Name: a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud (NS108763, NS100419, NS095064 og HD080429 til C.Y. K. og NS106592 til YS).

Denne protokol er godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Virginia og følger National Institutes of Health Guideline for Care and Use of Laboratory Animals. Figur 1A skitserer sekvensen af kirurgiske procedurer i denne protokol.
1. Opsætning af kirurgi
<ol><li>Anbring en varmepude med temperaturindstilling på 37 °C på smådyrsadapteren mindst 15 minutter før operationen. Forbered en næseklemmerulle til adapteren, ...

<ol>
	<li>Lyden, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).</li><li>Linfante, I., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+reperfusion+therapies+in+the+era+of+mechanical+thrombectomy.">Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy.</a> Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).</li><li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endovascular+Therapy+for+Ischemic+stroke+with+perfusion-imaging+selection.">Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).</li><li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li><li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis.">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li><li>Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+blood+flow+restoration+and+reperfusion+injury+after+ultraviolet+laser-facilitated+middle+cerebral+artery+recanalization+in+rat+thrombotic+stroke.">Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke.</a> Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).</li><li>Uzdensky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombotic+stroke+as+a+model+of+ischemic+stroke.">Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke.</a> Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).</li><li>Karatas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+produced+by+topical+FeCl(3)+application:+a+novel+model+suitable+for+intravital+microscopy+and+thrombolysis+studies.">Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion.">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Alteplase+in+a+mouse+model+of+acute+ischemic+stroke:+A+retrospective+pooled+analysis.">Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis.</a> Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).</li><li>Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+model+of+cerebral+infarction.+Homologous+blood+clot+emboli+in+rats.">An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats.</a> Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).</li><li>Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+model+of+thromboembolic+stroke+and+rt-PA+induced+reperfusion+in+the+rat.">Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat.</a> Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).</li><li>Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Tenecteplase+with+Alteplase+on+clinical+rating+scores+following+small+clot+embolic+strokes+in+rabbits.">Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits.</a> Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+combined+tPA-Edaravone+therapy+in+experimental+thrombotic+stroke.">Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke.</a> PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Edaravone+prevents+transient+hypoxic-ischemic+brain+injury:+Implications+for+perioperative+neuroprotection.">Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection.</a> Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+mice+are+sensitive+to+hypoxia/ischemia-induced+stroke+but+respond+to+tissue-type+plasminogen+activator+treatment.">Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment.</a> Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).</li><li>Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thrombotic+stroke+model+based+on+transient+cerebral+hypoxia-ischemia.">A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).</li><li>Pena-Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+neutrophil+extracellular+traps+reverses+thrombotic+stroke+tPA+(tissue-type+plasminogen+activator)+resistance.">Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance.</a> Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).</li><li>Denorme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAMTS13-mediated+thrombolysis+of+t-PA-resistant+occlusions+in+ischemic+stroke+in+mice.">ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice.</a> Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).</li><li>Marder, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombi+retrieved+from+cerebral+arteries+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke.</a> Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).</li><li>Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+thrombi+retrieved+in+stroke+due+to+large+vessel+occlusion.">Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+photothrombotic+stroke+model+with+an+increased+fibrin+content+and+improved+responses+to+tPA-lytic+treatment.">A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment.</a> Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).</li><li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).</li><li>Gupta, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+gelsolin+in+acute+pulmonary+thromboembolism+and+thrombosis+in+the+carotid+artery+of+mice.">Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice.</a> PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).</li><li>Carroll, B. J., Piazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercoagulable+states+in+arterial+and+venous+thrombosis:+When,+how,+and+who+to+test.">Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test.</a> Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).</li><li>Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenecteplase+for+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke:+A+review+of+completed+and+ongoing+randomized+controlled+trials.">Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials.</a> International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).</li><li>McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+antiplatelet+therapies:+emphasis+on+preserving+haemostasis.">Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).</li><li>Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+crculation+in+ischemic+stroke:+Assessment+tools+and+therapeutic+strategies.">Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies.</a> Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).</li><li>Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+etymology+of+the+collateral+circulation.">A brief etymology of the collateral circulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).</li></ol>

Det traditionelle RB fototrombotiske slagtilfælde, der blev introduceret i 1985, er en attraktiv model for fokal cerebral iskæmi til enkle kirurgiske procedurer, lav dødelighed og høj reproducerbarhed af hjerneinfarkt. 5 I denne model aktiverer det fotodynamiske farvestof RB hurtigt blodplader ved lysexcitation, hvilket fører til tætte aggregater, der okkluderer blodkarret 5,8,23. Den lille mængde ...

