Name: a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par les subventions du NIH (NS108763, NS100419, NS095064 et HD080429 à C.Y.K. ; et NS106592 à Y.Y.S.).

Ce protocole est approuvé par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Virginie et suit les lignes directrices des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. La figure 1A décrit la séquence des interventions chirurgicales de ce protocole.
1. Configuration de la chirurgie
<ol><li>Placez un coussin chauffant avec une température réglée à 37 °C sur l’adaptateur pour petit ...

<ol>
	<li>Lyden, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).</li><li>Linfante, I., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+reperfusion+therapies+in+the+era+of+mechanical+thrombectomy.">Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy.</a> Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).</li><li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endovascular+Therapy+for+Ischemic+stroke+with+perfusion-imaging+selection.">Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).</li><li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li><li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis.">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li><li>Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+blood+flow+restoration+and+reperfusion+injury+after+ultraviolet+laser-facilitated+middle+cerebral+artery+recanalization+in+rat+thrombotic+stroke.">Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke.</a> Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).</li><li>Uzdensky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombotic+stroke+as+a+model+of+ischemic+stroke.">Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke.</a> Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).</li><li>Karatas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+produced+by+topical+FeCl(3)+application:+a+novel+model+suitable+for+intravital+microscopy+and+thrombolysis+studies.">Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion.">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Alteplase+in+a+mouse+model+of+acute+ischemic+stroke:+A+retrospective+pooled+analysis.">Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis.</a> Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).</li><li>Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+model+of+cerebral+infarction.+Homologous+blood+clot+emboli+in+rats.">An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats.</a> Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).</li><li>Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+model+of+thromboembolic+stroke+and+rt-PA+induced+reperfusion+in+the+rat.">Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat.</a> Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).</li><li>Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Tenecteplase+with+Alteplase+on+clinical+rating+scores+following+small+clot+embolic+strokes+in+rabbits.">Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits.</a> Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+combined+tPA-Edaravone+therapy+in+experimental+thrombotic+stroke.">Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke.</a> PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Edaravone+prevents+transient+hypoxic-ischemic+brain+injury:+Implications+for+perioperative+neuroprotection.">Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection.</a> Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+mice+are+sensitive+to+hypoxia/ischemia-induced+stroke+but+respond+to+tissue-type+plasminogen+activator+treatment.">Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment.</a> Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).</li><li>Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thrombotic+stroke+model+based+on+transient+cerebral+hypoxia-ischemia.">A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).</li><li>Pena-Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+neutrophil+extracellular+traps+reverses+thrombotic+stroke+tPA+(tissue-type+plasminogen+activator)+resistance.">Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance.</a> Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).</li><li>Denorme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAMTS13-mediated+thrombolysis+of+t-PA-resistant+occlusions+in+ischemic+stroke+in+mice.">ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice.</a> Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).</li><li>Marder, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombi+retrieved+from+cerebral+arteries+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke.</a> Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).</li><li>Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+thrombi+retrieved+in+stroke+due+to+large+vessel+occlusion.">Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+photothrombotic+stroke+model+with+an+increased+fibrin+content+and+improved+responses+to+tPA-lytic+treatment.">A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment.</a> Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).</li><li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).</li><li>Gupta, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+gelsolin+in+acute+pulmonary+thromboembolism+and+thrombosis+in+the+carotid+artery+of+mice.">Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice.</a> PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).</li><li>Carroll, B. J., Piazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercoagulable+states+in+arterial+and+venous+thrombosis:+When,+how,+and+who+to+test.">Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test.</a> Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).</li><li>Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenecteplase+for+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke:+A+review+of+completed+and+ongoing+randomized+controlled+trials.">Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials.</a> International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).</li><li>McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+antiplatelet+therapies:+emphasis+on+preserving+haemostasis.">Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).</li><li>Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+crculation+in+ischemic+stroke:+Assessment+tools+and+therapeutic+strategies.">Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies.</a> Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).</li><li>Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+etymology+of+the+collateral+circulation.">A brief etymology of the collateral circulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).</li></ol>

L’AVC photothrombotique RB traditionnel, introduit en 1985, est un modèle attrayant d’ischémie cérébrale focale pour les interventions chirurgicales simples, la faible mortalité et la reproductibilité élevée de l’infarctus cérébral. 5 Dans ce modèle, le colorant photodynamique RB active rapidement les plaquettes lors de l’excitation lumineuse, conduisant à des agrégats denses qui occlus le vaisseau sanguin 5,8,23.<sup ...

