Name: mechanical separation and protein solubilization of the outer and inner perivitelline sublayers from hen's eggs
Uploaded: 2021-01-27T13:00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs at JoVE.com

Мы благодарны Филиппу Дидье и Карине Ангер (INRAE, PEAT, 37380, Nouzilly, Франция, https://doi.org/10.15454/1.5572326250887292E12) за предоставление неутвержированных иса-коричневых яиц. Мы также благодарим Университет Туров, Франция за финансирование докторской степени М. Брегеона. Эта работа получила финансовую поддержку от Французского национального исследовательского агентства (ЭЗЛИПСЕ, ANR-19-CE21-0006).

1.PL, IPL и OPL выборки
<ol><li>Выборка PL
	<ol>
<li>Разбейте свежеотложенное неутяжнутое яйцо вручную и используйте яичный сепаратор, лежащий на стакане, чтобы отделить желток от белого. Удалите chalazae с небольшими ножницами и свернуть желток на фильтровальную бумагу, чтобы удалить приверженец альбуна, который появляется как прозрачная и видимаяструктура (рисунок 2A). ВНИМАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не проколоть PL ножницами. Использование пинцета вместо ножниц для удаления chalazas может спровоцировать PL поломки и последующей утечки желтка. Подвижной шаг на фильтровальной бумаге имеет решающее значение и должен выполняться очень быстро из-за абсорбентных свойств бумажного фильтра, который может вызвать pl поломку. Также очень важно использовать неутвереное яйцо со дня выкладки, чтобы оптимизировать успех этого первого шага и всех последующих шагов. Кроме того, яйца, которые хранились менее 10 дней в охлажденой среде могут быть использованы, но экспериментаторы должны учитывать потенциальные риски изменения PL.</li>
		<li>Погрузите желток в кристаллизатор, содержащий 10 мМ Трис-HCl pH 8, который ранее был охлажден до 4 градусов по Цельсию и удалите область PL над зародышевым диском в пределах 1 см зоны с помощью тупых ножниц(рисунок 2B). ПРИМЕЧАНИЕ: Первоначально PL был погружен в деионизированную воду, но этот подход имеет некоторые недостатки, такие как отсутствие контроля рН и трудности для отдельных субслой после этого (шаг 1.2). Таким образом, было протестировано несколько условий, включая концентрациюТриса (рисунок 3A)и рН(рисунок 3B). Использование буфера при рН 8, вместо деионизированной или деминерализованной воды, соответствует физиологии яиц (рН яичного белка составляет около 7,8 в день выкладки)14 и сводит к минимуму потерю белка. В отличие от этого, кислый или очень щелочный рН, как сообщается, вызывает PL де-структурации и ранней растворения белка(рисунок 3B). Буфер, состоящий из 10 мМ Трис-HCl рН 8 было установлено, что оптимальный, так как он уважает физиологию яйца и не вызывает значительной солубилизации белка (концентрация белка в рабочем буфере остается минимальной, рисунок 3A,B).</li>
		<li>Разрыв PL с небольшими ножницами в буфере. Держите два края разорванного PL с типсами и очистить PL от желтка.</li>
		<li>Поддерживайте PL с типсами и промыть PL несколько раз в нескольких ваннах 10 мМ Tris-HCl, рН 8, пока не будет видно следов желтка. На этом этапе убедитесь, что PL чист, бел и плавает в буфере. Он может быть обработан в шаге 1.2 для разделения подслоя или непосредственно для шага 2.1 для биохимического анализа.</li>
	</ol></li>
	<li>Выборка OPL и IPL
	<ol>
<li>Распределить весь образец PL, поставив OPL вверх в пластиковую чашку Петри и поддержание его плоским с как можно меньше морщин, как это возможно. Обложка образца с 10 мМ Трис-HCl рН 8, 50 мМ. NaCl. Используйте пластиковую чашку Петри (а не стекло), чтобы ограничить движения PL, потому что PL палочки лучше пластика.<ol>
<li>Чтобы найти сторону OPL, посмотрите, где расположение остальных chalazae, которые прикреплены к OPL, а не IPL. Этот шаг требует небольшой концентрации NaCl (50 мМ) для облегчения разделения подслой. ПРИМЕЧАНИЕ: На основе графика, представленного на рисунке 3C илитературе 11, эта концентрация не должна привести к значительной потере белка. Первоначально, деионизированная вода была использована для того чтобы отделить sublayers, какописано ранее 1,5,6, но эта техника была найдена, что была очень laborious и привела к в изменении структурной герметичности PL. Таким образом, различные концентрации NaCl (Рисунок 3C) были протестированы, как соль способствовала разделению двух подслоев. Тем не менее, примечательно, что использование концентрации NaCl (gt;100 mM увеличивает солубилизацию/высвобождение белка из PL, что не является целью здесь (это будет целью в шаге 2) (Рисунок 3C). Добавление 50 мM NaCl к буферу 10 мМ Tris-HCl pH 8 облегчает разделение двух подслоев и сводит к минимуму потерю белка.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Вырезать общий PL на куски около 2 см х 3 см с небольшими ножницами. Механически отделить два слоя каждого кусок PL с ультра-точный кончик типсов под бинокулярным рассечением микроскопа(рисунок 4). Храните полученные образцы IPL и OPL индивидуально в микротрубочках при -80 градусах Цельсия, до дальнейшего использования. ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Следует отметить, что эффективность и механизм разделения двух слоев во многом зависит от свежести яйца. Действительно, хранящиеся яйца показывают радикальные внутренние изменения в связи с быстрым увеличением рН яичного белка и последующим изменением индекса желтка из-за ослабления PL (и ослабления). IPL является более хрупким по сравнению с OPL. Поэтому предпочтительнее разместить лицо OPL выше и отделить два подслоя, потянув на OPL с типсами. Оба подслоя должны быть обработаны с драгоценной осторожностью.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Примеры лечения солубилизации белка и анализа SDS-PAGE