Endovaskulær trombektomi og tPA-medieret trombolyse er de eneste to amerikanske Food and Drug Administration (FDA) -godkendte terapier af akut iskæmisk slagtilfælde, der rammer ~ 700.000 patienter årligt i USA1. Fordi anvendelsen af trombektomi er begrænset til stor karokklusion (LVO), mens tPA-trombolyse kan lindre små karokklusioner, er begge værdifulde terapier af akut iskæmisk slagtilfælde2. Desuden forbedrer kombinationen af begge terapier (f.eks. initiering af tPA-trombolyse inden for 4,5 timer efter slagtilfælde efterfulgt af trombektomi) reperfusion og de funktionelle resultater3. Således forbliver optimering af trombolyse et vigtigt mål for slagtilfældeforskning, selv i trombektomiens æra.
Tromboemboliske modeller er et vigtigt redskab til præklinisk slagtilfældeforskning, der sigter mod at forbedre trombolytiske terapier. Dette skyldes, at mekaniske vaskulære okklusionsmodeller (f.eks. intraluminal sutur MCA-okklusion) ikke producerer blodpropper, og dens hurtige genopretning af cerebral blodgennemstrømning efter fjernelse af mekanisk okklusion er alt for idealiseret 4,5. Til dato omfatter større tromboemboliske modeller fototrombose 6,7,8, topisk jernchlorid (FeCl3) applikation9, mikroinjektion af thrombin i MCA-grenen 10,11, injektion af ex vivo (mikro)emboli i MCA eller almindelig carotisarterie (CCA)12,13,14 og forbigående hypoxi-iskæmi (tHI)15,16, 17,18. Disse slagtilfældemodeller adskiller sig i den histologiske sammensætning af efterfølgende blodpropper og følsomheden over for tPA-medierede lytiske terapier (tabel 1). De varierer også i det kirurgiske krav til kraniotomi (nødvendigt for in situ trombininjektion og topisk anvendelse afFeCl3), konsistensen af infarkts størrelse og placering (f.eks. CCA-infusion af mikroemboli giver meget variable resultater) og globale virkninger på det kardiovaskulære system (f.eks. øger tHI hjertefrekvensen og hjerteudgangen for at kompensere for hypoxi-induceret perifer vasodilatation).
RB-farvestofbaseret fototrombotisk slagtilfælde (PTS) -modellen har mange attraktive funktioner, herunder enkle kraniotomifrie kirurgiske procedurer, lav dødelighed (typisk < 5%) og en forudsigelig størrelse og placering af infarkt (i MCA-forsyningsområdet), men den har to store begrænsninger. 8 Den første advarsel er svag til nul respons på tPA-medieret trombolytisk behandling, hvilket også er en ulempe ved FeCl3-model 7,19,20. Den anden advarsel ved PTS- og FeCl 3-taktsmodeller er, at den efterfølgende trombi består af tætpakkede blodpladeaggregater med en lille mængde fibrin, hvilket ikke kun fører til dets modstandsdygtighed over for tPA-lytisk terapi, men også afviger fra mønsteret af blandet blodplade: fibrintrombi hos patienter med akut iskæmisk slagtilfælde 21,22. I modsætning hertil omfatter in situ thrombin-mikroinjektionsmodellen hovedsageligt polymeriseret fibrin og et usikkert indhold af blodplader10.
På baggrund af ovenstående ræsonnement antog vi, at blanding af RB og en subtrombotisk dosis thrombin til MCA-målrettet fotoaktivering gennem fortyndet kranium kan øge fibrinkomponenten i den resulterende trombi og øge følsomheden over for tPA-medieret lytisk behandling. Vi har bekræftet denne hypotese,23 og heri beskriver vi detaljerede procedurer for den modificerede (T+RB) fototrombotiske slagtilfældemodel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8877</td>
			<td>infarct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon monofilament suture</td>
			<td>LOOK</td>
			<td>766B</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>624143</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>543nm laser beam</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>25-LGP-193-249</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adult male mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>10~14 weeks old (22~30 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia bar for mouse adaptor</td>
			<td>machine shop, UVA</td>
			<td></td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td>euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Dentamerica</td>
			<td>Rotex 782</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microscope</td>
			<td>Dino-Lite</td>
			<td>AM2111</td>
			<td>brain imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ40</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (serrated)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11370-31</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (smooth)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11373-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa Fluro 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>13008-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pump with warming pad</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP700</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>200</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with 31G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>328291</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser protective google 532nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam SR</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>NSAID analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holders</td>
			<td>FST</td>
			<td>12060-01</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoorFLPI-2 blood flow imager</td>
			<td>Moor</td>
			<td>780-nm laser source</td>
			<td>Laser Speckle Contrast Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>68014</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet ointment</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0138063</td>
			<td>eye dryness prevention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractor tips</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Surgi-5014-2</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>198250</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7513</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue glue</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>NC9855218</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tPA</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>Cathflo activase 2mg</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51425</td>
			<td>TTC infacrt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model

