Name: a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00
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Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse unterstützt (NS108763, NS100419, NS095064 und HD080429 an C.Y. K. und NS106592 an Y.Y.S.).

Dieses Protokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Virginia genehmigt und folgt der Richtlinie der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Abbildung 1A zeigt die Abfolge der chirurgischen Eingriffe dieses Protokolls.
1. Aufbau der Chirurgie
<ol><li>Legen Sie mindestens 15 Minuten vor der Operation ein Wärmekissen mit einer Temperatureinstellung von 37 °C auf den Kleintierada...

<ol>
	<li>Lyden, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).</li><li>Linfante, I., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+reperfusion+therapies+in+the+era+of+mechanical+thrombectomy.">Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy.</a> Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).</li><li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endovascular+Therapy+for+Ischemic+stroke+with+perfusion-imaging+selection.">Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).</li><li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li><li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis.">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li><li>Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+blood+flow+restoration+and+reperfusion+injury+after+ultraviolet+laser-facilitated+middle+cerebral+artery+recanalization+in+rat+thrombotic+stroke.">Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke.</a> Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).</li><li>Uzdensky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombotic+stroke+as+a+model+of+ischemic+stroke.">Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke.</a> Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).</li><li>Karatas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+produced+by+topical+FeCl(3)+application:+a+novel+model+suitable+for+intravital+microscopy+and+thrombolysis+studies.">Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion.">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Alteplase+in+a+mouse+model+of+acute+ischemic+stroke:+A+retrospective+pooled+analysis.">Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis.</a> Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).</li><li>Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+model+of+cerebral+infarction.+Homologous+blood+clot+emboli+in+rats.">An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats.</a> Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).</li><li>Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+model+of+thromboembolic+stroke+and+rt-PA+induced+reperfusion+in+the+rat.">Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat.</a> Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).</li><li>Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Tenecteplase+with+Alteplase+on+clinical+rating+scores+following+small+clot+embolic+strokes+in+rabbits.">Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits.</a> Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+combined+tPA-Edaravone+therapy+in+experimental+thrombotic+stroke.">Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke.</a> PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Edaravone+prevents+transient+hypoxic-ischemic+brain+injury:+Implications+for+perioperative+neuroprotection.">Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection.</a> Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+mice+are+sensitive+to+hypoxia/ischemia-induced+stroke+but+respond+to+tissue-type+plasminogen+activator+treatment.">Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment.</a> Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).</li><li>Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thrombotic+stroke+model+based+on+transient+cerebral+hypoxia-ischemia.">A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).</li><li>Pena-Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+neutrophil+extracellular+traps+reverses+thrombotic+stroke+tPA+(tissue-type+plasminogen+activator)+resistance.">Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance.</a> Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).</li><li>Denorme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAMTS13-mediated+thrombolysis+of+t-PA-resistant+occlusions+in+ischemic+stroke+in+mice.">ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice.</a> Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).</li><li>Marder, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombi+retrieved+from+cerebral+arteries+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke.</a> Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).</li><li>Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+thrombi+retrieved+in+stroke+due+to+large+vessel+occlusion.">Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+photothrombotic+stroke+model+with+an+increased+fibrin+content+and+improved+responses+to+tPA-lytic+treatment.">A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment.</a> Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).</li><li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).</li><li>Gupta, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+gelsolin+in+acute+pulmonary+thromboembolism+and+thrombosis+in+the+carotid+artery+of+mice.">Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice.</a> PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).</li><li>Carroll, B. J., Piazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercoagulable+states+in+arterial+and+venous+thrombosis:+When,+how,+and+who+to+test.">Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test.</a> Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).</li><li>Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenecteplase+for+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke:+A+review+of+completed+and+ongoing+randomized+controlled+trials.">Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials.</a> International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).</li><li>McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+antiplatelet+therapies:+emphasis+on+preserving+haemostasis.">Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).</li><li>Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+crculation+in+ischemic+stroke:+Assessment+tools+and+therapeutic+strategies.">Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies.</a> Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).</li><li>Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+etymology+of+the+collateral+circulation.">A brief etymology of the collateral circulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).</li></ol>

Der traditionelle photothrombotische RB-Schlaganfall, der 1985 eingeführt wurde, ist ein attraktives Modell der fokalen zerebralen Ischämie für einfache chirurgische Eingriffe, niedrige Mortalität und hohe Reproduzierbarkeit des Hirninfarkts. 5 In diesem Modell aktiviert der photodynamische Farbstoff RB die Blutplättchen bei Lichtanregung schnell, was zu dichten Aggregaten führt, die das Blutgefäß verschließen 5,8,23.<sup class="x...