<ol><li>
Первичная белковая solubilization
	<ol>
<li>Заморозка сухих образцов IPL и OPL по отдельности. После замораживания сушки завершена, вырезать приблизительно 1 мг из каждого образца в чистых микротрубок, обладающих утечки доказательство винт крышка. Храните оставшиеся образцы в плотно закрытых трубках для длительного хранения при -80 градусов по Цельсию. ПРИМЕЧАНИЕ: Использование микротрубок с крышкой винт доказательства утечки обеспечивает герметичное и защитимое от утечки закрытие для предотвращения регидратации образца и что обеспечит образцы.</li>
		<li>Смешайте 1 мг каждого лиофилизированного подслойщика с 400 МКЛ 50 мм Трис рН 7, 500 мМн NaCl. Используйте смеситель-мельницу в течение 2 раз в течение 5 мин при 30 Гц, чтобы распасть структуры OPL и OPL в микрочастицах и облегчить солубилизацию белка. Соберите 400 МКЛ образцов, содержащих OPL и IPL в двух чистых микротрубочных каналах. ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер, используемый здесь, был выбран для увеличения солубилизации белка (в отличие от шага 1). Этот буфер был основан на результатах, представленных на рисунке 3, которые показывают увеличение белка solubilization на рН 7 (Рисунок 3B) и с использованием 0,5 M NaCl (Рисунок 3C). Протокол можно приостановить здесь. На этом этапе образцы могут быть использованы для очистки белка основных белков PL или обработаны для шага 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Белковая solubilization для электрофореза
	<ol>
<li>Добавьте 5x буфер выборки SDS-PAGE (100 йл, 0,25 M Tris-HCl, 0,05% бромофенола синего, 50% глицерол, 5% SDS, 5% бета-меркаптоэтанола, рН 6,8) к каждому 400 йл образца и тепла при температуре 100 градусов по Цельсию за 5 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь, а образцы можно хранить при -80 градусов по Цельсию. На данном этапе протокола OPL и IPL полностью распущены. Эффективность солубилизации образца можно оценить с помощью центрифугирования образцов в течение 5 мин при 10 000 х г. Полная solubilization характеризуется отсутствием видимых гранул после центрифугации. Таким образом, после полной solubilization, считается здесь, что 1 мг лиофилинизированных sublayer соответствует 1 мг белков (концентрация белка в 500 Л образца составляет 2 мг / мл). Действительно, PL состоит из более чем 80% белка2,15. Использование буфера выборки 5x ограничивает разбавление образца, но также может быть использован буфер образца 1x или 2x.</li>
		<li>Загрузите максимум 20 мкг белков/полосы на полиакриламидный гель SDS (4%-20% градиентного геля) и выполните электрофорез при 120 V с помощью вертикальной электрофорезной системы. ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 4%-20% градиентного геля не является обязательным, но предпочтительнее здесь, как OPL и IPL экспонат белков с молекулярными весами, начиная от lt;10 kDa до 250 кДа. Было бы также полезно сохранить укладку геля (который обычно удаляется), так как наличие нерастворимых белков или белковых агрегатов на дне скважин будет указывать на плохую растворимую информацию и возможный недостающий шаг во время подготовки образца.</li>
		<li>После электрофорез, удалить гели из стеклянных пластин и пятно с Coomassie Блестящий синий раствор (50% H2O, 40% EtOH, 10% уксусной кислоты, и R250 Coomassie Блестящий синий) в течение 30 мин.</li>
		<li>Де-пятно с раствором, состоящим из 50% H2O, 40% EtOH, 10% уксусной кислоты раствор, пока гель фон появляется светло-голубой.</li>
		<li>Наконец передать гель в чашках Петри, содержащих деионизированную воду, для достижения де-окрашивания и регидратации полиакриламидных гелей. Белки должны отображаться как синие полосы прозрачного фона.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Mann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+the+chicken+egg+vitelline+membrane.">Proteomic analysis of the chicken egg vitelline membrane.</a> Proteomics. 8 (11), 2322-2332 (2008).</li><li>Chung, W. H., Lai, K. M., Hsu, K. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+on+histological+structures+of+the+vitelline+membrane+of+hen+and+duck+egg+observed+by+cryo-scanning+electron+microscopy.">Comparative study on histological structures of the vitelline membrane of hen and duck egg observed by cryo-scanning electron microscopy.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (3), 1794-1799 (2010).</li><li>Kido, S., Doi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+and+Properties+of+the+Inner+and+Outer+Layers+of+the+Vitelline+Membrane+of+Hen's+Eggs.">Separation and Properties of the Inner and Outer Layers of the Vitelline Membrane of Hen's Eggs.</a> Poultry Science. 67 (3), 476-486 (1988).</li><li>Steele, M. G., Meldrum, W., Brillard, J. P., Wishart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+avian+spermatozoa+with+the+perivitelline+layer+in-vitro+and+in-vivo.">The interaction of avian spermatozoa with the perivitelline layer in-vitro and in-vivo.</a> Journal of Reproduction and Fertility. 101 (3), 599-603 (1994).</li><li>Bain, J. M., Hall, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+development+and+structure+of+the+vitelline+membrane+of+the+hen's+egg:+an+electron+microscope+study.">Observations on the development and structure of the vitelline membrane of the hen's egg: an electron microscope study.</a> Australian Journal of Biological Sciences. 22 (3), 653-665 (1969).</li><li>Damaziak, K., Kieliszek, M., Buclaw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+structure+and+protein+of+vitelline+membranes+of+precocial+(ring-necked+pheasant,+gray+partridge)+and+superaltricial+(cockatiel+parrot,+domestic+pigeon)+birds.">Characterization of structure and protein of vitelline membranes of precocial (ring-necked pheasant, gray partridge) and superaltricial (cockatiel parrot, domestic pigeon) birds.