En ideel tromboembolisk slagtilfældemodel kræver visse egenskaber, herunder relativt enkle kirurgiske procedurer med lav dødelighed, en konsekvent infarktstørrelse og placering, udfældning af blodplader:fibrin blandede blodpropper svarende til dem hos patienter og en tilstrækkelig følsomhed over for fibrinolytisk behandling. Den rosenbengalske (RB) farvestofbaserede fototrombotiske slagtilfældemodel opfylder de to første krav, men er meget ildfast over for tPA-medieret lytisk behandling, formodentlig på grund af dens blodpladerige, men fibrinfattige koagulationssammensætning. Vi ræsonnerer, at kombinationen af RB-farvestof (50 mg / kg) og en subtrombotisk dosis thrombin (80 E / kg) til fotoaktivering rettet mod den proksimale gren af den midterste cerebrale arterie (MCA) kan producere fibrinberigede og tPA-følsomme blodpropper. Faktisk udløste trombin- og RB (T + RB) -kombineret fototrombosemodel blandet blodplade: fibrinblodpropper, som vist ved immunfarvning og immunoblots, og opretholdt konsistente infarktstørrelser og placeringer plus lav dødelighed. Desuden reducerede intravenøs injektion af tPA (Alteplase, 10 mg/kg) inden for 2 timer efter fotoaktivering signifikant infarktstørrelsen ved T+RB-fototrombose. Således kan den trombinforstærkede fototrombotiske slagtilfældemodel være en nyttig eksperimentel model til test af nye trombolytiske terapier.

Først sammenlignede vi fibrinindholdet i RB versus T + RB fototrombose-inducerede blodpropper. Mus blev ofret ved transkardial perfusion af fikseringsmidler 2 timer efter fotoaktivering, og hjerner blev fjernet til immunofluorescensfarvning af MCA-grenen i langsgående og tværgående planer. I RB-fototrombose var MCA-grenen tæt pakket med CD41+ blodplader og lidt fibrin (figur 2A,C). I modsætning hertil blev MCA-grenen i T + RB-fototrombose okkluderet af tilf?...

Watch this Scientific Journal Video about A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model at JoVE.com

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

Traditionelle fototrombotiske slagtilfælde (PTS) modeller inducerer hovedsageligt tætte blodpladeaggregater med en høj modstandsdygtighed over for vævsplasminogenaktivator (tPA)-lytisk behandling. Her introduceres en modificeret murin PTS-model ved samtidig injektion af thrombin og lysfølsomt farvestof til fotoaktivering. Den trombinforstærkede PTS-model producerer blandede blodplader: fibrinpropper og er meget følsom over for tPA-trombolyse.