Die endovaskuläre Thrombektomie und die tPA-vermittelte Thrombolyse sind die einzigen beiden von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Therapien des akuten ischämischen Schlaganfalls, von dem in den Vereinigten Staaten jährlich ~700.000 Patienten betroffen sind1. Da die Anwendung der Thrombektomie auf den Verschluss großer Gefäße (LVO) beschränkt ist, während die tPA-Thrombolyse Verschlüsse kleiner Gefäße lindern kann, sind beide wertvolle Therapien des akuten ischämischen Schlaganfalls2. Darüber hinaus verbessert die Kombination beider Therapien (z.B. Einleitung einer tPA-Thrombolyse innerhalb von 4,5 Stunden nach Beginn des Schlaganfalls, gefolgt von einer Thrombektomie) die Reperfusion und die funktionellen Ergebnisse3. So bleibt die Optimierung der Thrombolyse auch im Zeitalter der Thrombektomie ein wichtiges Ziel für die Schlaganfallforschung.
Thromboembolische Modelle sind ein wesentliches Werkzeug für die präklinische Schlaganfallforschung mit dem Ziel, thrombolytische Therapien zu verbessern. Dies liegt daran, dass mechanische Gefäßverschlussmodelle (z. B. intraluminaler Naht-MCA-Verschluss) keine Blutgerinnsel erzeugen und die schnelle Wiederherstellung des zerebralen Blutflusses nach der Entfernung des mechanischen Verschlusses übermäßig idealisiert ist 4,5. Zu den wichtigsten thromboembolischen Modellen gehören bisher die Photothrombose 6,7,8, die topische Anwendung von Eisenchlorid (FeCl3)9, die Mikroinjektion von Thrombin in den MCA-Zweig 10,11, die Injektion von ex vivo (Mikro-)Embolien in das MCA oder die Arteria carotis communis (CCA)12,13,14 und die transiente Hypoxie-Ischämie (tHI)15,16, 17,18. Diese Schlaganfallmodelle unterscheiden sich in der histologischen Zusammensetzung der nachfolgenden Gerinnsel und der Sensitivität gegenüber tPA-vermittelten lytischen Therapien (Tabelle 1). Sie unterscheiden sich auch in den chirurgischen Anforderungen der Kraniotomie (erforderlich für die In-situ-Thrombininjektion und die topische Anwendung von FeCl3), der Konsistenz der Infarktgröße und -lokalisation (z. B. führt die CCA-Infusion von Mikroembolien zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen) und den globalen Auswirkungen auf das kardiovaskuläre System (z. B. erhöht tHI die Herzfrequenz und das Herzzeitvolumen, um die Hypoxie-induzierte periphere Vasodilatation zu kompensieren).
Das RB-Farbstoff-basierte photothrombotische Schlaganfallmodell (PTS) hat viele attraktive Merkmale, darunter einfache kraniotomiefreie chirurgische Eingriffe, eine niedrige Mortalität (typischerweise < 5 %) und eine vorhersagbare Größe und Lokalisation des Infarkts (im MCA-liefernden Bereich), aber es hat zwei wesentliche Einschränkungen. 8 Der erste Vorbehalt ist das schwache bis Null-Ansprechen auf eine tPA-vermittelte thrombolytische Behandlung, was auch ein Nachteil des FeCl-3-Modells ist 7,19,20. Der zweite Vorbehalt von PTS- und FeCl-3-Schlaganfallmodellen besteht darin, dass die nachfolgenden Thromben aus dicht gepackten Thrombozytenaggregaten mit einer geringen Menge Fibrin bestehen, was nicht nur zu ihrer Widerstandsfähigkeit gegenüber der tPA-lytischen Therapie führt, sondern auch vom Muster der gemischten Thrombozyten:Fibrin-Thromben bei akuten ischämischen Schlaganfallpatienten abweicht 21,22. Im Gegensatz dazu besteht das in situ Thrombin-Mikroinjektionsmodell hauptsächlich aus polymerisiertem Fibrin und einem unsicheren Gehalt an Thrombozyten10.
Vor diesem Hintergrund stellten wir die Hypothese auf, dass die Beimischung von RB und einer subthrombotischen Dosis Thrombin zur MCA-gezielten Photoaktivierung durch einen ausgedünnten Schädel die Fibrinkomponente in der resultierenden Thrombe erhöhen und die Empfindlichkeit gegenüber tPA-vermittelter lytischer Behandlung erhöhen kann. Wir haben diese Hypothese bestätigt,23 und hier beschreiben wir detaillierte Prozeduren des modifizierten (T+RB) photothrombotischen Schlaganfallmodells.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8877</td>
			<td>infarct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon monofilament suture</td>
			<td>LOOK</td>
			<td>766B</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>624143</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>543nm laser beam</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>25-LGP-193-249</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adult male mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>10~14 weeks old (22~30 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia bar for mouse adaptor</td>
			<td>machine shop, UVA</td>
			<td></td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td>euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Dentamerica</td>
			<td>Rotex 782</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microscope</td>
			<td>Dino-Lite</td>
			<td>AM2111</td>
			<td>brain imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ40</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (serrated)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11370-31</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (smooth)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11373-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa Fluro 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>13008-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pump with warming pad</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP700</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>200</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with 31G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>328291</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser protective google 532nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam SR</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>NSAID analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holders</td>
			<td>FST</td>
			<td>12060-01</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoorFLPI-2 blood flow imager</td>
			<td>Moor</td>
			<td>780-nm laser source</td>
			<td>Laser Speckle Contrast Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>68014</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet ointment</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0138063</td>
			<td>eye dryness prevention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractor tips</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Surgi-5014-2</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>198250</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7513</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue glue</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>NC9855218</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tPA</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>Cathflo activase 2mg</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51425</td>
			<td>TTC infacrt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model