La thrombectomie endovasculaire et la thrombolyse médiée par tPA sont les deux seules thérapies approuvées par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour l’AVC ischémique aigu, qui touche ~700 000 patients chaque année aux États-Unis1. Étant donné que l’application de la thrombectomie est limitée à l’occlusion des gros vaisseaux (LVO), alors que la thrombolyse tPA peut soulager les occlusions des petits vaisseaux, les deux sont des thérapies précieuses de l’AVC ischémique aigu2. De plus, la combinaison des deux thérapies (p. ex., l’initiation de la thrombolyse tPA dans les 4,5 heures suivant le début de l’AVC, suivie d’une thrombectomie) améliore la reperfusion et les résultats fonctionnels3. Ainsi, l’optimisation de la thrombolyse reste un objectif important pour la recherche sur l’AVC, même à l’ère de la thrombectomie.
Les modèles thromboemboliques sont un outil essentiel pour la recherche préclinique sur l’AVC visant à améliorer les thérapies thrombolytiques. Cela est dû au fait que les modèles d’occlusion vasculaire mécanique (par exemple, l’occlusion MCA de suture intraluminale) ne produisent pas de caillots sanguins et que la récupération rapide du flux sanguin cérébral après l’ablation de l’occlusion mécanique est trop idéalisée 4,5. À ce jour, les principaux modèles thromboemboliques comprennent la photothrombose 6,7,8, l’application topique de chlorure ferrique (FeCl3)9, la micro-injection de thrombine dans la branche MCA 10,11, l’injection ex vivo de (micro)emboles dans le MCA ou l’artère carotide commune (ACC)12,13,14 et l’hypoxie-ischémie transitoire (tHI)15,16, Chapitre 17 et 18. Ces modèles d’AVC diffèrent par la composition histologique des caillots qui en résultent et la sensibilité aux thérapies lytiques médiées par le tPA (tableau 1). Ils varient également en ce qui concerne l’exigence chirurgicale de la craniotomie (nécessaire pour l’injection in situ de thrombine et l’application topique de FeCl3), la constance de la taille et de la localisation de l’infarctus (par exemple, la perfusion d’ACC de microemboles donne des résultats très variables) et les effets globaux sur le système cardiovasculaire (par exemple, l’IHI augmente la fréquence cardiaque et le débit cardiaque pour compenser la vasodilatation périphérique induite par l’hypoxie).
Le modèle d’AVC photothrombotique (PTS) basé sur le colorant RB présente de nombreuses caractéristiques intéressantes, notamment des procédures chirurgicales simples sans craniotomie, une faible mortalité (généralement < 5 %) et une taille et une localisation prévisibles de l’infarctus (dans le territoire fournissant l’ACM), mais il présente deux limites majeures. 8 La première mise en garde est la réponse faible à nulle au traitement thrombolytique médié par le tPA, ce qui est également un inconvénient du modèle FeCl3 7,19,20. La deuxième mise en garde des modèles d’AVC PTS et FeCl3 est que les thrombus qui en résultent sont constitués d’agrégats plaquettaires densément emballés avec une petite quantité de fibrine, ce qui non seulement conduit à sa résilience au traitement tPA-lytique, mais s’écarte également du modèle de thrombus plaquettaire/fibrine mélangés chez les patients ayant subi un AVC ischémique aigu21,22. En revanche, le modèle de thrombine-microinjection in situ comprend principalement de la fibrine polymérisée et une teneur incertaine en plaquettes10.
Compte tenu du raisonnement ci-dessus, nous avons émis l’hypothèse que l’association de RB et d’une dose sous-thrombotique de thrombine pour la photoactivation ciblée par l’ACM à travers un crâne aminci peut augmenter la composante fibrine dans les thrombus résultants et augmenter la sensibilité au traitement lytique médié par tPA. Nous avons confirmé cette hypothèse23 et nous décrivons ici en détail les procédures du modèle d’AVC photothrombotique modifié (T+RB).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8877</td>
			<td>infarct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon monofilament suture</td>
			<td>LOOK</td>
			<td>766B</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>624143</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>543nm laser beam</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>25-LGP-193-249</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adult male mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>10~14 weeks old (22~30 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia bar for mouse adaptor</td>
			<td>machine shop, UVA</td>
			<td></td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td>euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Dentamerica</td>
			<td>Rotex 782</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microscope</td>
			<td>Dino-Lite</td>
			<td>AM2111</td>
			<td>brain imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ40</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (serrated)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11370-31</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (smooth)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11373-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa Fluro 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>13008-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pump with warming pad</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP700</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>200</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with 31G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>328291</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser protective google 532nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam SR</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>NSAID analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holders</td>
			<td>FST</td>
			<td>12060-01</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoorFLPI-2 blood flow imager</td>
			<td>Moor</td>
			<td>780-nm laser source</td>
			<td>Laser Speckle Contrast Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>68014</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet ointment</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0138063</td>
			<td>eye dryness prevention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractor tips</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Surgi-5014-2</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>198250</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7513</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue glue</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>NC9855218</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tPA</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>Cathflo activase 2mg</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51425</td>
			<td>TTC infacrt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model

