Name: a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NS108763 و NS100419 و NS095064 و HD080429 إلى C.Y. K. ؛ و NS106592 إلى YYS).

تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام (IACUC) في جامعة فيرجينيا ويتبع إرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر. يوضح الشكل 1 أ تسلسل العمليات الجراحية لهذا البروتوكول.
1. إعداد الجراحة
<ol><li>ضع وسادة تدفئة مع ضبط در...

<ol>
	<li>Lyden, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).</li><li>Linfante, I., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+reperfusion+therapies+in+the+era+of+mechanical+thrombectomy.">Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy.</a> Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).</li><li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endovascular+Therapy+for+Ischemic+stroke+with+perfusion-imaging+selection.">Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).</li><li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li><li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis.">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li><li>Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+blood+flow+restoration+and+reperfusion+injury+after+ultraviolet+laser-facilitated+middle+cerebral+artery+recanalization+in+rat+thrombotic+stroke.">Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke.</a> Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).</li><li>Uzdensky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombotic+stroke+as+a+model+of+ischemic+stroke.">Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke.</a> Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).</li><li>Karatas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+produced+by+topical+FeCl(3)+application:+a+novel+model+suitable+for+intravital+microscopy+and+thrombolysis+studies.">Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion.">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Alteplase+in+a+mouse+model+of+acute+ischemic+stroke:+A+retrospective+pooled+analysis.">Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis.</a> Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).</li><li>Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+model+of+cerebral+infarction.+Homologous+blood+clot+emboli+in+rats.">An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats.</a> Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).</li><li>Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+model+of+thromboembolic+stroke+and+rt-PA+induced+reperfusion+in+the+rat.">Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat.</a> Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).</li><li>Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Tenecteplase+with+Alteplase+on+clinical+rating+scores+following+small+clot+embolic+strokes+in+rabbits.">Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits.</a> Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+combined+tPA-Edaravone+therapy+in+experimental+thrombotic+stroke.">Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke.</a> PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Edaravone+prevents+transient+hypoxic-ischemic+brain+injury:+Implications+for+perioperative+neuroprotection.">Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection.</a> Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+mice+are+sensitive+to+hypoxia/ischemia-induced+stroke+but+respond+to+tissue-type+plasminogen+activator+treatment.">Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment.</a> Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).</li><li>Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thrombotic+stroke+model+based+on+transient+cerebral+hypoxia-ischemia.">A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).</li><li>Pena-Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+neutrophil+extracellular+traps+reverses+thrombotic+stroke+tPA+(tissue-type+plasminogen+activator)+resistance.">Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance.</a> Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).</li><li>Denorme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAMTS13-mediated+thrombolysis+of+t-PA-resistant+occlusions+in+ischemic+stroke+in+mice.">ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice.</a> Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).</li><li>Marder, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombi+retrieved+from+cerebral+arteries+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke.</a> Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).</li><li>Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+thrombi+retrieved+in+stroke+due+to+large+vessel+occlusion.">Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+photothrombotic+stroke+model+with+an+increased+fibrin+content+and+improved+responses+to+tPA-lytic+treatment.">A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment.</a> Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).</li><li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).</li><li>Gupta, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+gelsolin+in+acute+pulmonary+thromboembolism+and+thrombosis+in+the+carotid+artery+of+mice.">Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice.</a> PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).</li><li>Carroll, B. J., Piazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercoagulable+states+in+arterial+and+venous+thrombosis:+When,+how,+and+who+to+test.">Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test.</a> Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).</li><li>Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenecteplase+for+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke:+A+review+of+completed+and+ongoing+randomized+controlled+trials.">Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials.</a> International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).</li><li>McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+antiplatelet+therapies:+emphasis+on+preserving+haemostasis.">Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).</li><li>Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+crculation+in+ischemic+stroke:+Assessment+tools+and+therapeutic+strategies.">Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies.</a> Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).</li><li>Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+etymology+of+the+collateral+circulation.">A brief etymology of the collateral circulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).</li></ol>

السكتة الدماغية الضوئية RB التقليدية ، التي تم تقديمها في عام 1985 ، هي نموذج جذاب لنقص التروية الدماغية البؤري للإجراءات الجراحية البسيطة ، وانخفاض معدل الوفيات ، وارتفاع قابلية استنساخ احتشاء الدماغ. 5 في هذا النموذج ، تقوم الصبغة الديناميكية الضوئية RB بتنشيط الصفائح الدموية ...