</a> PLoS One. 15 (1), 0228310 (2020).</li><li>Bellairs, R., Harkness, M., Harkness, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vitelline+membrane+of+the+hen's+egg:+a+chemical+and+electron+microscopical+study.">The vitelline membrane of the hen's egg: a chemical and electron microscopical study.</a> Journal of Ultrastructure Research. 8 (3-4), 339-359 (1963).</li><li>Kido, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+vitelline+membrane+outer+layer+protein+I,+VMO-I:+amino+acid+sequence+and+structural+stability.">Characterization of vitelline membrane outer layer protein I, VMO-I: amino acid sequence and structural stability.</a> Journal of Biochemistry. 117 (6), 1183-1191 (1995).</li><li>Damaziak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+structure+and+strength+of+vitelline+membrane+and+physical+parameters+of+yolk+of+ostrich,+emu,+and+greater+rhea+eggs.">Comparative analysis of structure and strength of vitelline membrane and physical parameters of yolk of ostrich, emu, and greater rhea eggs.</a> Poultry Science. 97 (3), 1032-1040 (2018).</li><li>Kirunda, D. F., McKee, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+quality+characteristics+of+aged+eggs+and+fresh+eggs+to+vitelline+membrane+strength+as+determined+by+a+texture+analyzer.">Relating quality characteristics of aged eggs and fresh eggs to vitelline membrane strength as determined by a texture analyzer.</a> Poultry Science. 79 (8), 1189-1193 (2000).</li><li>Back, J. F., Bain, J. M., Vadehra, D. V., Burley, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+outer+layer+of+the+vitelline+membrane+of+hen's+eggs.">Proteins of the outer layer of the vitelline membrane of hen's eggs.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 705 (1), 12-19 (1982).</li><li>Waclawek, M., Foisner, R., Nimpf, J., Schneider, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chicken+homologue+of+zona+pellucida+protein-3+is+synthesized+by+granulosa+cells.">The chicken homologue of zona pellucida protein-3 is synthesized by granulosa cells.</a> Biology of Reproduction. 59 (5), 1230-1239 (1998).</li><li>Okumura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+newly+identified+zona+pellucida+glycoprotein,+ZPD,+and+dimeric+ZP1+of+chicken+egg+envelope+are+involved+in+sperm+activation+on+sperm-egg+interaction.">A newly identified zona pellucida glycoprotein, ZPD, and dimeric ZP1 of chicken egg envelope are involved in sperm activation on sperm-egg interaction.</a> Biochemical Journal. 384, 191-199 (2004).</li><li>Guyot, N., Rehault-Godbert, S., Nys, Y., Baron, F., Roberts, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+natural+antibacterial+defences+of+egg+white+and+their+regulation.">Understanding the natural antibacterial defences of egg white and their regulation.</a> Achieving Sustainable Production of Eggs Volume 1. 1, 161-193 (2016).</li><li>Trziszka, T., Smolinska, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Characterization+of+the+Vitelline+Membrane+of+Hens+Eggs.">Chemical Characterization of the Vitelline Membrane of Hens Eggs.</a> Food Chemistry. 8 (1), 61-70 (1982).</li><li>Berardinelli, A., Ragni, L., Giunchi, A., Gradari, P., Guarnieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical-mechanical+modifications+of+eggs+for+food-processing+during+storage.">Physical-mechanical modifications of eggs for food-processing during storage.</a> Poultry Science. 87 (10), 2117-2125 (2008).</li><li>Kelley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+storage+time+on+vitelline+membrane+protein+banding+patterns+and+interior+egg+quality+of+eggs+from+nonmolted+and+molted+hens.">The effects of storage time on vitelline membrane protein banding patterns and interior egg quality of eggs from nonmolted and molted hens.</a> Texas A&amp;M University. , (2003).</li><li>Schafer, A., Drewes, W., Schwagele, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+vitelline+membrane+proteins+of+fresh+and+stored+eggs+via+HPLC.">Analysis of vitelline membrane proteins of fresh and stored eggs via HPLC.</a> Zeitschrift F&#252;r LebensmittelUntersuchung Und-Forschung A. Food Research and Technology. 206 (5), 329-332 (1998).</li><li>Romanoff, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The avian embryo: Structural and functional development. , (1960).</li><li>Haas, H. J., Spratt, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributions+to+an+analysis+of+the+avian+vitelline+membrane's+potential+to+promote+outgrowth+of+the+yolk+sac-serosal+membrane.">Contributions to an analysis of the avian vitelline membrane's potential to promote outgrowth of the yolk sac-serosal membrane.</a> The Anatomical Record. 184 (2), 227-231 (1976).</li><li>Jensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+changes+in+the+avian+vitelline+membrane+during+embryonic+development.">Ultrastructural changes in the avian vitelline membrane during embryonic development.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 21 (3), 467-484 (1969).</li><li>Barbato, G. F., Cramer, P. G., Hammerstedt, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+in+vitro+sperm-egg+binding+assay+that+detects+subfertile+males.">A practical in vitro sperm-egg binding assay that detects subfertile males.</a> Biology of Reproduction. 58 (3), 686-699 (1998).</li><li>New, D. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Adhesive+Properties+and+Expansion+of+the+Chick+Blastoderm.">The Adhesive Properties and Expansion of the Chick Blastoderm.