Un modèle idéal d’AVC thromboembolique nécessite certaines propriétés, notamment des procédures chirurgicales relativement simples avec une faible mortalité, une taille et une localisation d’infarctus constantes, une précipitation de caillots sanguins mélangés plaquettaire/fibrine similaires à ceux des patients, et une sensibilité adéquate au traitement fibrinolytique. Le modèle d’AVC photothrombotique à base de colorant rose bengale (RB) répond aux deux premières exigences, mais est hautement réfractaire au traitement lytique médié par le tPA, probablement en raison de sa composition en caillots riche en plaquettes, mais pauvre en fibrine. Nous pensons que la combinaison d’un colorant RB (50 mg/kg) et d’une dose sub-thrombotique de thrombine (80 U/kg) pour la photoactivation visant la branche proximale de l’artère cérébrale moyenne (MCA) peut produire des caillots enrichis en fibrine et sensibles au tPA. En effet, le modèle de photothrombose combinée à la thrombine et à la RB (T+RB) a déclenché des caillots sanguins mixtes plaquette/fibrine, comme le montrent l’immunomarquage et les immunoblots, et a maintenu des tailles et des emplacements d’infarctus constants ainsi qu’une faible mortalité. De plus, l’injection intraveineuse de tPA (Alteplase, 10 mg/kg) dans les 2 heures suivant la photoactivation a significativement diminué la taille de l’infarctus dans la photothrombose T+RB. Ainsi, le modèle d’AVC photothrombotique amélioré par la thrombine peut être un modèle expérimental utile pour tester de nouvelles thérapies thrombolytiques.

Tout d’abord, nous avons comparé la teneur en fibrine dans les caillots sanguins induits par la photothrombose RB par rapport à T+RB. Des souris ont été sacrifiées par perfusion transcardique de fixateurs 2 h après la photoactivation, et des cerveaux ont été prélevés pour la coloration par immunofluorescence de la branche MCA dans les plans longitudinaux et transversaux. Dans la photothrombose RB, la branche MCA était densément remplie de plaquettes CD41+ et de peu de fibrine (<strong class="xfig...

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A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

Les modèles traditionnels d’AVC photothrombotique (PTS) induisent principalement des agrégats plaquettaires denses d’une haute résistance au traitement lytique par activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Ici, un modèle PTS murin modifié est introduit en co-injectant de la thrombine et un colorant photosensible pour la photoactivation. Le modèle PTS amélioré par la thrombine produit des caillots mixtes plaquettaire/fibrine et est très sensible à la thrombolyse tPA.