Ein ideales thromboembolisches Schlaganfallmodell erfordert bestimmte Eigenschaften, darunter relativ einfache chirurgische Eingriffe mit geringer Mortalität, eine konsistente Infarktgröße und -lokalisation, Ausfällung von Blutplättchen-Fibrin-gemischten Blutgerinnseln, die denen bei Patienten ähneln, und eine ausreichende Empfindlichkeit gegenüber fibrinolytischer Behandlung. Das photothrombotische Schlaganfallmodell auf Basis von Rosen-Bengalen (RB) erfüllt die ersten beiden Anforderungen, ist aber sehr refraktär gegenüber tPA-vermittelter lytischer Behandlung, vermutlich aufgrund seiner plättchenreichen, aber fibrinarmen Gerinnselzusammensetzung. Wir gehen davon aus, dass die Kombination von RB-Farbstoff (50 mg/kg) und einer subthrombotischen Dosis Thrombin (80 U/kg) zur Photoaktivierung auf den proximalen Ast der mittleren Hirnarterie (MCA) fibrinangereicherte und tPA-empfindliche Gerinnsel erzeugen kann. In der Tat löste das kombinierte Photothrombosemodell von Thrombin und RB (T+RB) gemischte Blutgerinnsel aus Thrombozyten und Fibrin aus, wie durch Immunfärbung und Immunablots gezeigt wurde, und behielt konsistente Infarktgrößen und -lokalisationen sowie eine niedrige Mortalität bei. Darüber hinaus verringerte die intravenöse Injektion von tPA (Alteplase, 10 mg/kg) innerhalb von 2 h nach der Photoaktivierung die Infarktgröße bei T+RB-Photothrombose signifikant. Daher könnte das Thrombin-verstärkte photothrombotische Schlaganfallmodell ein nützliches experimentelles Modell sein, um neuartige thrombolytische Therapien zu testen.

