Name: mechanical separation and protein solubilization of the outer and inner perivitelline sublayers from hen's eggs
Uploaded: 2021-01-27T13:00:00
Duration: 6 min 12 s
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Nous remercions Philippe Didier et Karine Anger (INRAE, PEAT, 37380, Nouzilly, France, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) d’avoir fourni des œufs isa-bruns non fertilisés. Nous remercions également l’Université de Tours, France, d’avoir finance le doctorat de M. Bregeon. Ces travaux ont reçu un soutien financier de l’Agence nationale de Français (EQLIPSE, ANR-19-CE21-0006).

1.PL, IPL et OPL
<ol><li>Échantillonnage PL
	<ol>
<li>Casser manuellement l’œuf non fertilisé fraîchement pondu et utiliser un séparateur d’œufs couché sur un bécher en verre pour séparer le jaune du blanc. Retirer le chalazae avec de petits ciseaux et rouler le jaune sur un papier filtre pour enlever les albumen adhérents qui apparaît comme une structure transparente et visible (Figure 2A). ATTENTION: Veillez à ne pas percer le PL avec des ciseaux. L’utilisation de pinces à épiler au lieu de ciseaux pour enlever les chalazas peut provoquer une rupture du PL et une fuite subséquente du jaune. L’étape de roulement sur le papier filtre est critique et doit être effectuée très rapidement en raison des propriétés absorbantes du filtre à papier qui peuvent déclencher une rupture pl. Il est également très important d’utiliser un œuf non fécondé dès le jour de la pose, afin d’optimiser le succès de cette première étape et toutes les étapes suivantes. Alternativement, les oeufs qui ont été stockés moins de 10 jours dans un environnement refroidi peuvent être utilisés, mais les expérimentateurs doivent tenir compte des risques potentiels de modifications du PL.</li>
		<li>Plonger le jaune dans un cristallisateur contenant 10 mM de tris-HCl pH 8 qui a déjà été refroidi à 4 °C et retirer la zone PL sur le disque germinal dans une zone de 1 cm à l’aide de ciseaux contondants (figure 2B). REMARQUE : Au départ, pl était immergé dans de l’eau déionisée, mais cette approche a quelques inconvénients, tels que le manque de contrôle du pH et les difficultés à séparer les sous-coucheurs par la suite (étape 1.2). Par conséquent, plusieurs conditions ont été testées, y compris la concentration de Tris (figure 3A) et le pH (figure 3B). L’utilisation d’un tampon au pH 8, au lieu de l’eau déionisée ou déminéralisée, est conforme à la physiologie des œufs (le pH du blanc d’œuf est d’environ 7,8 le jour de la pose)14 et minimise la perte de protéines. En revanche, on soupçonne que le pH acide ou très alcalin déclenche la détructuration du PL et la solubilisation précoce des protéines (figure 3B). Le tampon composé de 10 mM tris-HCl pH 8 s’est révélé optimal, car il respecte la physiologie des œufs et ne provoque pas de solubilisation significative des protéines (la concentration de protéines dans le tampon de travail reste minime, figure 3A,B).</li>
		<li>Rompre le PL avec de petits ciseaux dans le tampon. Maintenez les deux bords du PL rompu avec des forceps et pelez le PL du jaune.</li>
		<li>Maintenir le PL avec des forceps et rincer le PL plusieurs fois dans plusieurs bains de 10 mM Tris-HCl, pH 8 jusqu’à ce qu’aucune trace de jaune ne soit visible. À ce stade, assurez-vous que le PL est propre, blanc et flottant dans le tampon. Il peut être traité à l’étape 1.2 pour la séparation des sous-coucheurs ou directement à l’étape 2.1 pour les analyses biochimiques.</li>
	</ol></li>
	<li>Échantillonnage de la BPO et de l’IPL
	<ol>
<li>Étalez l’échantillon pl entier en mettant OPL vers le haut dans une boîte en plastique de Petri et en le maintenant à plat avec autant de rides que possible. Couvrir l’échantillon de 10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl. Utilisez une boîte de Pétri en plastique (et non du verre) pour limiter les mouvements pl, parce que PL colle mieux au plastique.<ol>
<li>Pour localiser le côté de la BPO, regardez où se trouve le chalazae restant qui est attaché à la BPO et non à la BPO. Cette étape nécessite une faible concentration de NaCl (50 mM) pour faciliter la séparation des sous-couches. REMARQUE : D’après le graphique présenté à la figure 3C et àla littérature 11,cette concentration ne devrait pas entraîner de perte importante de protéines. Initialement, l’eau déionisée a été utilisée pour séparer les sous-coucheurs, commedécrit précédemment 1,5,6, mais cette technique s’est trouvée très laborieuse et a entraîné la modification de l’intégrité structurale pl. Par conséquent, différentes concentrations de NaCl (figure 3C) ont été testées car le sel facilitait la séparation des deux sous-coucheurs. Toutefois, il convient de noter que l’utilisation de la concentration de NaCl >100 mM augmente la solubilisation des protéines / libération de la PL, qui n’est pas l’objectif ici (ce sera l’objectif à l’étape 2) (Figure 3C). L’ajout de 50 mM de NaCl au tampon Tris-HCl pH 8 de 10 mM facilite la séparation des deux sous-coucheurs et minimise la perte de protéines.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Couper le PL total en morceaux d’environ 2 cm x 3 cm avec de petits ciseaux. Séparez mécaniquement les deux couches de chaque pièce PL avec des forceps de pointe ultra-précis sous un microscope à disséquer des jumelles (figure 4). Conservez les échantillons ipl et OPL qui en résultent individuellement dans des microtubes à -80 °C, jusqu’à utilisation plus tard. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Il convient de noter que l’efficacité et l’installation de séparation des deux couches dépend grandement de la fraîcheur de l’œuf. En effet, les œufs stockés présentent des modifications internes drastiques dues à l’augmentation rapide du pH blanc d’œuf et à l’altération subséquente de l’indice jaune due à l’assouplissement (et à l’affaiblissement du PL). IPL est plus fragile par rapport à la BPO. Il est donc préférable de placer le visage de la BPO au-dessus et de séparer les deux sous-coucheurs en tirant sur la BPO avec les forceps. Les deux sous-coucheurs doivent être manipulés avec un soin précieux.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Traitement par échantillon pour la solubilisation des protéines et les analyses SDS-PAGE