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 7 (2), 146-164 (1959).</li><li>New, D. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+New+Technique+for+the+Cultivation+of+the+Chick+Embryo.">A New Technique for the Cultivation of the Chick Embryo.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 3 (4), 326-331 (1955).</li><li>Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+components+of+the+vitelline+membrane+of+hen's+egg.+I.+Membrane+structure+and+its+deterioration+with+age.">Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. I. Membrane structure and its deterioration with age.</a> Journal of Biochemistry. 78 (2), 261-268 (1975).</li><li>Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+components+of+the+vitelline+membrane+of+hen's+egg.+II.+Physicochemical+properties+of+glycoprotein+I.">Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. II. Physicochemical properties of glycoprotein I.</a> Journal of Biochemistry. 79 (6), 1351-1356 (1976).</li><li>Kido, S., Janado, M., Nunoura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+components+of+the+vitelline+membrane+of+hen's+egg.+III.+Physicochemical+properties+of+glycoprotein+II.">Macromolecular components of the vitelline membrane of hen's egg. III. Physicochemical properties of glycoprotein II.</a> Journal of Biochemistry. 81 (5), 1543-1548 (1977).</li><li>R&#233;hault-Godbert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovalbumin-related+protein+X+is+a+heparin-binding+ov-serpin+exhibiting+antimicrobial+activities.">Ovalbumin-related protein X is a heparin-binding ov-serpin exhibiting antimicrobial activities.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (24), 17285-17295 (2013).</li><li>Gautron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovotransferrin+is+a+matrix+protein+of+the+hen+eggshell+membranes+and+basal+calcified+layer.">Ovotransferrin is a matrix protein of the hen eggshell membranes and basal calcified layer.</a> Connective Tissue Research. 42 (4), 255-267 (2001).</li><li>Guyot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+egg+white+heparin-binding+proteins:+towards+the+identification+of+natural+antibacterial+molecules.">Proteomic analysis of egg white heparin-binding proteins: towards the identification of natural antibacterial molecules.</a> Scientific Reports. 6, 27974 (2016).</li><li>Guyot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=function,+and+evolution+of+Gga-AvBD11,+the+archetype+of+the+structural+avian-double-beta-defensin+family.">function, and evolution of Gga-AvBD11, the archetype of the structural avian-double-beta-defensin family.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 337-345 (2020).</li><li>Mori, M., Masuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+vitelline+membrane+of+quail+(Coturnix+coturnix+japonica)+eggs.">Proteins of the vitelline membrane of quail (Coturnix coturnix japonica) eggs.</a> Poultry Science. 72 (8), 1566-1572 (1993).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Целью данного метода является предоставление протокола, который позволяет последующую биохимическую характеристику слоя перивителлина (PL), тонкого белкового слоя, прилагающего яичный желток и играющего основополагающую роль в воспроизводстве птичьего вида. PL, также названный «вителлиновой мембраной» в литературе, является трехмерной сетью толстых волокон, состоит из нескольких типов гликопротеинов. Он состоит из внутреннего слоя перивиллина (IPL) (в контакте с желтком), который собирается в яичнике, и внешнего слоя перивителлина (OPL, в контакте с белым), лежащего на IPL(рисунок 1) и производится infundibulum. Эта последняя ткань является воронкой, как верхний сегмент яйцеклетки получения зрелых желток фолликула после овуляции, и место, где происходит оплодотворение. Секреция OPL происходит после этих двух событий и сопровождается последовательным отложением яичного белка и яичной скорлупы в других конкретных сегментах яйцеклетки. Физиологические функции PL связаны не только с оплодотворением и ранними стадиями эмбриогенеза, но и с физической и молекулярной защитой эмбриона. Протеомный анализ куриного яйца, выполненный в целом PL показал наличие 137различных белков 1, но распределение большинства из этих белков между IPL и OPL еще предстоит выяснить. Минимальное количество данных, доступных в литературе сообщают, что IPL и OPL демонстрируюточень различные профили белка 2,3,4, что свидетельствует о различных структурных и функциональных свойств. Относительная нехватка данных о распределении белков между OPL и IPL, вероятно, объясняется сложностью разделения обоих субслой, которые являются тонкими и встроенными.
Представленный здесь метод описывает условия, которые будут использоваться для разобщения двух субслой с ограниченным воздействием на их гистологическую структуру при сохранении их содержания белка, а также для обеспечения протокола, разрешающий полную solubilization белков для последующего анализа протеомией. Она включает в себя два основных шага: 1) PL выборки и OPL / IPL разделения и 2) PL, OPL, и IPL лечения белка solubilization и электрофорез для анализа масс-спектрометрии. Рабочий процесс представлен на рисунке 2. Примечательно, что, хотя настоящий протокол был оптимизирован для протеомных анализов (шаг 2.2), его можно остановить на некоторых этапах для гистологического (например, электронной микроскопии), иммуногистохимического анализа, функциональных исследований (шаг 1), а также для очистки солерастворимых белков с целью характеристики их структуры и биологической активности (шаг 2.1) (рисунок 2).