Zunächst verglichen wir den Fibringehalt in RB mit T+RB-Photothrombose-induzierten Blutgerinnseln. Die Mäuse wurden 2 Stunden nach der Photoaktivierung durch transkardiale Perfusion von Fixiermitteln getötet, und die Gehirne wurden für die Immunfluoreszenzfärbung des MCA-Zweiges in der Längs- und Transversalebene entfernt. Bei der RB-Photothrombose war der MCA-Zweig dicht gepackt mit CD41+-Thrombozyten und wenig Fibrin (Abbildung 2A,C). Im Gegensatz dazu war...

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A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

Traditionelle photothrombotische Schlaganfallmodelle (PTS) induzieren hauptsächlich dichte Thrombozytenaggregate mit einer hohen Resistenz gegen eine lytische Behandlung mit Gewebeplasminogenaktivator (tPA). Hier wird ein modifiziertes murines PTS-Modell durch Co-Injektion von Thrombin und lichtempfindlichem Farbstoff zur Photoaktivierung eingeführt. Das Thrombin-verstärkte PTS-Modell erzeugt gemischte Thrombozyten-Fibrin-Gerinnsel und ist hochempfindlich gegenüber tPA-Thrombolyse.

Ein mit Fibrin angereichertes und tPA-sensitives photothrombotisches Schlaganfallmodell