<ol><li>
Solubilisation primaire des protéines
	<ol>
<li>Échantillons d’IPL et de BPO à sec au congélateur individuellement. Une fois le séchage au gel terminé, couper approximativement 1 mg de chaque échantillon dans des microtubes propres possédant un bouchon de vis anti-fuite. Gardez les échantillons restants dans des tubes bien fermés pour un stockage prolongé à -80 °C. REMARQUE : L’utilisation de microtubes avec bouchon à vis étanche assure la fermeture hermétique et étanche pour prévenir la réhydratation de l’échantillon et qui sécurisera les échantillons.</li>
		<li>Mélanger 1 mg de chaque sous-couche lyophilisée avec 400 μL de 50 mM Tris pH 7, 500 mM NaCl. Utilisez un mélangeur-moulin pendant 2 fois pendant 5 min à 30 Hz pour désintégrer les structures opl et OPL dans les microparticules et faciliter la solubilisation des protéines. Recueillir 400 μL des échantillons contenant la BPO et l’IPL dans deux microtubes propres. REMARQUE : Le tampon utilisé ici a été choisi pour augmenter la solubilisation des protéines (contrairement à l’étape 1). Ce tampon était basé sur les résultats présentés à la figure 3, qui montrent une augmentation de la solubilisation des protéines au pH 7 (figure 3B) et en utilisant 0,5 M NaCl (Figure 3C). Le protocole peut être mis en pause ici. À ce stade, les échantillons peuvent être utilisés pour la purification des protéines PL principales ou transformés à l’étape 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Solubilisation protéique de l’électrophoresis
	<ol>
<li>Ajouter 5x tampon échantillon SDS-PAGE (100 μL, 0,25 M Tris-HCl, 0,05% bleu bromophénol, 50% glycérol, 5% SDS, 5% bêta-mercaptoéthanol, pH 6,8) à chaque 400 μL de l’échantillon et la chaleur à 100 °C pendant 5 min. REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici, et les échantillons peuvent être stockés à -80 °C. À ce stade du protocole, la BPO et l’IPL sont complètement dissoutes. L’efficacité de la solubilisation de l’échantillon peut être évaluée en centrifugant des échantillons pendant 5 min à 10 000 x g. La solubilisation complète se caractérise par l’absence de granulés visibles après centrifugation. Ainsi, après solubilisation complète, on considère ici que 1 mg de sous-couche lyophilisée correspond à 1 mg de protéines (la concentration en protéines dans l’échantillon de 500 μL est de 2 mg/mL). En effet, pl est composé de plus de 80% deprotéines 2,15. L’utilisation d’un tampon d’échantillon 5x limite la dilution de l’échantillon, mais un tampon d’échantillon 1x ou 2x peut également être utilisé.</li>
		<li>Chargez un maximum de 20 μg de protéines/voie sur un gel polyacrylamide SDS (gel de gradient de 4%-20% ) et effectuez l’électrophorèse à 120 V à l’aide d’un système d’électrophoresis vertical. REMARQUE: L’utilisation d’un gel gradient de 4%-20% n’est pas obligatoire, mais est préférable ici que OPL et IPL présentent des protéines avec des poids moléculaires allant de <10 kDa à >250 kDa. Il pourrait également être utile de garder le gel d’empilage (qui est habituellement enlevé), car la présence de protéines insolubles ou d’agrégats protéiques au fond des puits indiquerait une mauvaise solubilisation et une étape manquante possible pendant la préparation de l’échantillon.</li>
		<li>Après l’électrophoresis, retirer les gels des plaques de verre et les taches avec la solution Coomassie Brilliant Blue (50% H2O, 40% EtOH, 10% acide acétique, et R250 Coomassie Brilliant Blue) pendant 30 min.</li>
		<li>Dé-tache avec une solution composée de 50% H2O, 40% EtOH, 10% solution d’acide acétique jusqu’à ce que le fond de gel apparaît bleu clair.</li>
		<li>Enfin transférer le gel dans des boîtes de Pétri contenant de l’eau déionisée, pour atteindre la dé-coloration et la réhydratation des gels polyacrylamides. Les protéines doivent apparaître sous forme de bandes bleues d’un fond transparent.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+chicken+egg+vitelline+membrane.">Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane.</a> Proteomics. 8 (11), 2322-2332 (2008).</li><li>Chung, W. H., Lai, K. M., Hsu, K. -. 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Membrane structure and its deterioration with age.</a> Journal of Biochemistry. 78 (2), 261-268 (1975).</li><li>Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+components+of+the+vitelline+membrane+of+hen's+egg.+II.+Physicochemical+properties+of+glycoprotein+I.">Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. II. Physicochemical properties of glycoprotein I.</a> Journal of Biochemistry. 79 (6), 1351-1356 (1976).</li><li>Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+components+of+the+vitelline+membrane+of+hen's+egg.+III.+Physicochemical+properties+of+glycoprotein+II.">Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. III. 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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le succès du présent protocole repose sur deux étapes critiques optimisées indépendamment : la séparation mécanique de la BPO et de l’IPL qui doivent être aussi déstructurantes que possible, suivies de la solubilisation complète des protéines de chaque sous-couche, qui est, à l’inverse, déstructurante et dénaturante. Il met également en évidence certains points spécifiques qui doivent être pris en considération pour assurer la réussite de chaque étape.