استئصال الخثرة داخل الأوعية الدموية وانحلال الخثرة بوساطة tPA هما العلاجان الوحيدان المعتمدان من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) للسكتة الدماغية الحادة ، والتي تصيب ~ 700000 مريض سنويا في الولايات المتحدة1. نظرا لأن تطبيق استئصال الخثرة يقتصر على انسداد الأوعية الدموية الكبيرة (LVO) ، في حين أن انحلال الخثرة tPA قد يخفف من انسداد الأوعية الصغيرة ، فإن كلاهما علاجات قيمة للسكتة الدماغية الحادة2. علاوة على ذلك ، فإن الجمع بين كلا العلاجين (على سبيل المثال ، بدء انحلال الخثرة tPA في غضون 4.5 ساعة من بداية السكتة الدماغية ، تليها استئصال الخثرة) يحسن التروية والنتائج الوظيفية3. وبالتالي ، يظل تحسين انحلال الخثرة هدفا مهما لأبحاث السكتة الدماغية ، حتى في عصر استئصال الخثرة.
تعد نماذج الانصمام الخثاري أداة أساسية لأبحاث السكتة الدماغية قبل السريرية التي تهدف إلى تحسين علاجات التخثر. وذلك لأن نماذج انسداد الأوعية الدموية الميكانيكية (على سبيل المثال ، انسداد MCA داخل اللمعة) لا تنتج جلطات دموية ، واستعادتها السريعة لتدفق الدم الدماغي بعد إزالة الانسداد الميكانيكي مثالية بشكل مفرط 4,5. حتى الآن ، تشمل نماذج الانصمام الخثاري الرئيسية تجلط الدمالضوئي 6،7،8 ، وتطبيق كلوريد الحديديك الموضعي (FeCl3)9 ، والحقن المجهري للثرومبين في فرع MCA 10،11 ، وحقن الصمات خارج الجسم الحي (الدقيقة) في MCA أو الشريان السباتي المشترك (CCA) 12،13،14 ، ونقص الأكسجة العابر (tHI) 15,16 ، 17,18. تختلف نماذج السكتة الدماغية هذه في التركيب النسيجي للجلطات اللاحقة والحساسية للعلاجات المحللة بوساطة tPA (الجدول 1). كما أنها تختلف في المتطلبات الجراحية لحج القحف (اللازمة لحقن الثرومبين في الموقع والتطبيق الموضعي ل FeCl3) ، واتساق حجم الاحتشاء وموقعه (على سبيل المثال ، تسريب CCA من microemboli ينتج عنه نتائج متغيرة للغاية) ، والتأثيرات العالمية على نظام القلب والأوعية الدموية (على سبيل المثال ، يزيد tHI من معدل ضربات القلب والنتاج القلبي للتعويض عن توسع الأوعية المحيطية الناجم عن نقص الأكسجة).
يتميز نموذج السكتة الدماغية الضوئية القائمة على صبغة RB (PTS) بالعديد من الميزات الجذابة ، بما في ذلك الإجراءات الجراحية البسيطة الخالية من حج القحف ، وانخفاض معدل الوفيات (عادة < 5٪) ، وحجم وموقع احتشاء يمكن التنبؤ به (في المنطقة الموردة ل MCA) ، ولكن له قيدان رئيسيان. 8 التحذير الأول هو استجابة ضعيفة إلى معدومة للعلاج التخثري بوساطة tPA ، وهو أيضا عيب في نموذج FeCl 3 7،19،20. التحذير الثاني من نماذج السكتة الدماغية PTS و FeCl3 هو أن الجلطات الدموية التي تلت ذلك تتكون من مجاميع الصفائح الدموية المعبأة بكثافة مع كمية صغيرة من الفيبرين ، والتي لا تؤدي فقط إلى مرونتها للعلاج tPA-lytic ، ولكن أيضا تنحرف عن نمط الصفائح الدموية المختلطة:الجلطات الدموية الفيبرين في مرضى السكتة الدماغية الحادة21,22. في المقابل ، يشتمل نموذج حقن الثرومبين الدقيق في الموقع بشكل أساسي على الفيبرين المبلمر ومحتوى غير مؤكد من الصفائح الدموية10.
بالنظر إلى المنطق أعلاه ، افترضنا أن اختلاط RB وجرعة فرعية من الثرومبين للتنشيط الضوئي المستهدف MCA من خلال الجمجمة الرقيقة قد يزيد من مكون الفيبرين في الجلطات الناتجة ويعزز الحساسية للعلاج المحللي بوساطة tPA. لقد أكدنا هذه الفرضية ،23 وهنا نصف الإجراءات التفصيلية لنموذج السكتة الدماغية الخثارية الضوئية المعدل (T + RB).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8877</td>
			<td>infarct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon monofilament suture</td>
			<td>LOOK</td>
			<td>766B</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>624143</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>543nm laser beam</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>25-LGP-193-249</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adult male mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>10~14 weeks old (22~30 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia bar for mouse adaptor</td>
			<td>machine shop, UVA</td>
			<td></td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td>euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Dentamerica</td>
			<td>Rotex 782</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microscope</td>
			<td>Dino-Lite</td>
			<td>AM2111</td>
			<td>brain imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ40</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (serrated)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11370-31</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (smooth)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11373-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa Fluro 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>13008-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pump with warming pad</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP700</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>200</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with 31G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>328291</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser protective google 532nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam SR</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>NSAID analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holders</td>
			<td>FST</td>
			<td>12060-01</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoorFLPI-2 blood flow imager</td>
			<td>Moor</td>
			<td>780-nm laser source</td>
			<td>Laser Speckle Contrast Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>68014</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet ointment</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0138063</td>
			<td>eye dryness prevention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractor tips</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Surgi-5014-2</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>198250</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7513</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue glue</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>NC9855218</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tPA</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>Cathflo activase 2mg</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51425</td>
			<td>TTC infacrt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model

