Name: a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskuddene (NS108763, NS100419, NS095064 og HD080429 til C.Y. K.; og NS106592 til Y.Y.S.).

Denne protokollen er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Virginia og følger National Institutes of Health Guideline for Care and Use of Laboratory Animals. Figur 1A skisserer sekvensen av kirurgiske prosedyrer i denne protokollen.
1. Oppsett av kirurgi
<ol><li>Plasser en varmepute med temperaturinnstilling ved 37 °C på smådyradapteren minst 15 minutter før operasjonen. Forbered en neseklemmrulle for adapter som ...

<ol>
	<li>Lyden, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).</li><li>Linfante, I., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+reperfusion+therapies+in+the+era+of+mechanical+thrombectomy.">Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy.</a> Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).</li><li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endovascular+Therapy+for+Ischemic+stroke+with+perfusion-imaging+selection.">Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).</li><li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li><li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis.">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li><li>Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+blood+flow+restoration+and+reperfusion+injury+after+ultraviolet+laser-facilitated+middle+cerebral+artery+recanalization+in+rat+thrombotic+stroke.">Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke.</a> Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).</li><li>Uzdensky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombotic+stroke+as+a+model+of+ischemic+stroke.">Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke.</a> Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).</li><li>Karatas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+produced+by+topical+FeCl(3)+application:+a+novel+model+suitable+for+intravital+microscopy+and+thrombolysis+studies.">Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion.">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Alteplase+in+a+mouse+model+of+acute+ischemic+stroke:+A+retrospective+pooled+analysis.">Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis.</a> Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).</li><li>Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+model+of+cerebral+infarction.+Homologous+blood+clot+emboli+in+rats.">An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats.</a> Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).</li><li>Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+model+of+thromboembolic+stroke+and+rt-PA+induced+reperfusion+in+the+rat.">Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat.</a> Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).</li><li>Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Tenecteplase+with+Alteplase+on+clinical+rating+scores+following+small+clot+embolic+strokes+in+rabbits.">Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits.</a> Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+combined+tPA-Edaravone+therapy+in+experimental+thrombotic+stroke.">Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke.</a> PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Edaravone+prevents+transient+hypoxic-ischemic+brain+injury:+Implications+for+perioperative+neuroprotection.">Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection.</a> Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+mice+are+sensitive+to+hypoxia/ischemia-induced+stroke+but+respond+to+tissue-type+plasminogen+activator+treatment.">Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment.</a> Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).</li><li>Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thrombotic+stroke+model+based+on+transient+cerebral+hypoxia-ischemia.">A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).</li><li>Pena-Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+neutrophil+extracellular+traps+reverses+thrombotic+stroke+tPA+(tissue-type+plasminogen+activator)+resistance.">Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance.</a> Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).</li><li>Denorme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAMTS13-mediated+thrombolysis+of+t-PA-resistant+occlusions+in+ischemic+stroke+in+mice.">ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice.</a> Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).</li><li>Marder, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombi+retrieved+from+cerebral+arteries+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke.</a> Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).</li><li>Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+thrombi+retrieved+in+stroke+due+to+large+vessel+occlusion.">Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+photothrombotic+stroke+model+with+an+increased+fibrin+content+and+improved+responses+to+tPA-lytic+treatment.">A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment.</a> Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).</li><li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).</li><li>Gupta, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+gelsolin+in+acute+pulmonary+thromboembolism+and+thrombosis+in+the+carotid+artery+of+mice.">Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice.</a> PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).</li><li>Carroll, B. J., Piazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercoagulable+states+in+arterial+and+venous+thrombosis:+When,+how,+and+who+to+test.">Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test.</a> Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).</li><li>Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenecteplase+for+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke:+A+review+of+completed+and+ongoing+randomized+controlled+trials.">Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials.</a> International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).</li><li>McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+antiplatelet+therapies:+emphasis+on+preserving+haemostasis.">Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).</li><li>Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+crculation+in+ischemic+stroke:+Assessment+tools+and+therapeutic+strategies.">Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies.</a> Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).</li><li>Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+etymology+of+the+collateral+circulation.">A brief etymology of the collateral circulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).</li></ol>

Det tradisjonelle RB-fototrombotiske hjerneslag, introdusert i 1985, er en attraktiv modell for fokal cerebral iskemi for enkle kirurgiske prosedyrer, lav dødelighet og høy reproduserbarhet av hjerneinfarkt. 5 I denne modellen aktiverer det fotodynamiske fargestoffet RB raskt blodplater ved lyseksitasjon, noe som fører til tette aggregater som okkluderer blodkaret 5,8,23. Den lille mengden fibrin i RB-...