Le protocole ne dépend pas de la couleur de la coquille d’œuf, du poids de l’œuf, du type de production ou de la souche génétique de la poule. Cependant, cela dépend de la fraîcheur de l’œuf. En effet, l’œuf subit rapidement de profondes modifications physicochimiques internes après avoir été pondu, bien que ces changements puissent être retardés lorsque l’entreposage est effectué dans des conditionsréfrigérées 14,15. La perte de dioxyde de carbone par les pores de la coquille d’œuf pendant le stockage entraîne une augmentation du pH blanc d’œuf (de 7,8 à 9,5) tandis que certains échanges d’eau se produisent entre le jaune et le blanc, à travers le PL. Les deux modifications ont un impact négatif sur la structure moléculaire et histologique du PL qui devient affaiblie et moins tendue14,15, probablement en raison de modifications physicochimiques de sa teneur en protéines16,17,18. On suppose que la séparation des sous-coucheurs deviendra très difficile avec les œufs entreposés, surtout si l’entreposage est effectué pendant une longue période à température ambiante. À jour, le protocole a été exécuté à l’aide d’œufs conservés pendant moins de 4 jours à 4 °C et la durée maximale d’entreposage d’un œuf pour échantillonner efficacement les sous-couchettes PL n’est pas encore connue. En outre, si l’objectif est l’analyse de chaque sous-couche, il est crucial d’utiliser des œufs non fécondés. Le jour du laïcité, l’embryon d’un œuf fécondé a 23 h et son développement est très rapide par la suite, si l’œuf est incubé. En effet, le développement embryonnaire et la croissance de certaines structures extraembryoniques se développent en utilisant le PL comme substrat, qui est donc rapidement dégradé, et remplacé par le sac jaune extraembryonique19.
Après la séparation manuelle du jaune et du blanc d’œuf, le jaune doit être nettoyé à partir de traces de blanc d’œuf et de chalazae qui sont restés étroitement attachés au PL. La pointe est de rouler le jaune soigneusement sur un papier filtre et d’effectuer des lavages étendus du jaune dans des solutions tamponnées (10 mM Tris-HCl pH 8). Le pH utilisé pour le tampon est compatible avec le pH physiologique du blancd’œuf 14 et il a été démontré qu’il minimise la perte de protéines (figure 3). L’utilisation d’un tampon réfrigéré aidera alors à retirer le PL du jaune parce qu’à 4 °C, le tampon facilitera l’élimination du PL à mesure que le jaune lipidique se rétracte et devient moins fluide à cette température. Des lavages supplémentaires permettront d’enlever les résidus de jaune du PL. Il est également important de découper la zone correspondant au disque germinal parce que cette structure qui contient du pronucléus femelle peut ne pas être représentative du PL. C’est le site de fécondation et de multiplication des cellules embryonnaires lorsque l’ovule est fécondé. Il est censé avoir une composition particulière qui peut ne pas être représentative de l’ensemble pl, qui est la raison pour laquelle il a été supprimé. Cette étape spécifique est fortement facilitée lorsque le jaune est immergé dans un tampon froid. Bien que cette structure germinale du disque soit écartée dans le protocole actuel (hors objectifs), des analyses spécifiques de cette zone dans les ovules fécondés pourraient être très utiles pour les scientifiques intéressés à étudier l’évolution de la teneur en PL (protéomique et activité) et de la structure (microscopie électronique), au cours des premiers stades de l’embryogenèse19,20,21. À ce stade, l’ensemble du PL est structurellement intact et peut être traité pour une analyse structurelle plus poussée par microscopie électronique (figure 2), à l’étape 1.2 ou à l’étape 2.1 (si l’objectif est d’analyser l’ensemble pl).
L’étape 1.2 doit être menée au microscope à disséquer des jumelles, car le PL est très mince et fragile (environ 10 μm d’épaisseur). La séparation des sous-coucheurs est presque impossible dans l’eau ou dans le tampon dépourvu de sel minimal, et les tentatives initiales utilisant ces options ont entraîné de graves dommages au PL. Ainsi, le tampon sélectionné pour cette étape reste au pH physiologique (pH 8) et contient 50 mM nacl. Cette étape est ardue et doit être effectuée avec soin et douceur pour éviter les déchirures pl. Une fois séparés, les deux sous-coucheurs peuvent être facilement identifiés car ils présentent des caractéristiques physiques particulières (opaques par rapport translucides). Un manque d’homogénéité de l’IPL à la lumière du microscope devrait refléter une séparation incomplète et donc la présence des taches restantes de la BPO présentes sur l’IPL. En outre, il est très difficile de traiter toute la membrane et l’utilisation de morceaux de 2 cm x 3 cm augmente considérablement les chances de succès. Le sous-coucheur obtenu est adapté à l’étude histologique par microscopie électronique (Figure 1). Il convient de noter qu’une structure linéaire spécifique (0,05 à 1 μm d’épaisseur) nommée membrane continue (CM) est visible sur le micrographe (figure 1) et reste habituellement attachée à l’une ou l’autre sous-couche pendant le processus de séparation. Il a été précédemment publié que lors de l’utilisation d’une molaire de sel relativement élevée pour la séparation (500 mM), le CM est resté attaché à opl7 tandis que l’utilisation del’eau 5 favorisera l’attachement de CM à IPL. Dans ce protocole, une faible molaire salée est utilisée pour atteindre les objectifs spécifiques (sous-couche pl structurellement intacte et perte minimale de protéines), ce qui signifie que ce CM est probablement associé à l’IPL. Toutefois, une analyse supplémentaire de l’IPL et de la BPO par microscopie électronique de transmission indiquerait clairement cette hypothèse. Les couches PL, OPL ou IPL obtenues à la fin de l’étape 1 peuvent également être utilisées pour des analyses in vitro pour les analyses de liaison spermatozoïdes-ovules22 ou pour analyser les premières étapes du développement embryonnaire23,24.