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Wir wollen ein Schlaganfallmodell erstellen, das ein Blutgerinnsel erzeugt, das Patientenproben ähnelt und auf die klinisch relevante thrombolytische Therapie anspricht. Daher modifizieren wir das klassische photothrombotische Schlaganfallmodell und mischen Thrombin und den photodynamischen Farbstoff Rose Bengal vor der Photoaktivierung. Wir freuen uns, dass dieses Verfahren tatsächlich Blutgerinnsel erzeugt, die sehr empfindlich auf die tPA-vermittelte Thrombolyse reagieren.Dieses modifizierte photothrombotische Schlaganfallmodell verwendet sehr einfache chirurgische Eingriffe mit einer niedrigen Mortalitätsrate und führt zu einer sehr konsistenten Infarktgröße und -lokalisation. Sie produzieren auch ein gemischtes Blutgerinnsel aus Fibrin und Blutplättchen, das denen des akuten Schlaganfallpatienten ähnelt. Daher halten wir es für die präklinische Schlaganfallforschung für sinnvoll, effektivere thrombolytische Therapien zu entwickeln.Wir hoffen, dass mehr Menschen unser Modell nutzen. Das Verfahren wird von Dr. Yu-Yo Sun, unserem wissenschaftlichen Assistenzprofessor in unserer Gruppe, demonstriert. Bereiten Sie die Maus 30 Minuten vor der Operation vor, indem Sie ein Analgetikum injizieren.Nachdem Sie die Maus betäubt haben, kneifen Sie die Zehen zusammen, um sicherzustellen, dass sie vollständig betäubt ist. Anschließend die Haare am linken Hals und Kopf mit Haarentfernungscreme entfernen. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf den Kleintieradapter und sterilisieren Sie den chirurgischen Hautbereich, indem Sie ihn mit drei abwechselnden Streichen von Povidon-Jod und 70%igem Ethanol abwischen.Machen Sie unter einem Präpariermikroskop einen 0,5 Zentimeter langen linken Halsschnitt mit einer Mikroschere und einer geraden Pinzette etwa 0,2 Zentimeter seitlich der Mittellinie. Ziehen Sie dann mit einer feinen gezackten Pinzette das Weichgewebe und die Faszie auseinander, um die LCCA freizulegen. Trennen Sie dann mit einer feinen, glatten Pinzette vorsichtig den LCCA vom Vagusnerv.Legen Sie eine permanente Doppelknotennaht mit einer 5-0-Seidennaht um die LCCA. Drehen Sie die Maus in eine Bauchlage und drehen Sie die Nasenklammerrolle um 15 Grad. Sterilisieren Sie dann den Operationsbereich, indem Sie die Haut mit drei abwechselnden Streichen von Betadin und 70%igem Ethanol abwischen.Machen Sie einen 0,8 Zentimeter langen Schnitt in die Kopfhaut mit einer Mikroschere und einer geraden Pinzette entlang des linken Auges und Ohrs, um den Schläfenmuskel freizulegen. Als nächstes machen Sie einen 0,5 Zentimeter langen Schnitt entlang der Kante des Schläfenmuskels am linken Scheitelknochen. Machen Sie dann einen zweiten 0,3 Zentimeter langen vertikalen Schnitt am Schläfenmuskel und ziehen Sie den Muskel zurück, um den Rand des Scheitelknochens und des Plattenepithelknochens freizulegen.Stellen Sie sicher, dass Sie die Landmarke der koronalen Naht zwischen Frontal- und Scheitelknochen visualisieren. Als nächstes befeuchten Sie den Schädel, indem Sie sterile Kochsalzlösung auftragen, um das linke MCA freizulegen, und markieren Sie den proximalen MCA-Ast auf dem Plattenepithelknochen mit einem Marker. Zeichnen Sie vorsichtig mit einem pneumatischen Zahnbohrer einen Kreis mit einem Durchmesser von einem Millimeter, der diesen markierten Bereich umgibt.Dann dünnen Sie den Schädel etwa 0,2 Millimeter tief aus, ohne die darunter liegende Dura zu berühren. Stoppen Sie das Bohren, wenn eine sehr dünne Knochenschicht übrig bleibt. Als nächstes mischen Sie die Thrombin- und Rosenbengalenlösung basierend auf dem Körpergewicht der Maus und injizieren die Mischung langsam mit einer 31-Gauge-Nadel in den retroorbitalen Sinus.Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden. Tragen Sie den Strahler mit einem 532-Nanometer-Laserlicht 20 Minuten lang in einem Abstand von zwei Zoll auf die gebohrte Stelle auf. Visualisieren Sie die Beleuchtung am proximalen Ast des MCA durch eine Laserprojektionsbrille.Stoppen Sie nach 20 Minuten die Laserbeleuchtung. Machen Sie ein Schädelfenster von drei Millimetern Durchmesser auf das Scheitelbein des Schädels und setzen Sie ein Deckglas darauf. Platzieren Sie dann das distale MCA unter einer 20-fachen Wasserimmersionsobjektivlinse.Markierung des zirkulierenden Blutplättchens durch Injektion des Schwanzvenen-Antikörpers DyLight 488 gegen GP1b-beta fünf Minuten vor der Bildgebung. Injizieren Sie dann retroorbital die Mischung aus Thrombin und Rosenbengalenlösung. Photoaktivieren Sie den MCA mit einem 532-Nanometer-Lasersystem mit einem Laserstrahl von 10 Mikrometern Durchmesser und zeichnen Sie das Bild bis zur Thrombusbildung auf.Für die