Endovaskulær trombektomi og tPA-mediert trombolyse er de eneste to amerikanske Food and Drug Administration (FDA) -godkjente terapier av akutt iskemisk slag, som rammer ~ 700,000 pasienter årlig i USA1. Fordi anvendelsen av trombektomi er begrenset til okklusjon av store kar (LVO), mens tPA-trombolyse kan lindre okklusjoner av små kar, er begge verdifulle terapier for akutt iskemisk hjerneslag2. Videre bedrer kombinasjonen av begge behandlingene (f.eks. oppstart av tPA-trombolyse innen 4,5 timer etter hjerneslagdebut, etterfulgt av trombektomi) reperfusjonen og funksjonsutfallene3. Optimalisering av trombolyse er derfor fortsatt et viktig mål for hjerneslagforskning, selv i trombektomiens tid.
Tromboemboliske modeller er et viktig verktøy for preklinisk slagforskning som tar sikte på å forbedre trombolytiske terapier. Dette skyldes at mekaniske vaskulære okklusjonsmodeller (f.eks. Intraluminal sutur MCA okklusjon) ikke produserer blodpropper, og dens raske gjenoppretting av cerebral blodstrøm etter fjerning av mekanisk okklusjon er altfor idealisert 4,5. Hittil inkluderer viktige tromboemboliske modeller fototrombose 6,7,8, topisk jernklorid (FeCl3) applikasjon9, mikroinjeksjon av trombin i MCA-grenen 10,11, injeksjon av ex vivo (mikro)emboli i MCA eller arteria carotis communis (CCA)12,13,14 og forbigående hypoksi-iskemi (tHI)15,16, 17,18. Disse slagmodellene har forskjellig histologisk sammensetning av påfølgende blodpropper og sensitivitet for tPA-mediert lytisk behandling (tab 1). De varierer også i det kirurgiske behovet for kraniotomi (nødvendig for in situ trombininjeksjon og lokal påføring av FeCl3), konsistensen av infarktstørrelse og lokalisasjon (f.eks. CCA-infusjon av mikroemboluser gir svært variable utfall) og globale effekter på kardiovaskulærsystemet (f.eks. øker tHI hjertefrekvensen og hjertets minuttvolum for å kompensere for hypoksiindusert perifer vasodilatasjon).
RB-fargestoffbasert fototrombotisk hjerneslag (PTS) -modellen har mange attraktive funksjoner, inkludert enkle kraniotomifrie kirurgiske prosedyrer, lav dødelighet (vanligvis < 5%), og en forutsigbar størrelse og plassering av infarkt (i MCA-forsynende territorium), men den har to store begrensninger. 8 Det første forbeholdet er svak til null respons på tPA-mediert trombolytisk behandling, som også er en ulempe med FeCl3-modellen 7,19,20. Den andre advarselen til PTS- og FeCl3-taktmodeller er at den påfølgende tromben består av tettpakkede blodplateaggregater med en liten mengde fibrin, noe som ikke bare fører til motstandskraft mot tPA-lytisk terapi, men avviker også fra mønsteret av blandet blodplate: fibrintrombi hos pasienter med akutt iskemisk hjerneslag21,22. In situ trombin-mikroinjeksjonsmodellen består derimot hovedsakelig av polymerisert fibrin og et usikkert innhold av trombocytter10.
Gitt resonnementet ovenfor, antydet vi at blanding av RB og en subtrombotisk dose trombin for MCA-målrettet fotoaktivering gjennom tynnet skalle kan øke fibrinkomponenten i den resulterende trombi og øke følsomheten for tPA-mediert lytisk behandling. Vi har bekreftet denne hypotesen,23 og her beskriver vi detaljerte prosedyrer for den modifiserte (T+RB) fototrombotiske slagmodellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8877</td>
			<td>infarct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon monofilament suture</td>
			<td>LOOK</td>
			<td>766B</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>624143</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>543nm laser beam</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>25-LGP-193-249</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adult male mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>10~14 weeks old (22~30 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia bar for mouse adaptor</td>
			<td>machine shop, UVA</td>
			<td></td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td>euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Dentamerica</td>
			<td>Rotex 782</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microscope</td>
			<td>Dino-Lite</td>
			<td>AM2111</td>
			<td>brain imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ40</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (serrated)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11370-31</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (smooth)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11373-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa Fluro 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>13008-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pump with warming pad</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP700</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>200</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with 31G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>328291</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser protective google 532nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam SR</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>NSAID analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holders</td>
			<td>FST</td>
			<td>12060-01</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoorFLPI-2 blood flow imager</td>
			<td>Moor</td>
			<td>780-nm laser source</td>
			<td>Laser Speckle Contrast Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>68014</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet ointment</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0138063</td>
			<td>eye dryness prevention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractor tips</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Surgi-5014-2</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>198250</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7513</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue glue</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>NC9855218</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tPA</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>Cathflo activase 2mg</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51425</td>
			<td>TTC infacrt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model