L’étape 2 se réfère à la solubilisation de la teneur en protéines, partiellement (étape 2.1) ou complètement (étape 2.2). Pl et/ou OPL sont d’abord lyophilisés pour enlever les molécules d’eau et pour permettre des mesures précises du poids. En effet, le PL est principalement composé d’eau (88%)7, tandis que la matière sèche contient essentiellement des protéines (80% à 90% selon les études), des glucides, des graisses et des minéraux2,7,25. Considérant que l’eau contenue dans le PL est éliminée par le lyo-séchage, que les glucides sont essentiellement récupérés dans les glycoprotéines PL, et que les graisses et les minéraux proviennent du jaune sont essentiellement jetés par des lavages étendus, on suppose que le PL résultant est composé presque exclusivement de protéines. Ainsi, la valeur de poids obtenue après lyophilisation complète devrait principalement correspondre aux protéines. La quantité égale de PL, OPL et/ou IPL sont ensuite diluées dans le tampon contenant 0,5 M NaCl. La grande morosité du sel combinée à la destruction mécanique du réseau fibreux par broyage facilite grandement la solubilisation des protéines dans des conditions non dénaturantes. Cette étape est suivie par la solubilisation complète à l’aide d’ébullition, de détergent SDS et de l’agent réducteur bêta-mercaptoéthanol (étape 2.2). En effet, certaines protéines IPL sont des glycoprotéines solubles dans le SDD25,26,27 et les principaux constituants de la BPO sont solubles dans le NaCl1,11. En utilisant ce protocole, nous n’avons pas vu de granulés restants de protéines insolubles après centrifugation, ce qui indique que la solubilisation était probablement complète. Les protéines de PL, OPL et/ou IPL ont ensuite été analysées par SDS-PAGE. Les profils protéiques qui en résultentsont compatibles avec la littérature publiée 2,4,11,16, mais la résolution et l’intensité du signal est fortement améliorée et beaucoup plus homogène entre divers échantillonnages indépendants de l’IPL et de la BPO.
De plus, la comparaison quantitative entre la BPO et l’IPL est rendue possible grâce à l’exactitude du poids que nous avons déduit pour les sous-couchettesrespectives 2,7. En outre, les profils OPL et IPL sont très distincts et à l’exception d’une bande faible à 14 kDa et 75 kDa, les deux sous-coucheurs PL ne partagent pas visiblement les bandes affichant le même poids moléculaire. Cette observation corrobore l’efficacité de la séparation des sous-coucheurs sans contamination croisée significative. Selon la seule analyse protéomique PL publiée1, les bandes les plus intenses de l’OPL (<30 kDa) devraient correspondre au lysozyme (14 kDa), à la protéine de la couche externe de la membrane vitelline 1 (17 kDa), aux bêta-defens aviaires dans 11 (poids moléculaire apparent de 12 kDa), tandis que les bandes intenses d’IPL (>30 kDa) sont probablement zona-pellucida protéine 1 (102 kDa) et zona-pellucida protéine 3 (47 kDa). La distribution des protéines PL très abondantes ovotransferrine (78 kDa), protéine X liée à l’ovalbumine (45 kDa), ovalbumine (43 kDa)1 entre les sous-coucheurs reste à élucider. En effet, le poids moléculaire élevé de ces protéines (>30 kDa) suggère qu’il s’agit de protéines IPL basées sur le profil SDS-PAGE, mais leur spécificité tissulaire (protéines exprimées par les oviductes) préfère associer ces protéines à l’OPL28,29. En outre, certains ont suggéré une contamination potentielle des échantillons de PL par des protéines de blanc d’œuf et de jaune d’œuf en raison de lavagesinsuffisants 1. Ce manque d’information est à la base de l’élaboration du présent protocole, qui sera utilisé pour la protéomique quantitative approfondie de PL, OPL et IPL.
Alternativement, de l’étape 2.1 et après centrifugation pour enlever la matière insoluble, il est possible d’extraire quelques protéines spécifiques pour davantage de caractérisation biochimique et biologique. Une telle approche a été récemment appliquée pour caractériser les activités biologiques et/ou la structure 3D des deux principaux composants de l’OPL, la protéine 1 (VMO1) et la bêta-defensine aviaire 11 (AvBD11)30,31. La disponibilité de ces protéines en tant que molécules purifiées peut également aider à produire des anticorps spécifiques pour des expériences supplémentaires telles que l’immunohistochimie ou pour le développement d’analyses quantitatives, y compris des analyses immunosorbents liées aux enzymes.