Первым шагом является удаление общего PL из яичного желтка(рисунок 2, шаг 1.1). Все опубликованные методы начинаются с отделения яичного белка от желтка вручную или с помощью яичного сепаратора. За ним следует удаление оставшегося яичного белка и толстых chalazae с помощью типсов или adorption на фильтровальнойбумаге 5 (Рисунок 2A). Далее методы, выбранные для выборки PL, являются переменными в зависимости от опубликованных статей. Некоторые документы включают в себя несколько моет желтка, в деионизированнойили дистиллированной воды 1,5,6, в 0,85 до 1%солевой раствор 2,7,8, в буферизации решений, таких как 0,15 M NaCl/ N-Tris (гидроксиметил)метил-2-аминоэтанесульфоновой кислоты, рН 7,44, или в 0,01N HCl (рН 2)3. Эти процедуры были применены к курице, утке, кольчатому фазану, серой куропатке, какатий попугаю, домашнему голубю илияйцам крысиных клещей 2,6,9. Удаление PL в то время как яичный желток поддерживается в чашке Петри без aqueous решения могут быть очень трудоемкими, как PL является хрупким и яичный желток, как правило, придерживаться PL1,5 и,следовательно, остается трудно устранить потом. Использование кислого буфера или раствора в течение часа при 37 градусовпо Цельсию 3 также не является предпочтительным, поскольку такие условия могут изменить структуру PL и могут привести к потере белка. Важно также удалить область, содержащую зародышевойдиск,как эта зона, вероятно, имеют различные структурные и молекулярные модели, которая не отражает весь PL4,6,10 (Рисунок 2B). Этот метод использует идеи, выделенные в некоторых опубликованных статьях, и предлагает некоторые улучшения для облегчения отбора проб PL, сохраняя при этом егоцелостность (рисунок 2C).
Второй шаг состоит из разделения двух подслоев(рисунок 2, шаг 1.2). Этот шаг имеет решающее значение, поскольку OPL и IPL тесно связаны друг с другом. Этот шаг следует тщательно проводить с помощью типсов под бинокулярным рассечением микроскопа. Публикации отчетности OPL / IPL разделениядовольно ограничены 2,3,7,11 инекоторые из них используют конкретные условия (кислотный буфер при 37 градусов по Цельсию для 1 ч2,3), которые могут повлиять на гистологическую структуру субслой и / или способствовать потере белка или желтка или белого загрязнения. Чтобы лучше отличить OPL от IPL, некоторые авторы сообщили об использовании толуйдина синий слегка цвет OPL (внутренний слой остается бесцветным)11. В разработанном методе мы оптимизировали условия так, чтобы разделение было легко достигнуто и не требует использования какого-либо красителя(рисунок 2D).
Вторым основным шагом является solubilization белков, составляя каждый подслой. Классически, это достигается путем смешивания чистых лиофилизированных1,сушеные 2,6, или свежеприготовленные3,4,11 PL / сублейеров непосредственно с буфером Laemmli используется для электрофореза. Другие авторы предпочли предварительную solubilization слоев в 1% NaCl, в 1% SDS буферизациирешение 2,3,11 или врастворе,содержащем ингибиторыпротеазы и SDS 6 при комнатной температуре или Тритон следуют инкубации при 45 C12, при постоянном энергичном перемешивании. Некоторые авторы также описали протокол, где PL был инкубирован в фосфатный буфер солевой раствор или мочевина и подвергается sonication13. Все эти методы лечения сопровождались центрифугой и разбавлением в буфере Laemmli, и все они имеют недостаток неполной растворимой растворимости белка из слоев, поскольку нерастворимое вещество (гранулы, полученные после центрифугации) выбрасывается из образца для анализа.
Кроме того, использование денатурации условий (мочевина, моющее средство, высокая температура и т.д.) некоторыми авторами для растворимости белка не совместимо с последующей очисткой белка для характеристики, поскольку они могут необратимо инактивировать белки, вмешиваться в их биологическую деятельность, а также ухудшать их 3D-структуру. Для этого конкретного шага 2, Протокол включает в себя первый подшаг, позволяющий solubilization наиболее распространенных белков в условиях, не денатурации после PL / OPL / IPL механической де-структурации, которая не будет вмешиваться в дальнейшие исследованиябелка, еслиэто необходимо ( Рисунок 2 , шаг 2.1), и второй шаг, который позволяет для полной solubilization белков для электрофореза и углубленных протеомов(рисунок 2. Он сочетает в себе предложения, взятые из различных опубликованных работ и корректировок в результате новых идей, подтвержденных экспериментальными исследованиями.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Binocular dissecting microscope</td>
			<td>Vision Engineering, France</td>
			<td></td>
			<td>Model Mantis Elite</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Cryotec, France</td>
			<td></td>
			<td>Model Cosmos 80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-Protean II electrophoresis cell</td>
			<td>Biorad, Hercules, USA</td>
			<td>1652960</td>
			<td>Any apparatus adapted for protein electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM400</td>
			<td>Retsch, Hann, Germany</td>
			<td>20.745.0001</td>
			<td>Mixer mill adapted for for dry, wet, and cryogenic grinding of small amounts of sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra fine dissection scissors in stainless steel length 12 cm</td>
			<td>Dutscher, Brumath</td>
			<td>5066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra precise tip forceps anti-magnetic stainless steel 9.5x 109.3 mm</td>
			<td>Dutscher, Brumath</td>
			<td>327005</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mechanical separation and protein solubilization of the outer and inner perivitelline sublayers from hen's eggs