يتطلب نموذج السكتة الدماغية الانصمام الخثاري المثالي خصائص معينة ، بما في ذلك الإجراءات الجراحية البسيطة نسبيا مع انخفاض معدل الوفيات ، وحجم وموقع احتشاء ثابت ، وترسيب الصفائح الدموية: جلطات دموية مختلطة بالفيبرين مماثلة لتلك الموجودة في المرضى ، وحساسية كافية للعلاج بتحلل الفيبرين. يلبي نموذج السكتة الدماغية الضوئية القائمة على صبغة البنغال الوردية (RB) الشرطين الأولين ولكنه شديد المقاومة للحرارة للعلاج المحللي بوساطة tPA ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى تركيبة الجلطة الغنية بالصفائح الدموية ، ولكن الفقيرة بالفيبرين. نحن السبب في أن الجمع بين صبغة RB (50 مجم / كجم) وجرعة فرعية من الثرومبين (80 وحدة / كجم) للتنشيط الضوئي الذي يستهدف الفرع القريب من الشريان الدماغي الأوسط (MCA) قد ينتج جلطات غنية بالفيبرين وحساسة ل tPA. في الواقع ، أدى نموذج الجلطة الضوئية المشترك للثرومبين و RB (T + RB) إلى ظهور صفائح دموية مختلطة: جلطات دم الفيبرين ، كما هو موضح في التلوين المناعي والبقع المناعية ، وحافظت على أحجام ومواقع احتشاء متسقة بالإضافة إلى انخفاض معدل الوفيات. علاوة على ذلك ، فإن الحقن الوريدي ل tPA (Alteplase ، 10 مجم / كجم) في غضون 2 ساعة بعد التنشيط الضوئي قلل بشكل كبير من حجم الاحتشاء في تجلط الدم الضوئي T + RB. وبالتالي ، قد يكون نموذج السكتة الدماغية التخثر الضوئي المعزز بالثرومبين نموذجا تجريبيا مفيدا لاختبار علاجات التخثر الجديدة.