Les deux principales limitations de ce protocole sont (1) le défi avec la séparation des sous-coucheurs, surtout si les œufs ont été stockés plus de 4 jours à 4 °C et (2) le fait que la solubilisation complète des protéines nécessite de réduire et de dénaturer les tampons, ce qui nuit à l’activité biologique intrinsèque des échantillons qui en résultent. En ce qui concerne la première limitation, la séparation mécanique nécessite des compétences techniques mais se réalise facilement après 2 ou 3 formations expérimentales. Certains petits morceaux d’IPL peuvent rester attachés à la BPO et vice versa car les deux sous-coucheurs sont étroitement associés. Toutefois, la contamination d’une sous-couche par l’autre devrait être minime si la séparation mécanique est effectuée avec prudence. Les profils typiques de l’IPL et de la BPO SDS-PAGE après la séparation optimale des sous-couches sont illustrés à la figure 5. En ce qui concerne la deuxième limitation, les étapes expérimentales présentées dans cet article ont été optimisées pour les analyses protéomiques, afin de fournir une liste exhaustive des protéines composant chaque sous-couche. Pour une caractérisation plus complète des activités biologiques de chaque protéine, il est nécessaire de s’arrêter à l’étape 2.1.2, avant d’utiliser des conditions de dénaturation (étape 2.2.1, utilisation du tampon avec SDS et bêta-mercaptoéthanol suivi de l’ébullition). Cependant, il convient de noter que les protéines résultant de l’étape 2.1.2 ne sont que des protéines solubles dans le sel tandis que les protéines insolubles de sel forment des agrégats. Une option pour évaluer davantage leur activité respective peut être de produire des protéines insolubles au sel sous forme de protéines recombinantes à l’aide de systèmes heterologous(E. coli,baculovirus, levure, etc.).
Ce protocole peut être adapté à d’autres œufs aviaires pour des études comparatives afin de mieux apprécier l’originalité de chaque espèce. En effet, pl affiche certaines spécificités d’oiseaux à la fois structurellement et en termes de composition protéique, probablement en raison de l’adaptation à de nouveauxenvironnements, mais aussiaux spécificités de développement 2,6,9,32. L’élaboration de ce protocole qui nécessite une technicité modérée et des équipements/matériaux classiques ouvre de nouvelles voies de recherche dans le domaine de la reproduction et de la spéciation des oiseaux.

Le but de cette méthode est de fournir un protocole qui permet la caractérisation biochimique ultérieure de la couche périvitelline (PL), une mince couche protéique enfermant le jaune d’œuf et jouant un rôle fondamental dans la reproduction des espèces aviaires. Le PL, également appelé « membrane vitelline » dans la littérature, est un réseau tridimensionnel de fibres épaisses composées de plusieurs types de glycoprotéines. Il se compose d’une couche périvitelline intérieure (IPL) (en contact avec le jaune) qui est assemblée dans l’ovaire, et d’une couche périvitelline externe (OPL, en contact avec le blanc), couchée sur l’IPL (figure 1) et produite par l’infundibulum. Ce dernier tissu est le segment supérieur en forme d’entonnoir de l’oviducte recevant le follicule jaune mûr après ovulation, et le site où la fécondation a lieu. La sécrétion de la BPO se produit après ces deux événements et est suivie par le dépôt successif du blanc d’œuf et de la coquille d’œuf dans d’autres segments spécifiques de l’oviducte. Les fonctions physiologiques du PL sont non seulement liées à la fécondation et aux premiers stades de l’embryogenèse, mais aussi à la protection physique et moléculaire de l’embryon. L’analyse protéomique de l’œuf de poulet effectuée sur l’ensemble pl a révélé la présence de 137 protéinesdifférentes 1, mais la distribution de la plupart de ces protéines entre IPL et OPL reste à élucider. La quantité minimale de données disponibles dans la littérature indique que l’IPL et la BPO présentent des profils protéiquestrès distincts 2,3,4, ce qui suggère différentes propriétés structurelles et fonctionnelles. La rareté relative des données sur la distribution des protéines entre opl et IPL est probablement due à la difficulté de séparer les deux sous-couches qui sont minces et intégrées.
La méthode présentée ici décrit les conditions à utiliser pour séparer les deux sous-coucheurs avec un impact limité sur leur structure histologique respective tout en préservant leur teneur en protéines, et pour fournir le protocole permettant la solubilisation complète des protéines pour une analyse ultérieure par protéomique. Il comprend deux étapes principales : 1) l’échantillonnage pl et la séparation OPL/IPL et 2) le traitement PL, OPL et IPL pour la solubilisation des protéines et l’électrophoresis pour l’analyse de spectrométrie de masse. Le flux de travail est présenté à la figure 2. Fait notable, bien que le protocole actuel ait été optimisé pour les analyses protéomiques (étape 2.2), il peut être arrêté à certaines étapes pour l’histologie (p. ex., microscopie électronique), les analyses immunohistochimiques, les études fonctionnelles (étape 1) et la purification des protéines solubles dans le sel afin de caractériser leur structure et leur activité biologique (étape 2.1) (figure 2).