En fibrinberiget og tPA-følsom fototrombotisk slagtilfældemodel

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Vi ønsker at skabe en apopleksimodel, der producerer blodpropper, der ligner patientprøver og reagerer på den klinisk relevante trombolytiske behandling. Derfor modificerer vi den klassiske fototrombotiske slagmodel og blander thrombin og det fotodynamiske farvestof rose bengal inden fotoaktiveringen. Vi er glade for, at denne procedure faktisk skaber blodpropper, der er meget følsomme over for tPA-medieret trombolyse.Denne modificerede fototrombotiske slagtilfældemodel bruger meget enkle kirurgiske procedurer med lav dødelighed produceret en meget konsistent infarktstørrelse og placering. Du producerer også en fibrin og blodpladeblandet blodprop, der ligner dem hos den akutte slagtilfældepatient. Derfor mener vi, at det er ret nyttigt for præklinisk slagtilfældeforskning at udvikle mere effektive trombolytiske terapier.Vi håber, at flere mennesker bruger vores model. Demonstration af proceduren vil være Dr.Yu-Yo Sun, vores forskningsadjunkt i vores gruppe. 30 minutter før operationen skal du forberede musen ved at injicere et smertestillende middel.Efter bedøvelse af musen skal du udføre en tåklemme for at sikre, at den er fuldt bedøvet. Fjern derefter håret på venstre hals og hoved med hårfjerningscreme. Placer musen på adapteren til små dyr i liggende stilling, og steriliser det kirurgiske hudområde ved at tørre det af med tre skiftevis swipes af povidon jod og 70% ethanol.Under et dissekerende mikroskop laves et 0,5 centimeter venstre cervikalt snit ved hjælp af et par mikrosaks og lige tang på ca. 0,2 centimeter lateralt til midterlinjen. Brug derefter et par fine takkede tang til at trække blødt væv og fascia fra hinanden for at udsætte LCCA. Brug derefter et par fine glatte tang til forsigtigt at adskille LCCA fra vagusnerven.Placer en permanent dobbeltknudesutur omkring LCCA ved hjælp af en 5-0 silkesutur. Vend musen til en udsat position, og drej næseklemmerullen med 15 grader. Steriliser derefter det kirurgiske område ved at tørre huden af med tre skiftevis swipes af Betadine og 70% ethanol.Lav et 0,8 centimeter snit i hovedbunden ved hjælp af en mikrosaks og lige tang langs venstre øje og øre for at udsætte temporalismusklen. Lav derefter et 0,5 centimeter snit langs kanten af temporalismusklen på venstre parietalben. Lav derefter et andet 0,3 centimeter lodret snit på temporalismusklen og træk musklen tilbage for at udsætte kanten af parietalbenet og pladebenet.Sørg for at visualisere landemærket for koronal sutur mellem frontale og parietale knogler. Fugt derefter kraniet ved at anvende sterilt saltvand for at afsløre den venstre MCA, og markér den proksimale MCA-gren på pladebenet med en markør. Tegn forsigtigt en cirkel med en diameter på en millimeter, der omgiver dette markerede område, med en pneumatisk tandboremaskine.Tynd derefter kraniet ca. 0,2 millimeter dybt uden at røre ved underenden af dura. Stop boringen, når der er et meget tyndt lag knogle tilbage. Bland derefter thrombin og rose bengalopløsningen baseret på musens kropsvægt, og injicer langsomt blandingen i retro-orbital sinus med en 31-gauge nål.Påfør øjensalve på begge øjne for at forhindre tørhed. Påfør belysningen med et 532-nanometer laserlys på det borede sted inden for en to-tommers afstand i 20 minutter. Visualiser belysningen ved MCA's proksimale gren gennem laserprojektionsbriller.Stop laserbelysningen efter 20 minutter. Lav et kranielt vindue på tre millimeter i diameter på kraniets parietale knogle, og læg et dækglas på det. Find derefter den distale MCA under en 20x objektiv til nedsænkning af vand.Mærk den cirkulerende blodplade ved haleveneinjektion af DyLight 488 konjugeret anti-GP1b-beta-antistof fem minutter før billeddannelse. Derefter injiceres retro-orbitalt thrombin og rose bengalopløsningsblandingen. Fotoaktiver MCA ved hjælp af et 532-nanometer lasersystem med en laserstråle på 10 mikrometer i diameter, og optag billedet indtil