Перивильный слой, окружающий яичный желток, играет основополагающую роль в оплодотворении, в защите яйцеклеток и в развитии птичьего эмбриона. Он формируется двумя белковых субслой, которые тесно связаны и образуются различными женскими репродуктивными органами. Предполагается, что обе структуры имеют свои собственные функциональные особенности, которые еще не определены. Чтобы охарактеризовать функцию белков, составляя каждый подслой, первая задача состоит в том, чтобы установить условия, которые позволили бы для механического разделения этих двух сложных слоев, при ограничении любых структурных повреждений. Второй шаг заключается в оптимизации экспериментальных условий для облегчения белка solubilization от этих двух субслой, для последующего биохимического анализа. Эффективность этого подхода оценивается путем анализа белкового профиля каждого подслойщика по натрию Додекил Сульфат-Поли-Акриламид Гель Электрофорез (SDS-PAGE), который, как ожидается, будет различаться между двумя структурами. Эта двухшаговая процедура остается простой; для этого требуется классическое биохимическое оборудование и реагенты; и совместим с дальнейшей углубленной протеомией. Он также может быть перенесен на другие птичьи яйца для сравнительной биологии, зная, что структура и состав слоя перивильлина, как было показано, имеют видоспецифические особенности. Кроме того, условия, не денатурированные условия, разработанные для разделения субслой (шаг 1), позволяют их структурный анализ путем сканирования и передачи электронной микроскопии. Он также может представлять собой первый шаг для последующей очистки белка для анализа их соответствующей биологической деятельности и 3D-структуры, или для проведения дальнейших иммуногистохимических или функциональных анализов. Такие исследования помогли бы расшифровать физиологическую функцию этих двух субслой, структурные и функциональные целостности которых являются определяющими критериями репродуктивного успеха.