La première étape est l’élimination du PL total du jaune d’œuf(figure 2, étape 1.1). Toutes les méthodes publiées commencent par la séparation du blanc d’œuf du jaune manuellement ou à l’aide d’un séparateur d’œufs. Il est suivi par l’enlèvement du reste du blanc d’œuf et de l’épaisse chalazae à l’aide de forceps ou par adsorption sur un papierfiltre 5 (Figure 2A). Ensuite, les techniques sélectionnées pour échantillonner pl sont variables en fonction des articles publiés. Certains papiers comprennent plusieurs lavages du jaune, dans de l’eau déionisée ou distillée1,5,6, dans 0,85 à 1% solution saline2,7,8, dans les solutions tampons telles que 0,15 M NaCl / N-[Tris (hydroxyméthyle)méthyle]-2-acide aminoéthanolesulfonique, pH 7.44, ou en 0.01N HCl (pH 2)3. Ces procédures ont été appliquées au poulet, au canard, au faisan à col annelé, à la perdrix grise, au perroquet cockatiel, au pigeon domestique ou aux oeufs de ratites2,6,9. L’élimination du PL tandis que le jaune d’œuf est maintenu dans une boîte de Pétri sans solutions aqueuse peut être très laborieux car le PL est fragile et le jaune d’œuf a tendance à coller à PL1,5 et reste donc difficile à éliminer par la suite. L’utilisation d’un tampon acide ou d’une solution pendant une heure à 37 °C3 n’est pas non plus privilégiée, car de telles conditions peuvent modifier la structure du PL et entraîner une perte de protéines. Il est également important d’enlever la zone contenant le disque germinal car cette zone est susceptible d’avoir un modèle structurel et moléculaire distinct, qui ne reflète pas l’ensemble pl4,6,10 ( Figure2B). Cette méthode tire parti des idées mises en évidence par certains articles publiés et propose quelques améliorations pour faciliter l’échantillonnage pl tout en préservant son intégrité (Figure 2C).
La deuxième étape consiste à séparer les deux sous-coucheurs(figure 2, étape 1.2). Cette étape est cruciale, car la BPO et l’IPL sont étroitement liées l’une à l’autre. Cette étape doit être effectuée avec soin avec des forceps sous un microscope à disséquer des jumelles. Les publications signalant la séparation OPL/IPL sontassez limitées 2,3,7,11 etcertaines d’entre elles utilisent des conditions spécifiques (tampon acide à 37 °C pour 1 h2,3) qui sont susceptibles d’affecter la structure histologique des sous-couchettes et/ou de contribuer à la perte de protéines ou aux contaminations jaunes ou blanches. Pour mieux distinguer la BPO de l’IPL, certains auteurs ont signalé l’utilisation du bleu toluidine pour colorer légèrement la BPO (la couche interne reste incolore)11. Dans la méthode développée, nous avons optimisé les conditions afin que la séparation soit facilement réalisée et ne nécessite pas l’utilisation d’un colorant (Figure 2D).
La deuxième étape principale est la solubilisation des protéines composant chaque sous-couche. Classiquement, il est réalisé en mélangeant propre lyophilisé1,séché 2,6, ou fraîchementpréparé 3,4,11 PL / sous-couchettes directement avec le tampon Laemmli utilisé pour l’électrophoresis. D’autres auteurs ont préféré une solubilisation préliminaire des couches dans 1% NaCl, dans une solution tampon de 1% SDS2,3,11 ou dans une solution contenant des inhibiteurs de protéase et SDS6 à température ambiante ou Triton suivie de l’incubation à 45 °C12, sous agitation vigoureuse constante. Quelques auteurs ont également décrit un protocole où le PL a été incubé dans le salin tampon de phosphate ou l’urée et soumis à la sonication13. Ces traitements ont tous été suivis d’une centrifugation et d’une dilution dans le tampon de Laemmli et partagent tous l’inconvénient d’une solubilisation incomplète des protéines à partir de couches, car la matière insoluble (la pastille obtenue après centrifugation) est rejetée de l’échantillon à analyser.
En outre, l’utilisation de conditions de dénaturation (urée, détergent, température élevée, etc.) par certains auteurs pour la solubilisation des protéines n’est pas compatible avec la purification ultérieure des protéines pour la caractérisation car elles sont susceptibles d’inactiver irréversiblement les protéines, d’interférer avec leurs activités biologiques et d’altérer leur structure 3D. Pour cette étape spécifique 2, le protocole comprend un premier sous-pas permettant la solubilisation des protéines les plus abondantes dans des conditions non dénaturantes après la détructuration mécanique PL/OPL/IPL, qui n’interférera pas avec d’autres études protéiques, si nécessaire (figure 2, étape 2.1), et un deuxième sous-pas qui permet une solubilisation complète des protéines pour l’électrophorésie et la protéomique en profondeur (figure 2, étape 2.2). Il combine des suggestions provenant de divers articles publiés et des ajustements résultant de nouvelles idées validées par des études expérimentales.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binocular dissecting microscope</td>
			<td>Vision Engineering, France</td>
			<td></td>
			<td>Model Mantis Elite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Cryotec, France</td>
			<td></td>
			<td>Model Cosmos 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean II electrophoresis cell</td>
			<td>Biorad, Hercules, USA</td>
			<td>1652960</td>
			<td>Any apparatus adapted for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM400</td>
			<td>Retsch, Hann, Germany</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td>Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm</td>
			<td>Dutscher, Brumath</td>
			<td>5066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm</td>
			<td>Dutscher, Brumath</td>
			<td>327005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical separation and protein solubilization of the outer and inner perivitelline sublayers from hen's eggs

La couche périvitelline qui entoure le jaune d’œuf joue un rôle fondamental dans la fécondation, dans la défense des œufs et dans le développement de l’embryon aviaire. Il est formé par deux sous-coucheurs protéinés qui sont étroitement associés et formés par des organes reproducteurs femelles distincts. Les deux structures sont supposées avoir leurs propres spécificités fonctionnelles, qui restent à définir. Pour caractériser la fonction des protéines composant chaque sous-couche, le premier défi est d’établir les conditions qui permettraient la séparation mécanique de ces deux couches complexes, tout en limitant tout dommage structurel. La deuxième étape consiste à optimiser les conditions expérimentales pour faciliter la solubilisation des protéines de ces deux sous-coucheurs, pour des analyses biochimiques ultérieures. L’efficacité de cette approche est évaluée en analysant le profil protéique de chaque sous-couche par l’électrophoresis de gel de sodium Dodecyl Sulfate-Poly-Acrylamide (SDS-PAGE), qui devrait être distinct entre les deux structures. Cette procédure en deux étapes reste simple; il nécessite de l’équipement biochimique classique et des reagents; et est compatible avec d’autres protéomiques en profondeur. Il peut également être transposé à d’autres œufs aviaires pour une biologie comparative, sachant que la structure et la composition de la couche périvitelline ont des caractéristiques spécifiques aux espèces. En outre, les conditions non dénaturantes développées pour la séparation des sous-coucheurs (étape 1) permettent leurs analyses structurelles par microscopie électronique de balayage et de transmission. Il peut également constituer l’étape initiale de la purification ultérieure des protéines pour analyser leurs activités biologiques respectives et leur structure 3D, ou pour effectuer d’autres analyses immunohistochimiques ou fonctionnelles. De telles études contribueraient à déchiffrer la fonction physiologique de ces deux sous-coucheurs, dont les intégrités structurelles et fonctionnelles sont des critères déterminants du succès reproducteur.