أولا ، قارنا محتوى الفيبرين في RB مقابل جلطات الدم التي يسببها تجلط الدم الضوئي T + RB. تم التضحية بالفئران عن طريق التروية عبر القلب للمثبتات في 2 ساعة بعد التنشيط الضوئي ، وتمت إزالة الأدمغة من أجل تلطيخ التألق المناعي لفرع MCA في المستويات الطولية والعرضية. في تجلط الدم الضوئي RB ، كان فرع MCA مك...

Watch this Scientific Journal Video about A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model at JoVE.com

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

تحفز نماذج السكتة الدماغية الضوئية التقليدية (PTS) بشكل أساسي مجاميع الصفائح الدموية الكثيفة ذات المقاومة العالية لمنشط البلازمينوجين النسيجي (tPA) - العلاج المحلل. هنا يتم تقديم نموذج PTS الفئران المعدل عن طريق الحقن المشترك للثرومبين والصبغة الحساسة للضوء للتنشيط الضوئي. ينتج نموذج PTS المعزز بالثرومبين صفائح صفيحة مختلطة: جلطات الفيبرين وهو حساس للغاية لانحلال الخثرة tPA.

نموذج السكتة الدماغية الضوئية الخثارية المخصبة بالفيبرين والحساسة ل tPA

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

نريد إنشاء نموذج للسكتة الدماغية ينتج جلطة دموية مشابهة لعينات المرضى ويستجيب للعلاج السريري ذي الصلة بالتخثر لذلك ، نقوم بتعديل نموذج السكتة الدماغية الضوئية الكلاسيكية وخلط الثرومبين والصبغة الديناميكية الضوئية وردة البنغال قبل التنشيط الضوئي. يسعدنا أن هذا الإجراء يخلق بالفعل جلطة دموية شديدة الحساسية لانحلال الخثرة بوساطة tPA.يستخدم نموذج السكتة الدماغية الخثاري الضوئي المعدل هذا إجراءات جراحية بسيطة للغاية مع معدل وفيات منخفض ينتج عنه حجم وموقع احتشاء متسق للغاية. يمكنك أيضا إنتاج جلطة دموية مختلطة من الفيبرين والصفائح الدموية تشبه تلك الموجودة في مريض السكتة الدماغية الحادة. لذلك ، نعتقد أنه من المفيد جدا لأبحاث السكتة الدماغية قبل السريرية تطوير علاجات أكثر فعالية للتخثر.نأمل أن يستخدم المزيد من الناس نموذجنا. سيوضح الإجراء الدكتور يو يو صن ، الأستاذ المساعد البحثي في مجموعتنا. قبل 30 دقيقة من الجراحة ، قم بإعداد الماوس عن طريق حقن مسكن.بعد تخدير الفأر ، قم بإجراء قرصة إصبع القدم للتأكد من تخديره بالكامل. ثم قم بإزالة الشعر على الرقبة اليسرى والرأس باستخدام كريم إزالة الشعر. ضع الماوس على محول الصغير في وضع ضعيف ، وعقم منطقة الجلد الجراحية عن طريق مسحها بثلاث ضربات متناوبة من بوفيدون اليود و 70٪ إيثانول.تحت مجهر التشريح ، قم بعمل شق عنق الرحم الأيسر بطول 0.5 سم باستخدام مقص دقيق وملقط مستقيم على بعد حوالي 0.2 سم من خط الوسط. بعد ذلك ، باستخدام زوج من الملقط المسنن الناعم ، اسحب الأنسجة الرخوة واللفافة لفضح LCCA. ثم باستخدام زوج من الملقط الأملس الناعم ، افصل LCCA بعناية عن العصب المبهم.ضع خيطا دائما مزدوج العقدة حول LCCA باستخدام خياطة حريرية 5-0. اقلب الماوس إلى وضعية الانبطاح ، وقم بتدوير لفة مشبك الأنف بمقدار 15 درجة. ثم تعقيم المنطقة الجراحية عن طريق مسح الجلد بثلاث ضربات متناوبة من Betadine و 70٪ إيثانول.