En ideell tromboembolisk slagmodell krever visse egenskaper, inkludert relativt enkle kirurgiske prosedyrer med lav dødelighet, konsistent infarktstørrelse og lokalisasjon, utfelling av blodplater: fibrinblandede blodpropper som ligner på pasienter, og tilstrekkelig følsomhet for fibrinolytisk behandling. Rosebengal (RB) fargestoffbasert fototrombotisk slagmodell oppfyller de to første kravene, men er svært motstandsdyktig mot tPA-mediert lytisk behandling, antagelig på grunn av sin blodplaterike, men fibrinfattige koagulasjonssammensetning. Vi tenker at kombinasjon av RB-fargestoff (50 mg/kg) og subtrombotisk dose trombin (80 E/kg) til fotoaktivering rettet mot proksimale gren av arteria cerebri media (MCA) kan gi fibrinberikede og tPA-sensitive propper. Faktisk utløste trombin og RB (T + RB) -kombinert fototrombosemodell blandet blodplate: fibrin blodpropper, som vist ved immunfarging og immunoblots, og opprettholdt konsistente infarktstørrelser og steder pluss lav dødelighet. Videre reduserte intravenøs injeksjon av tPA (Alteplase, 10 mg/kg) innen 2 timer etter fotoaktivering infarktstørrelsen signifikant ved T+RB-fototrombose. Dermed kan trombinforsterket fototrombotisk slagmodell være en nyttig eksperimentell modell for å teste nye trombolytiske terapier.

Først sammenlignet vi fibrininnholdet i RB versus T+RB fototromboseinduserte blodpropper. Mus ble ofret ved transkardial perfusjon av fikseringsmidler ved 2 timer etter fotoaktivering, og hjerner ble fjernet for immunfluorescensfarging av MCA-grenen i langsgående og tverrgående plan. Ved RB-fototrombose var MCA-grenen tettpakket med CD41+-trombocytter og lite fibrin (figur 2A,C). I motsetning til dette ble MCA-grenen i T + RB-fototrombose okkludert av tilfeldig...

Watch this Scientific Journal Video about A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model at JoVE.com

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

Tradisjonelle fototrombotiske slagmodeller (PTS) induserer hovedsakelig tette blodplateaggregater med høy motstand mot vevsplasminogenaktivator (tPA)-lytisk behandling. Her introduseres en modifisert murine PTS-modell ved samtidig injeksjon av trombin og lysfølsomt fargestoff for fotoaktivering. Den trombinforsterkede PTS-modellen produserer blandet blodplate: fibrinpropper og er svært følsom for tPA-trombolyse.