La BPO et l’IPL ont été séparées du PL d’un œuf non fécondé fraîchement pondu afin d’analyser leur profil protéique par SDS-PAGE. Le flux de travail expérimental de l’ensemble du protocole est illustré à la figure 2. La figure 3 montre la libération de protéines à différentes concentrations de Tris (figure 3A), divers pH (figure 3B) et différentes concentrations de NaCl (Figure 3C). Les deux sous-coucheurs qui en résultent ont été observés à la lumière du microscope à disséquer les jumelles et sont indiqués à la figure 4 où l’IPL est translucide tandis que la BPO est dense, trouble et blanchâtre. Ces caractéristiques peuvent en partie témoigner de l’efficacité de la séparation du sous-coucheur.
Après la séparation, OPL et IPL ont été lyophilisés indépendamment, et leur teneur en protéines a été complètement dissoute grâce à une combinaison de broyage mécanique, l’utilisation d’un détergent anionique (SDS), et un agent réducteur (bêta-mercaptoéthanol), suivie de l’ébullition. Après la migration dans un gel polyacrylamide (électrophoresis SDS-PAGE), les échantillons de la BPO et de l’IPL présentent des profils électrophorétiques distincts (figure 5), comme prévu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61739/61739fig01.jpg"> Figure 1 : Structure du PL d’un œuf non fécondé fraîchement pondu. Micrographe de microscopie électronique de représentation schématique et de transmission de l’ensemble pl en coupe transversale (données personnelles, ©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique, Université et CHRU de Tours, France, S. Georgeault). Notez que cette image a été obtenue de PL préparé tel que présenté dans ce protocole. OPL, couche périvitelline externe; IPL, couche périvitelline intérieure. La pointe de flèche noire indique la membrane continue séparant les deux sous-coucheurs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61739/61739fig01large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61739/61739fig02.jpg"> Figure 2 : Workflow résumant les deux étapes principales du protocole et des exemples d’applications. Le protocole a été optimisé pour l’analyse protéomique des couches PL, mais il peut être arrêté à certaines étapes pour d’autres applications. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61739/61739fig02large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61739/61739fig03.jpg"> Figure 3 : Optimisation de la composition tampon pour l’échantillonnage pl. En bref, le PL propre (n = 4) a été incubé dans le même volume des diverses solutions tampons pendant 2 h.PL a été enlevé, et la concentration de protéine a été estimée en mesurant l’absorption à 280 nm dans le tampon restant. (A) Effet de la concentration de Tris-HCl au pH 8. (B) Effet du pH (7 à 9). (C) Effet de la concentration de NaCl. À partir de ces résultats, nous avons conclu que le tampon composé de 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM NaCl est le plus approprié car il limite la perte de protéines. Les résultats sont exprimés comme une ± écart type de quatre échantillons de PL différents. Des analyses statistiques ont été effectuées à l’aide d’ANOVA uni-sens suivies d’un test de comparaisons multiples de Tukey. La valeur P <0,05 a été considérée comme importante (ns, non significative; * p<0.05, *** p<0.001, **** p<0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61739/61739fig03large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61739/61739fig4v2.jpg"> Figure 4 : La BPO et l’IPL sont dotées d’un microscope à disséquer des jumelles. Après la séparation, IPL (à droite) est apparu translucide et OPL (à gauche) était opaque. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61739/61739fig04large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61739/61739fig5v2.jpg"> Figure 5 : Analyse SDS-PAGE de la BPO et de l’IPL séparées à partir d’œufs non fécondés fraîchement pondus. Gel d’acrylamide de 4%-20% suivi de la coloration bleue brillante de Coomassie. La masse des bandes standard de poids moléculaire est indiquée dans kDa. Le profil OPL principalement composé de protéines avec une masse moléculaire >30 kDa tandis que les bandes principales détectées sur le profil IPL ont des masses moléculaires <30 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61739/61739fig05large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

Cet article rapporte une méthode simple pour isoler les sous-couches périvitelline externes et intérieures des oeufs de poulet tout en minimisant l’altération structurale et d’optimiser la solubilisation des protéines de chaque sous-couche pour les analyses protéomiques.