قم بعمل شق 0.8 سم في فروة الرأس باستخدام مقص دقيق وملقط مستقيم على طول العين اليسرى والأذن لكشف العضلة الصدغية. بعد ذلك ، قم بعمل شق طوله 0.5 سم على طول حافة العضلة الصدغية على العظم الجداري الأيسر. ثم قم بعمل شق عمودي ثان طوله 0.3 سم على العضلة الصدغية واسحب العضلة لكشف حافة العظم الجداري والعظم الحرشفي.تأكد من تصور معلم الخيط الإكليلي بين العظام الأمامية والجدارية. بعد ذلك ، رطب الجمجمة عن طريق تطبيق محلول ملحي معقم للكشف عن MCA الأيسر ، وقم بتمييز فرع MCA القريب على العظم الحرشفية بعلامة. ارسم برفق دائرة قطرها ملليمتر واحد تحيط بهذه المنطقة المحددة باستخدام مثقاب أسنان هوائي.ثم قم بتخفيف الجمجمة بعمق حوالي 0.2 ملم دون لمس الجزء السفلي من الجافية. أوقف الحفر عندما تبقى طبقة رقيقة جدا من العظام. بعد ذلك ، قم بخلط محلول الثرومبين والبنغال الوردي بناء على وزن جسم الفأر ، وقم بحقن الخليط ببطء في الجيوب الأنفية المدارية الخلفية بإبرة قياس 31.ضع مرهم العين على كلتا العينين لمنع الجفاف. ضع المصباح بضوء ليزر 532 نانومتر على الموقع المحفور على مسافة بوصتين لمدة 20 دقيقة. تصور الإضاءة في الفرع القريب من MCA من خلال نظارات الإسقاط بالليزر.بعد 20 دقيقة ، أوقف إضاءة الليزر. اصنع نافذة قحفية قطرها ثلاثة ملليمترات على العظم الجداري للجمجمة ، وضع غطاء زجاجي عليها. ثم حدد موقع MCA البعيد تحت عدسة هدف الغمر بالماء 20x.قم بتسمية الصفائح الدموية المنتشرة عن طريق حقن الوريد الخلفي للأجسام المضادة المترافقة DyLight 488 المضادة ل GP1b-beta قبل خمس دقائق من التصوير. ثم حقن الخلف المداري خليط محلول الثرومبين والورد البنغال. قم بتنشيط MCA ضوئيا باستخدام نظام ليزر 532 نانومتر مع شعاع ليزر قطره 10 ميكرومتر ، وسجل الصورة حتى تكوين الجلطة.لإدارة tPA ، ضع المخدر على وسادة دافئة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. لف ذيله بشاش رطب دافئ بدرجة حرارة 45 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة في النقطة الزمنية المحددة بعد التنشيط الضوئي. بعد ذلك ، قم بحقن tPA البشري المؤتلف من خلال الوريد الذيل.حقن 50 ٪ كبلعة ، وبث 50 ٪ المتبقية على مدى 30 دقيقة باستخدام مضخة التسريب. لمراقبة تدفق الدم الدماغي ، قم بعمل شق في خط الوسط على فروة الرأس مع كشف الجمجمة. رطب الجمجمة بمحلول ملحي معقم ، وقم بتطبيق جل الموجات فوق الصوتية عليه برفق ، مع التأكد من تجنب فقاعات الشعر أو الهواء في الجل.راقب تدفق الدم الدماغي في نصفي الكرة المخية تحت جهاز تصوير تباين بقع الليزر لمدة 10 دقائق. يظهر وضع العلامات المناعية أنه في تجلط الدم الضوئي القائم على صبغة البنغال الوردية ، كان فرع MCA مكتظا بالصفائح الدموية الإيجابية CD41 والقليل من الفيبرين. في المقابل ، في الثرومبين بالإضافة إلى تجلط الدم الضوئي البنغال الوردي ، تم انسداد فرع MCA بواسطة جلطات الصفائح الدموية والفيبرين المختلطة عشوائيا.أظهر تحليل النشاف المناعي زيادة أكبر من الضعف في ترسب الفيبرين في نصف الكرة المماثل في الثرومبين بالإضافة إلى تجلط البنغال الضوئي مقارنة بالبنغال الوردية وحدها. أظهر التصوير داخل الجسم القائم على المجهر متحد البؤر أن حقن الثرومبين في الوريد فشل في تحفيز تجمعات الصفائح الدموية ، حتى تحت إضاءة الليزر. شكلت الصفائح الدموية جلطات متجانسة في نموذج تجلط الدم الضوئي في البنغال الوردية ولكن المجاميع غير المتساوية مع مناطق باهتة متعددة في نموذج الثرومبين بالإضافة إلى البنغال الوردية.