En fibrinberiket og tPA-sensitiv fototrombotisk slagmodell

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Vi ønsker å lage en slagmodell som produserer blodpropp som ligner på pasientprøver og responderer på klinisk relevant trombolytisk behandling. Derfor modifiserer vi den klassiske fototrombotiske slagmodellen og blander trombin og det fotodynamiske fargestoffet rose bengal før fotoaktiveringen. Vi er glade for at denne prosedyren faktisk skaper blodpropp som er svært følsomme for tPA-mediert trombolyse.Denne modifiserte fototrombotiske slagmodellen bruker svært enkle kirurgiske prosedyrer med lav dødelighet som ga en svært konsistent infarktstørrelse og plassering. Du produserer også en fibrin- og blodplateblandet blodpropp som ligner på de hos den akutte slagpasienten. Derfor tror vi det er ganske nyttig for preklinisk slagforskning å utvikle mer effektive trombolytiske terapier.Vi håper flere bruker vår modell. Demonstrere prosedyren vil være Dr.Yu-Yo Sun, vår forskningsassistent professor i vår gruppe. 30 minutter før operasjonen, klargjør musen ved å injisere et smertestillende middel.Etter å ha bedøvet musen, utfør en tåklemme for å sikre at den er fullt bedøvet. Fjern deretter håret på venstre nakke og hode med hårfjerningskrem. Plasser musen på det lille dyret adapter i en liggende stilling, og steriliser det kirurgiske hudområdet ved å tørke det med tre vekslende sveip av povidonjod og 70% etanol.Under et dissekerende mikroskop, gjør du et 0,5 centimeter venstre livmorhalssnitt ved hjelp av en mikrosaks og rett tang på omtrent 0,2 centimeter lateralt til midtlinjen. Neste, ved hjelp av et par fine taggete tang, trekk fra hverandre bløtvev og fascia for å avsløre LCCA. Deretter bruker du et par fine glatte tang, skiller forsiktig LCCA fra vagalnerven.Plasser en permanent dobbelknute sutur rundt LCCA ved hjelp av en 5-0 silke sutur. Vend musen til en utsatt stilling, og roter neseklemmrullen med 15 grader. Steriliser deretter operasjonsområdet ved å tørke huden med tre vekslende sveip av Betadin og 70% etanol.Lag et 0,8 centimeter snitt i hodebunnen ved hjelp av en mikrosaks og rett tang langs venstre øye og øre for å avsløre temporalismuskelen. Deretter gjør du et 0,5 centimeter snitt langs kanten av temporalismuskelen på venstre parietalben. Deretter gjør du et andre 0,3 centimeter vertikalt snitt på temporalismuskelen og trekker muskelen tilbake for å avsløre kanten av parietalbenet og squamosalbenet.Sørg for å visualisere landemerket til koronal suturen mellom frontale og parietale bein. Deretter fukter du skallen ved å påføre sterilt saltvann for å avsløre venstre MCA, og merk den proksimale MCA-grenen på squamosalbenet med en markør. Tegn forsiktig en sirkel på en millimeter diameter som omgir dette markerte området med en pneumatisk tannbor.Tynn deretter skallen omtrent 0,2 millimeter dyp uten å berøre undersiden av dura. Stopp boringen når et veldig tynt lag med bein gjenstår. Bland deretter trombin- og rosebengaloppløsningen basert på musens kroppsvekt, og injiser sakte blandingen i retro-orbital sinus med en 31-gauge nål.Påfør øyesalve på begge øynene for å forhindre tørrhet. Påfør belysningen med et 532-nanometer laserlys på borestedet innen en to-tommers avstand i 20 minutter. Visualiser belysningen på den proksimale grenen av MCA gjennom laserprojeksjonsbriller.Etter 20 minutter, stopp laserbelysningen. Lag et kranialvindu på tre millimeter i diameter på parietalbenet på skallen, og legg et dekselglass på det. Finn deretter den distale MCA under en 20x objektivlinse for nedsenking i vann.Merk den sirkulerende blodplaten ved halemont injeksjon av DyLight 488 konjugert anti-GP1b-beta antistoff fem minutter før avbildning. Deretter injiserer retro-orbitalt trombin- og rosebengalløsningsblandingen. Fotoaktiver MCA ved hjelp av et 532-nanometer lasersystem med en laserstråle på 10 mikrometer, og ta opp bildet til trombusdannelse.For tPA-administrasjon, plasser det bedøvede dyret