OPL и IPL были отделены от PL свежеположенного неутвержденного яйца для анализа их белковых профилей SDS-PAGE. Экспериментальный рабочий процесс всего протокола проиллюстрирован на рисунке 2. Рисунок 3 показывает высвобождение белка в различных концентрациях Tris(рисунок 3A), различные рН (рисунок 3B) и различные концентрации NaCl (Рисунок 3C). В результате два sublayers были замечены под светом бинокль рассечения микроскопа и показаны на рисунке 4, где IPL является полупрозрачным в то время как OPL плотный, облачно, и беловатый. Эти функции могут отчасти свидетельствовать об эффективности разделения подслой.
После разделения, OPL и IPL были лиофилизированы независимо, и их содержание протеина вполне было растворено спасибо комбинация механически шлифовки, пользы анионового моющего средства (SDS), и уменьшая вещества (бета-меркаптоэтанола), после чего закипая. После миграции в полиакриламинидном геле (SDS-PAGE электрофорез), образцы OPL и IPL демонстрируют различные электрофоретические профили(рисунок 5), как и ожидалось.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61739/61739fig01.jpg"> Рисунок 1: Структура PL свежеотложенного неутилизованного яйца. Схематическая репрезентативная и трансмиссионная электронная микроскопическая микроскопия всего PL в поперечном сечении (личные данные, ©Plateforme IBiSA de Microscopie Electronique, Университет и CHRU Тура, Франция, С. Джорджо). Обратите внимание, что эта фотография была получена из PL подготовлены, как представлено в этом протоколе. OPL, внешний слой перивиллина; IPL, внутренний слой перивителлина. Черная наконечник стрелы указывает на непрерывную мембрану, разделяющую два подслоя. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61739/61739fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61739/61739fig02.jpg"> Рисунок 2: Рабочий процесс обобщает два основных этапа протокола и примеры приложений. Протокол был оптимизирован для протеомного анализа слоев PL, но он может быть остановлен на некоторых шагах для других приложений. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61739/61739fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61739/61739fig03.jpg"> Рисунок 3: Оптимизация буферного состава для выборки PL. Короче говоря, чистый PL (n No 4) был инкубирован в том же объеме различных буферных растворов в течение 2 ч.PL был удален, и концентрация белка была оценена путем измерения поглощения на 280 нм в оставшемся буфере. (A)Влияние концентрации Tris-HCl при рН 8. (B)Эффект рН (7 к 9). (C)Влияние концентрации NaCl. Из этих результатов мы пришли к выводу, что буфер, состоящий из 10 мМ Трис-HCl, рН 8, 50 мМ НаКл является наиболее подходящим, поскольку он ограничивает потерю белка. Результаты выражаются как среднее ± стандартное отклонение четырех различных образцов PL. Статистический анализ проводился с использованием одной из способов ANOVA с последующим тестом нескольких сравнений Tukey. P-значение lt;0.05 считалось значительным (ns, не значительно; <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61739/61739fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61739/61739fig4v2.jpg"> Рисунок 4: OPL и IPL функции под бинокулярным рассечением микроскопа. После разделения IPL (справа) оказался полупрозрачным, а OPL (слева) непрозрачным. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61739/61739fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61739/61739fig5v2.jpg"> Рисунок 5: SDS-PAGE анализ отделенных OPL и IPL от свежеотложенных неутяженных неутвержденного яйца. 4%-20% акриламид гель следуют Coomassie блестящий синий окрашивания. Масса молекулярных весовых стандартных полос указана в kDa. Профиль OPL в основном состоит из белков с молекулярной массой 30 кДа, в то время как основные полосы, обнаруженные в профиле IPL, имеют молекулярные массы lt;30 kDa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61739/61739fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs at JoVE.com