Un modèle d’AVC photothrombotique enrichi en fibrine et sensible au tPA

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Nous voulons créer un modèle d’AVC qui produit un caillot sanguin similaire aux échantillons de patients et qui répond au traitement thrombolytique cliniquement pertinent. Par conséquent, nous modifions le modèle classique de l’AVC photothrombotique et mélangeons la thrombine et le colorant photodynamique rose bengal avant la photoactivation. Nous sommes heureux que cette procédure crée effectivement des caillots sanguins très sensibles à la thrombolyse médiée par le tPA.Ce modèle d’AVC photothrombotique modifié utilisant des procédures chirurgicales très simples avec un faible taux de mortalité a produit une taille et une localisation d’infarctus très constantes. Vous produisez également un caillot sanguin mixte de fibrine et de plaquettes qui est similaire à ceux du patient victime d’un AVC aigu. Par conséquent, nous pensons qu’il est très utile pour la recherche préclinique sur l’AVC de développer des thérapies thrombolytiques plus efficaces.Nous espérons que davantage de personnes utiliseront notre modèle. La démonstration de la procédure sera faite par le Dr Yu-Yo Sun, notre professeur adjoint de recherche dans notre groupe. 30 minutes avant l’intervention, préparez la souris en lui injectant un analgésique.Après avoir anesthésié la souris, effectuez un pincement des orteils pour vous assurer qu’elle est complètement anesthésiée. Retirez ensuite les poils du cou et de la tête gauches avec une crème dépilatoire. Placez la souris sur l’adaptateur pour petit animal en position couchée sur le dos et stérilisez la zone cutanée chirurgicale en l’essuyant avec trois coups alternés de povidone iodée et d’éthanol à 70 %.Sous un microscope à dissection, faites une incision cervicale gauche de 0,5 centimètre à l’aide d’une paire de micro-ciseaux et d’une pince droite à environ 0,2 centimètre latéralement de la ligne médiane. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces finement dentelées, séparez les tissus mous et le fascia pour exposer le LCCA. Ensuite, à l’aide d’une paire de pinces fines et lisses, séparez soigneusement le LCCA du nerf vagal.Placez une suture permanente à double nœud autour du LCCA à l’aide d’une suture en soie 5-0. Retournez la souris en position couchée et faites pivoter le rouleau du pince-nez de 15 degrés. Stérilisez ensuite la zone chirurgicale en essuyant la peau avec trois coups alternés de bétadine et d’éthanol à 70 %.Faites une incision de 0,8 centimètre dans le cuir chevelu à l’aide d’une paire de micro-ciseaux et d’une pince droite le long de l’œil et de l’oreille gauches pour exposer le muscle temporal. Ensuite, faites une incision de 0,5 centimètre le long du bord du muscle temporal sur l’os pariétal gauche. Ensuite, faites une deuxième incision verticale de 0,3 centimètre sur le muscle temporal et rétractez le muscle pour exposer le bord de l’os pariétal et de l’os squamosal.Assurez-vous de visualiser le point de repère de la suture coronale entre les os frontal et pariétal. Ensuite, humidifiez le crâne en appliquant une solution saline stérile pour révéler le MCA gauche, et marquez la branche proximale du MCA sur l’os squamosal avec un marqueur. Tracez délicatement un cercle d’un millimètre de diamètre autour de cette zone marquée à l’aide d’une perceuse pneumatique.Ensuite, amincissez le crâne d’environ 0,2 millimètre de profondeur sans toucher la dure-mère inférieure. Arrêtez le forage lorsqu’il reste une très fine couche d’os. Ensuite, mélangez la solution de thrombine et de rose bengale en fonction du poids corporel de la souris et injectez lentement le mélange dans le sinus rétro-orbitaire avec une aiguille de calibre 31.Appliquez une pommade pour les yeux sur les deux yeux pour prévenir la sécheresse. Appliquez l’illuminateur avec une lumière laser de 532 nanomètres sur le site foré à une distance de deux pouces pendant 20 minutes. Visualisez l’éclairage au niveau de la branche proximale du MCA à l’aide de lunettes de projection laser.Après 20 minutes, arrêtez l’éclairage laser. Faites une fenêtre crânienne de trois millimètres de diamètre sur l’os pariétal du crâne et placez une vitre de protection dessus. Localisez ensuite le MCA distal sous une lentille d’objectif à immersion dans l’eau 20x.