تم قياس CBF لنفس الفأر قبل وبعد 24 ساعة من tPA مقابل العلاج بالمركبة بواسطة تصوير تباين البقع بالليزر وتم تطبيعه إلى نصف الكرة المقابل. في تجلط الدم الضوئي البنغال الوردي ، أدى علاج tPA إلى اتجاه لاستعادة CBF ، لا سيما في منطقة الحدود الإقفارية مقارنة بالفئران المعالجة بالمركبات. في الثرومبين بالإضافة إلى تجلط الدم البنغالي الوردي ، كان تعافي CBF في الفئران المعالجة ب tPA أكثر بروزا ، وغالبا ما أصبحت فروع MCA القريبة مرئية في 24 ساعة.في تجلط الدم الضوئي البنغال الوردي ، تم الكشف عن حجم احتشاء مماثل في الفئران المعالجة بالمركبات والمعالجة ب tPA. في المقابل ، في الثرومبين بالإضافة إلى تجلط الدم الضوئي البنغال الوردي ، قلل العلاج المحللي tPA بشكل كبير من الاحتشاء عند 0.5 أو ساعة أو ساعة أو ساعتين ، ولكن ليس في ست ساعات بعد التنشيط الضوئي مقارنة بالفئران المعالجة بالمركبات ، فإن توليد الفيبرين بوساطة الثرومبين أمر بالغ الأهمية لتشكيل الجلطة في هذا الإجراء. يمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في تكوين الجلطة ومواصلة دراسة علاجات التخثر.بعد هذا الإجراء ، يمكن تطبيق طرق أخرى لعلاج انحلال الخثرة وتحديد الفعالية اللاحقة. إن إضافة الثرومبين يجعل من الممكن ضبط تركيبة الجلطة من فقيرة بالفيبرين إلى غنية بالفيبرين ، مما يسمح للباحثين بتطوير استراتيجيات علاجية ذات صلة سريريا.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

إلى الوراء تحميل من الأعصاب، ومساحات، وجذور العمود الفقري مع الأصباغ الفلورية

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

السلف المستمدة من نظام الثقافة دبقية قليلة التغصن من دماغ الجنين البشري

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

اشتقاق مدار الساعة من تخليص الغلوتامات مع تحليل Deconvolution من التيارات الناقل نجمي

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

استخدام 3D تكنولوجيا الطباعة لدمج التصوير بالرنين المغناطيسي مع الأنسجة: بروتوكول لالدماغ باجتزاء

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

تقييم وظيفة الطاقة البيولوجية في خلايا دماغي الأوعية الدموية غشائي

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

قياس الالتقام حويصلة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

تقييم في فيفو لتعطيل حاجز الدم في الدماغ في نموذج الفئران من السكتة الدماغية

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

نموذج قبل السريرية لتقييم تعافي الدماغ بعد السكتة الدماغية الحاده في الفئران

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

الفاصل الزمني التصوير الحي والقياس الكمي لديناميات فرع التقشر السريع في تطوير الخلايا العصبية Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

المجهر البؤري لقياس ثلاثة أنماط من ديناميكيات مسام الانصهار في خلايا الكرومافين الكظرية

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...