markörer kan avslöja närvaron av en hög andel unga embryon i mutanten jämfört med WT. Embryostopp kan då härledas som den mest troliga förklaringen. Direkt bevis och exakt kvantifiering av cellcykelfördröjningen kan emellertid endast elegant och enkelt visas och kvantifieras genom ett 4D-mikroskopiexperiment. Andra viktiga funktioner i embryonal utveckling som celldifferentiering eller apoptos (figur 5) kan också visualiseras på ett dynamiskt sätt med hjälp av 4D-mikroskopi som erbjuder en detaljerad analys av flera aspekter av utvecklingen i ett enda experiment.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig01.jpg"> Figur 1: C. elegans nematoder växer under laboratorieförhållanden. Nematoder odlas på E. coli-fröade NGM-plattor, förvaras i kartonger och inkuberas antingen vid 15 ° C, 20 ° C eller 25 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig02.jpg"> Bild 2: Skärmdump av inspelningsprogramvara för 4D-mikroskopi. Exempel på två olika mikroskopstyrningsprogram (A och B). Dessa program skapar arbetsflöden för att styra mikroskopet och bildtagningen under 4D-mikroskopiinspelning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig03.jpg"> Figur 3: Seriefotografier av agar pad förberedelse och montering av C. elegans embryo visar. A. Beredda agarrör. B-C. Förberedelse av agarplattan. D. Skjut delvis fylld med vatten. E. Försegla bilden med vaselin. F. Slutlig förberedelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig04.jpg"> Figur 4: Seriella skärmdumpar av programvara för spårning av celllinjer. Programmet möjliggör rekonstruktion av den embryonala celllinjen hos en cellcykelfördröjningsmutant (vänster) och ett WT (höger) C. elegans-embryo . A. Ett tidigt steg i utvecklingen. B-C. Utvecklingen av båda embryon fortskrider över tiden. D. WT-embryot utvecklas ordentligt och börjar förlängas medan mutanten arresteras. I alla fall visar programmet videofönstret och härstamningsfönstret. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61736/61736fig05v2.jpg"> Figur 5: Linsrefraktil form av apoptotiska celler i ett C. elegans WT-embryo . Cellöde, definierat av morfologiska egenskaper, kan bedömas med 4D-mikroskopi. Bilden visar ett C. elegans-embryo i bönstadiet. Levande celler visar slätformade kärnor omgivna av en granulär cytoplasma. Däremot kondenserar apoptotiska celler (gula pilar) och antar en linsliknande, refraktil form. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61736/61736fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy at JoVE.com

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda och montera Caenorhabditis elegans-embryon , registrera utveckling under ett 4D-mikroskop och spåra celllinje.

4D-mikroskopi: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonal utveckling med Nomarski-mikroskopi

4D microscopy is an invaluable tool for unraveling the embryonic developmental process in different animals. Over the last decades, Caenorhabditis elegans ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

4D Microscopy: Unraveling Caenorhabditis elegans Embryonic Development Using Nomarski Microscopy

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Comprehensive Assessment of Germline Chemical Toxicity Using the Nematode Caenorhabditis elegans

Omfattande Bedömning av nedärvda Kemisk toxicitet Använda Nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Identifying the reproductive toxicity of the thousands of chemicals present in our environment has been one of the most tantalizing challenges in the ...

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Analys av cardiomyocyte Development använder Immunfluorescens i embryonal Mouse Heart

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transkriptom Profilering av<em&gt; In-Vivo</em&gt; Producerad Bovina Preimplantatorisk embryon med hjälp av två-färg microarray plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analys av zebrafisk njure utveckling med Time-lapse avbildning med ett dissektionsmikroskop Utrustad för optisk Sektione

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Använda ljus Sheet fluorescensmikroskopi till bild Zebrafish Eye utveckling

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodal hierarkiska avbildning av seriell avsnitt för att hitta specifika cellulära mål inom stora volymer

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Bedömningen av lysosomala alkalisering i tarmen av Live Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk Ljusplåt Mikroskopi och automatiserad cell Lineage analyser till katalogen Caenorhabditis elegans Embryogenesis med subcellulär upplösning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans

Isolering av specifika neuron populationer från spolmask Caenorhabditis elegans

During the aging process, many cells accumulate high levels of damage leading to cellular dysfunction, which underlies many geriatric and pathological ...