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

В этой статье сообщается простой метод, чтобы изолировать внешние и внутренние perivitelline подслойки куриных яиц при минимизации структурных изменений и оптимизации белка solubilization каждого подслойщика для протеомного анализа.

Механическое разделение и белок Solubilization внешних и внутренних Perivitelline sublayers из куриных яиц

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...

Этот протокол предусматривает пошаговую процедуру отбора проб субслойных мембран perivitelline из птичьих яиц для дальнейшего исследования их физиологической роли в воспроизводстве птиц. Выборка перивиллиновой мембраны была оптимизирована на каждом шагу, чтобы ограничить любые структурные и молекулярные повреждения. Протокол был дополнительно разработан для глубокой протеомии.Начните с отбора проб слоя перивителлина или PL из свежеотложенного нефертилизованного яйца. Разбейте яйцо и используйте яичный сепаратор, чтобы отделить желток от белого. Удалите chalazae с небольшими ножницами и свернуть желток на фильтровальную бумагу, чтобы удалить приверженец альбумин, который появляется как прозрачная, но видимая структура.Погрузите желток в кристаллизатор, содержащий 10 миллимоляр Tris HCL при рН восемь, который ранее был охлажден до четырех градусов по Цельсию и удалить PL области над зародышевым диском в пределах одного сантиметра зоны с помощью тупых ножниц. Разрыв PL с небольшими ножницами внутри буфера, а затем провести два края разрыва PL с типсами и очистить его от желтка. Промыть PL несколько раз в ванне 10 миллимоляр Tris HCL, пока не видны следы желтка.Убедитесь, что PL чист, белый и плавает в буфере. Обработать PL для разделения субслойного или перейти непосредственно к биохимическим анализам. Чтобы отделить OPL и IPL, распространение весь образец с OPL лицом вверх в пластиковой чашке Петри заполнены 10 миллимоляр Tris HCL и 50 миллимоляр хлорида натрия и поддерживать его плоским с как можно меньше морщин, как это возможно.Определите местоположение оставшихся чалаза, которые прикрепляются только к OPL. Затем разрежьте весь PL на кусочки около двух на три сантиметра маленькими ножницами. Механически отделить два слоя с ультра точные типсы кончика под рассечением микроскопа.Храните полученные образцы IPL и OPL индивидуально в микротрубках при отрицательном 80 градусах цельсия до дальнейшего использования. Для выполнения первичной солубилизации белка, заморозить сухой IPL и OPL образцов индивидуально, чтобы удалить оставшуюся воду, а затем вырезать примерно один миллиграмм из каждого образца и поместить его в чистую микротрубку с утечкой доказательство винт крышкой. Храните оставшиеся образцы в плотно закрытых трубках для длительного хранения при отрицательных 20 или отрицательных 80 градусах по Цельсию.Смешайте один миллиграмм каждого лиофилизированного подслойщика с 400 микролитров 50 миллимолярные три при рН семь и 500 миллимолярный хлорид натрия. Используйте смеситель мельницы дважды в течение пяти минут в 30 Герц, чтобы распасть структуры на микрочастицы и облегчить белка solubilization. Соберите 400 микролитров образцов в две чистые микротрубки.Чтобы подготовить образцы для электрофореза, добавьте буфер образца 5X SDS-PAGE к каждому образцу микролитров и нагревайте его до 100 градусов по Цельсию в течение пяти минут. Загрузите максимум 20 микрограммов белков в каждую полосу 4-20%-градиентного полиакриламинида SDS и выполняйте электрофорез на 120 вольт. После электрофорез, удалить гель из стеклянных пластин и пятно его с Coomassie Блестящий синий раствор в течение 30 минут, а затем де-пятно с раствором, состоящим из 50%воды, 40% этанола и 10%acetic кислоты, пока гель фон появляется светло-голубой.Перенесите гель в чашку Петри, содержащую деионизированную воду для обезвоживания и повторного увлажнения. Белки должны отображаться как синие полосы с прозрачным фоном. PL был подвергнут различным буферам для определения условий, позволяющих минимальную потерю белка и оптимальное разделение подслой.Здесь показаны белки, высвобождаемые при различных концентрациях трис, рН и хлорида натрия. Полученные два подслоя были замечены под рассеченным микроскопом. IPL полупрозрачный, в то время как OPL плотный, облачный и беловатый.После разделения, OPL и IPL были лиофилизированы независимо и их содержание протеина вполне было растворено используя комбинацию механически шлифования, анионического моющего средства, уменьшая агента, и кипя. Образцы продемонстрировали различные электрофоретические профили на полиакриламинидном геле. При попытке этого протокола имейте в виду, что разделение подслоев является критическим шагом процедуры и должно выполняться с помощью бинокулярного микроскопа в буфере, содержащем минимальную концентрацию соли.Для дальнейшего выяснения их соответствующей физиологической функции, образцы субслойного мембранного подслоя перивителлина могут быть проанализированы для гистологической характеристики с использованием электронной микроскопии и для функциональных исследований с использованием анализа изображений и миграции клеток.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Направленный Белок Упаковка в везикул наружной мембраны из<em&gt; Кишечная палочка</em&gt;: Проектирование, производство и очистка

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Тандем аффинной очистки белковых комплексов из эукариотические клетки

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Спектроскопия силы одного белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Переваривание белков, ультрафильтрации и гель-проникающей хроматографии размер для оптимизации изоляции Exosomes из человеческой плазмы крови и сыворотки

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Прямое действие зонд для измерения механических интеграции между ядром и Цитоскелет

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Выражение, солюбилизация и очистки эукариотических Борат транспортеров

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Hybrid Clear/Blue Native Electrophoresis for the Separation and Analysis of Mitochondrial Respiratory Chain Supercomplexes

Гибридный ясный/синий родной электрофорез для разделения и анализа митохондриальных Сверхкомплексов дыхательной цепи

Complexes of the oxidative phosphorylation machinery form supramolecular protein arrangements named supercomplexes (SCs), which are believed to confer ...