Étiquetez la plaquette circulante par injection dans la veine caudale de l’anticorps anti-GP1b-bêta conjugué DyLight 488 cinq minutes avant l’imagerie. Ensuite, injectez rétro-orbitalement le mélange de solution de thrombine et de rose bengale. Photoactivez le MCA à l’aide d’un système laser de 532 nanomètres avec un faisceau laser de 10 micromètres de diamètre, et enregistrez l’image jusqu’à la formation du thrombus.Pour l’administration de tPA, placez l’animal anesthésié sur un tampon chaud à 37 degrés Celsius. Enveloppez sa queue d’une gaze humide chaude à 45 degrés Celsius pendant une minute au point de temps post-photoactivation sélectionné. Ensuite, injectez le tPA humain recombinant par la veine caudale.Injectez 50 % en bolus et perfusez les 50 % restants pendant 30 minutes à l’aide d’une pompe à perfusion. Pour surveiller le flux sanguin cérébral, faites une incision médiane sur le cuir chevelu avec le crâne exposé. Hydratez le crâne avec une solution saline stérile et appliquez doucement le gel à ultrasons dessus, en veillant à éviter les poils ou les bulles d’air dans le gel.Surveillez le flux sanguin cérébral dans les deux hémisphères cérébraux sous l’imageur de contraste laser pendant 10 minutes. Le marquage par immunofluorescence montre que dans la photothrombose à base de colorant rose bengale, la branche MCA était densément remplie de plaquettes CD41 positives et de peu de fibrine. En revanche, dans la photothrombose thrombine plus rose bengale, la branche MCA a été occluse par des caillots de plaquettes et de fibrine mélangés au hasard.L’analyse par immunotransfert a montré une augmentation de plus de deux fois du dépôt de fibrine dans l’hémisphère ipsilatéral dans la photothrombose de la thrombine et du bengale de rose par rapport à la photothrombose du bengale de rose seule. L’imagerie intravitale au microscope confocal a montré qu’une injection intraveineuse de thrombine ne parvenait pas à induire des agrégats plaquettaires, même sous éclairage laser. Les plaquettes ont formé des caillots homogènes dans le modèle de photothrombose du bengale rose, mais des agrégats inégaux avec de multiples régions faibles dans le modèle de la thrombine et du bengale rose.Le CBF de la même souris avant et 24 heures après le traitement par tPA par rapport au traitement par véhicule a été mesuré par imagerie par contraste de chatoiement laser et normalisé à l’hémisphère controlatéral. Dans la photothrombose du Bengale rose, le traitement par tPA a conduit à une tendance à la récupération du CBF, en particulier dans la zone de la frontière ischémique par rapport aux souris traitées par véhicule. Dans la photothrombose de la thrombine et de la rose bengale, la récupération du CBF chez les souris traitées par tPA était plus importante, et les branches proximales de l’ACM devenaient souvent visibles à 24 heures.Dans la photothrombose du Bengale rose, une taille d’infarctus similaire a été détectée chez des souris traitées par véhicule et traitées par tPA. En revanche, dans la photothrombose de la thrombine et du bengale rose, le traitement lytique tPA a significativement réduit l’infarctus à 0,5, une ou deux heures, mais pas six heures après la photoactivation par rapport aux souris traitées par véhicule, La génération de fibrine médiée par la thrombine est cruciale pour la formation de thrombus dans cette procédure. Cette méthode peut être utilisée pour étudier la composition des caillots et pour étudier plus en détail les traitements thrombolytiques.À la suite de cette procédure, d’autres méthodes de traitement par thrombolyse peuvent être appliquées et l’efficacité ultérieure déterminée. L’ajout de thrombine permet d’ajuster la composition du caillot de pauvre en fibrine à riche en fibrine, ce qui permet aux chercheurs de développer des stratégies thérapeutiques cliniquement pertinentes.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Chargement rétrograde des nerfs, des tracts, et les racines spinales avec des colorants fluorescents

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Recherche

Neurosciences

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Progénitrices dérivées de Système de culture Oligodendrocyte du cerveau foetal humain

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Issu l&#39;évolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES

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