Séparation mécanique et solubilisation protéique des sous-couches périphériques extérieures et intérieures des œufs de poule

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...

Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour échantillonner les sous-coucheurs de membrane périvitelline des oeufs aviaires pour une étude plus approfondie de leur rôle physiologique dans la reproduction des oiseaux. L’échantillonnage de la membrane périvitelline a été optimisé à chaque étape afin de limiter les dommages structurels et moléculaires. Le protocole a été développé pour la protéomique en profondeur.Commencez par prél échantillonnage de la couche périvitelline ou PL à partir d’un œuf non fécondé fraîchement pondu. Casser l’œuf et utiliser un séparateur d’œufs pour séparer le jaune du blanc. Retirer le chalazae avec de petits ciseaux et rouler le jaune sur un papier filtre pour enlever l’albumine adhérente qui apparaît comme une structure transparente mais visible.Immerger le jaune dans un cristallisateur contenant 10 millimlaires Tris HCL au pH huit qui a été préalablement refroidi à quatre degrés Celsius et enlever la zone PL sur le disque germinal dans une zone d’un centimètre à l’aide de ciseaux contondants. Rompre le PL avec de petits ciseaux à l’intérieur du tampon, puis tenir les deux bords du PL rompu avec des forceps et le peler du jaune. Rincez le PL plusieurs fois dans des bains de 10 millimolar Tris HCL jusqu’à ce qu’aucune trace de jaune ne soit visible.Assurez-vous que le PL est propre, blanc et flottant dans le tampon. Traiter le PL pour la séparation des sous-couches ou procéder directement à des analyses biochimiques. Pour séparer la BPO et l’IPL, répartir l’échantillon entier avec la BPO face vers le haut dans une boîte en plastique de Petri remplie de 10 millimollar Tris HCL et chlorure de sodium de 50 millimlaires et le maintenir à plat avec le moins de rides possible.Déterminer l’emplacement du chalazae restant qui n’est attaché qu’à la BPO. Ensuite, couper l’ensemble pl en morceaux d’environ deux par trois centimètres avec de petits ciseaux. Séparez mécaniquement les deux couches avec des forceps de pointe ultra précis sous un microscope disséquant.Conservez les échantillons ipl et OPL qui en résultent individuellement dans des micro tubes à un taux négatif de 80 degrés Celsius jusqu’à nouvel usage. Pour effectuer la solubilisation primaire des protéines, congelez les échantillons de l’IPL et de la BPO individuellement pour enlever le reste de l’eau, puis coupez environ un milligramme de chaque échantillon et placez-le à l’intérieur d’un micro tube propre avec un bouchon à vis étanche. Gardez les échantillons restants dans des tubes bien fermés pour un stockage prolongé à 20 ou 80 degrés Celsius négatifs.Mélanger un milligramme de chaque sous-couche lyophilisée avec 400 microlitres de Tris de 50 millimlaires au chlorure de sodium pH sept et 500 millimlaires. Utilisez un moulin à mélangeur deux fois pendant cinq minutes à 30 Hertz pour désintégrer les structures en microparticules et faciliter la solubilisation des protéines. Recueillir 400 microlitres des échantillons dans deux micro tubes propres.Pour préparer les échantillons à l’électrophorèse, ajoutez un tampon d’échantillon SDS-PAGE 5X à chaque échantillon de 400 microlitres et chauffez-le à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes. Chargez un maximum de 20 microgrammes de protéines dans chaque voie d’un gel polyacrylamide SDS de gradient de 4 à 20 % et effectuez l’électrophorèse à 120 volts. Après l’électrophoresis, retirer le gel des plaques de verre et le tacher avec coomassie brilliant blue solution pendant 30 minutes, puis de-tacher avec une solution composée de 50% d’eau, 40% d’éthanol et 10% d’acide acétique jusqu’à ce que le fond gel apparaît bleu clair.Transférer le gel dans une boîte de Pétri contenant de l’eau déionisée pour la dé-coloration et la réhydratation. Les protéines doivent apparaître sous forme de bandes bleues avec un fond transparent. Le PL a été soumis à divers tampons pour identifier les conditions permettant une perte minimale de protéines et une séparation optimale des sous-couches.Les protéines libérées à différentes concentrations de Tris, de pH et de chlorure de sodium sont présentées ici. Les deux sous-couchettes qui en ont résulté ont été observées au microscope disséquant. L’IPL est translucide tandis que la BPO est dense, nuageuse et blanchâtre.Après la séparation, opl et IPL ont été lyophilisés indépendamment et leur teneur en protéine a été complètement dissoute utilisant une combinaison de broyage mécanique, d’un détergent anionique, d’un agent réducteur, et d’ébullition. Les échantillons présentaient des profils électrophorétiques distincts sur un gel polyacrylamide. Lorsque vous essayez ce protocole, gardez à l’esprit que la séparation des sous-coucheurs est une étape critique de la procédure et doit être effectuée à l’aide d’un microscope binoculaire dans un tampon contenant une concentration minimale de sel.Pour élucider davantage leur fonction physiologique respective, les échantillons de sous-coucheur de membrane périvitelline peuvent être analysés pour la caractérisation histologique à l’aide de la microscopie électronique et pour des études fonctionnelles utilisant des analyses d’imagerie et la migration cellulaire.

Research

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