trombosedannelse.Til administration af tPA skal du placere det bedøvede dyr på en 37 grader Celsius varm pude. Pakk halen med en 45 grader Celsius varm våd gaze i et minut på det valgte tidspunkt efter fotoaktivering. Injicer derefter den rekombinante humane tPA gennem halevenen.Injicer 50 % som bolus, og tilfør de resterende 50 % i løbet af 30 minutter ved hjælp af en infusionspumpe. For at overvåge cerebral blodgennemstrømning skal du lave et midterlinjesnit i hovedbunden med kraniet udsat. Fugt kraniet med sterilt saltvand, og påfør forsigtigt ultralydgelen på den, og sørg for at undgå hår eller luftbobler i gelen.Overvåg den cerebrale blodgennemstrømning i begge hjernehalvdele under laserpletkontrastkameraet i 10 minutter. Immunofluorescensmærkning viser, at MCA-grenen i rosenbengalfarvestofbaseret fototrombose var tæt pakket med CD41-positive blodplader og lidt fibrin. I modsætning hertil blev MCA-grenen i trombin plus rosenbengalfototrombose okkluderet af tilfældigt blandede blodplade- og fibrinpropper.Immunoblotting-analysen viste en større end dobbelt stigning i fibrinaflejring i den ipsilaterale halvkugle i trombinet plus rosenbengalsk fototrombose sammenlignet med rosenbengal alene. Konfokal mikroskopbaseret intravital billeddannelse viste, at en intravenøs trombininjektion ikke inducerede blodpladeaggregater, selv under laserbelysning. Blodplader dannede homogene blodpropper i rosenbengalsk fototrombosemodel, men ujævne aggregater med flere svage regioner i trombin plus rose bengalmodellen.CBF for den samme mus før og 24 timer efter tPA versus køretøjsbehandling blev målt ved laserspeckle kontrastbilleddannelse og normaliseret til den kontralaterale halvkugle. I rosenbengalfototrombosen førte tPA-behandlingen til en tendens til CBF-genopretning, især i det iskæmiske grænseområde sammenlignet med køretøjsbehandlede mus. I trombin plus rose bengal fototrombose var genopretningen af CBF i tPA-behandlede mus mere fremtrædende, og de proksimale MCA-grene blev ofte synlige efter 24 timer.I rosenbengalsk fototrombose blev en lignende infarktstørrelse påvist hos køretøjsbehandlede og tPA-behandlede mus. I modsætning hertil reducerede tPA-lytisk behandling signifikant infarkt ved 0,5, en eller to timer, men ikke seks timer efter fotoaktivering sammenlignet med køretøjsbehandlede mus, Trombinmedieret fibringenerering er afgørende for trombosedannelse i denne procedure. Denne metode kan bruges til at undersøge koagulationssammensætning og til yderligere undersøgelse af trombolytiske behandlinger.Efter denne procedure kan andre metoder til trombolysebehandling anvendes, og den senere effekt bestemmes. Tilsætning af thrombin gør det muligt at justere koagulationssammensætningen fra fibrinfattig til fibrinrig, hvilket gør det muligt for forskere at udvikle klinisk relevante terapeutiske strategier.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Stamfader-afledt oligodendrocyt Culture System fra human føtal hjerne

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

Udnytte 3D Printing Technology til Flet MRI med Histologi: En protokol for Brain Skæring

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Evaluering af bioenergetic Funktion i cerebrale vaskulære endotelceller

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Måling af Synaptic vesikel endocytose i kulturperler hippocampus neuroner

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

En In Vivo evaluering af blod - hjerne barrieren forstyrrelser i en rotte Model af iskæmisk slagtilfælde

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

En præklinisk model til vurdering af hjerne bedring efter akut slagtilfælde hos rotter

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging og kvantificering af hurtig dendritiske gren dynamik i at udvikle Drosophila neuroner

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Konfokal mikroskopi til måling af tre tilstande af fusionsporedynamik i binyrekromaffinceller

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...