på en 37-graders varm pute. Pakk halen med en 45-graders varm våt gasbind i ett minutt ved det valgte tidspunktet etter fotoaktivering. Deretter injiseres den rekombinante humane tPA gjennom halevenen.Injiser 50 % som en bolusinjeksjon, og fyll de resterende 50 % over 30 minutter med en infusjonspumpe. For å overvåke cerebral blodstrøm, gjør en midtlinje snitt i hodebunnen med skallen utsatt. Fukt skallen med steril saltvann, og bruk forsiktig ultralydgelen på den, og sørg for å unngå hår eller luftbobler i gelen.Overvåk den cerebrale blodstrømmen i begge hjernehalvene under laserflekkkontrastavbildningen i 10 minutter. Immunfluorescensmerking viser at i rosebengalfargestoffbasert fototrombose var MCA-grenen tett pakket med CD41-positive blodplater og lite fibrin. I kontrast, i trombin pluss rose bengal fototrombose, ble MCA-grenen okkludert av tilfeldig blandede blodplater og fibrinpropper.Immunoblottingsanalysen viste en mer enn dobling av fibrinavleiring i den ipsilaterale hemisfæren i trombin pluss fototrombose i rosebengal sammenlignet med rosebengal alene. Konfokalmikroskopbasert intravital avbildning viste at en intravenøs trombininjeksjon ikke induserte blodplateaggregater, selv under laserbelysning. Blodplater dannet homogene propper i rosebengalfototrombosemodellen, men ujevne aggregater med flere svake regioner i trombin pluss rosebengalmodellen.CBF for samme mus før og 24 timer etter tPA versus kjøretøybehandling ble målt ved laserflekkkontrastavbildning og normalisert til den kontralaterale halvkule. I rosebengalfototrombosen førte tPA-behandlingen til en trend med CBF-utvinning, spesielt i det iskemiske grenseområdet sammenlignet med kjøretøybehandlede mus. I trombin pluss rose bengal fototrombose var utvinningen av CBF i tPA-behandlede mus mer fremtredende, og de proksimale MCA-grenene ble ofte synlige etter 24 timer.Ved fototrombose i rosebengal ble det påvist en tilsvarende infarktstørrelse hos kjøretøybehandlede og tPA-behandlede mus. I kontrast, i trombin pluss rose bengal fototrombose, reduserte tPA lytisk behandling signifikant infarkt ved 0,5, en eller to timer, men ikke seks timer etter fotoaktivering sammenlignet med kjøretøybehandlede mus, Trombinmediert fibringenerering er avgjørende for trombusdannelse i denne prosedyren. Denne metoden kan brukes til å undersøke koagulasjonssammensetning og til videre studier av trombolytiske behandlinger.Etter denne prosedyren kan andre metoder for trombolysebehandling anvendes og den senere effekten bestemmes. Tilsetning av trombin gjør det mulig å justere koagulasjonssammensetningen fra fibrinfattig til fibrinrik, slik at forskere kan utvikle klinisk relevante terapeutiske strategier.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Stamfar-avledet Oligodendrocyte Kultur System fra Human fosterets hjerne

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Utlede Tid Course of Glutamat Lagersalg med en deconvolution Analyse av astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

Utnytte 3D utskriftsteknologi til Merge MR med histologi: En protokoll for Brain Seksjonering

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Evaluering av bioenergetiske Funksjon i Cerebral vaskulære endotelceller

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Måle Synaptic Vesicle endocytose i kulturperler hippocampus nerveceller

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Bedømme i Vivo blod - hjerne barrieren avbrudd i en rotte modell av iskemiske hjerneslag

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

En prekliniske modell for å vurdere Brain Recovery etter akutt hjerneslag i rotter

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging og kvantifisering av fast dendrittiske Branch Dynamics i utvikling Drosophila neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Konfokal mikroskopi for å måle tre moduser av Fusion Pore Dynamics i binyrene chromaffin celler

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...