tPA-Verabreichung wird das betäubte Tier auf eine 37 Grad Celsius warme Unterlage gelegt. Wickeln Sie seinen Schwanz mit einer 45 Grad Celsius warmen, nassen Gaze für eine Minute zum ausgewählten Zeitpunkt nach der Photoaktivierung um. Als nächstes injizieren Sie das rekombinante humane tPA durch die Schwanzvene.Injizieren Sie 50 % als Bolus und lassen Sie die restlichen 50 % über 30 Minuten mit einer Infusionspumpe infundieren. Um den zerebralen Blutfluss zu überwachen, machen Sie einen Mittellinienschnitt auf der Kopfhaut, wobei der Schädel freiliegt. Befeuchten Sie den Schädel mit steriler Kochsalzlösung und tragen Sie das Ultraschallgel sanft darauf auf, wobei Sie darauf achten sollten, Haare oder Luftblasen im Gel zu vermeiden.Überwachen Sie den zerebralen Blutfluss in beiden Gehirnhälften unter dem Laser-Speckle-Kontrast-Imager für 10 Minuten. Die Immunfluoreszenzmarkierung zeigt, dass bei der Photothrombose auf Basis des Rosen-Bengalenfarbstoffs der MCA-Zweig dicht mit CD41-positiven Thrombozyten und wenig Fibrin gefüllt war. Im Gegensatz dazu war der MCA-Zweig bei der Thrombin plus Rosenbengalen-Photothrombose durch zufällig gemischte Thrombozyten- und Fibringerinnsel verschlossen.Die Immunoblotting-Analyse zeigte eine mehr als doppelt so hohe Fibrinablagerung in der ipsilateralen Hemisphäre bei der Photothrombin plus Rosenbengalen im Vergleich zur Rosenbengalen-Photombose allein. Die konfokalmikroskopische intravitale Bildgebung zeigte, dass eine intravenöse Thrombininjektion auch unter Laserbeleuchtung keine Thrombozytenaggregate induzierte. Die Thrombozyten bildeten homogene Gerinnsel im Rose-Bengal-Photothrombose-Modell, aber ungleichmäßige Aggregate mit mehreren schwachen Regionen im Thrombin-plus-Rose-Bengal-Modell.Der CBF derselben Maus vor und 24 Stunden nach der tPA-Behandlung im Vergleich zur Vehikelbehandlung wurde mittels Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung gemessen und auf die kontralaterale Hemisphäre normalisiert. Bei der Rosenbengalen-Photothrombose führte die tPA-Behandlung zu einem Trend der CBF-Erholung, insbesondere im ischämischen Grenzbereich im Vergleich zu den mit Vehikeln behandelten Mäusen. Bei der Thrombin-plus-Rosenbengal-Photothrombose war die Erholung von CBF bei tPA-behandelten Mäusen ausgeprägter, und die proximalen MCA-Äste wurden oft nach 24 Stunden sichtbar.Bei der Rosenbengalen-Photothrombose wurde eine ähnliche Infarktgröße bei Vehikel-behandelten und tPA-behandelten Mäusen festgestellt. Im Gegensatz dazu reduzierte die lytische tPA-Behandlung bei Thrombin plus Rosenbengal-Photothrombose den Infarkt signifikant nach 0,5, einer oder zwei Stunden, aber nicht sechs Stunden nach der Photoaktivierung im Vergleich zu vehikelbehandelten Mäusen. Diese Methode kann zur Untersuchung der Gerinnselzusammensetzung und zur weiteren Untersuchung thrombolytischer Behandlungen verwendet werden.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden der Thrombolysetherapie angewendet und die spätere Wirksamkeit bestimmt werden. Die Zugabe von Thrombin ermöglicht es, die Gerinnselzusammensetzung von fibrinarm auf fibrinreich einzustellen, so dass Forscher klinisch relevante therapeutische Strategien entwickeln können.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Retrograde Loading von Nerven, Tracts, und Spinalwurzeln mit Fluoreszenzfarbstoffen

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

Forschung

Neurowissenschaften

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Progenitor-abgeleiteten Oligodendrozyten Culture System von Human Fetal Gehirn

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Die Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamate Ausverkauf mit Dekonvolutionsanalyse von Astrozytäre Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

3D-Drucktechnologie Verwendung MRI mit Histologie fusionieren: Ein Protokoll für Hirn Sectioning

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Auswertung der bioenergetischen Funktion in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Eine In-Vivo -Bewertung der Störung der Blut - Hirn-Schranke in einem Rattenmodell des ischämischen Schlaganfalls

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

Ein präklinisches Modell zur Beurteilung der Gehirnerholung nach akutem Schlaganfall bei Ratten

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Zeitraffer Live Imaging und Quantifizierung der schnellen dendritischen Zweigdynamik bei der Entwicklung von Drosophila Neuronen

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Konfokale Mikroskopie zur Messung von drei Modi der Fusionsporendynamik in Nebennierenchromaffinzellen

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...