Name: a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00
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Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do NIH (NS108763, NS100419, NS095064 e HD080429 para C.Y. K.; e NS106592 para Y.Y.S.).

Este protocolo é aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia e segue a Diretriz do National Institutes of Health para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório. A Figura 1A descreve a sequência de procedimentos cirúrgicos desse protocolo.
1. Configuração da cirurgia
<ol><li>Colocar uma almofada de aquecimento com temperatura regulada a 37 °C no adaptador de pequenos animais pelo menos 15 minutos ant...

<ol>
	<li>Lyden, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).</li><li>Linfante, I., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+reperfusion+therapies+in+the+era+of+mechanical+thrombectomy.">Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy.</a> Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).</li><li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endovascular+Therapy+for+Ischemic+stroke+with+perfusion-imaging+selection.">Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).</li><li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li><li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis.">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li><li>Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+blood+flow+restoration+and+reperfusion+injury+after+ultraviolet+laser-facilitated+middle+cerebral+artery+recanalization+in+rat+thrombotic+stroke.">Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke.</a> Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).</li><li>Uzdensky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombotic+stroke+as+a+model+of+ischemic+stroke.">Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke.</a> Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).</li><li>Karatas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+produced+by+topical+FeCl(3)+application:+a+novel+model+suitable+for+intravital+microscopy+and+thrombolysis+studies.">Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion.">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Alteplase+in+a+mouse+model+of+acute+ischemic+stroke:+A+retrospective+pooled+analysis.">Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis.</a> Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).</li><li>Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+model+of+cerebral+infarction.+Homologous+blood+clot+emboli+in+rats.">An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats.</a> Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).</li><li>Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+model+of+thromboembolic+stroke+and+rt-PA+induced+reperfusion+in+the+rat.">Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat.</a> Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).</li><li>Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Tenecteplase+with+Alteplase+on+clinical+rating+scores+following+small+clot+embolic+strokes+in+rabbits.">Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits.</a> Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+combined+tPA-Edaravone+therapy+in+experimental+thrombotic+stroke.">Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke.</a> PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Edaravone+prevents+transient+hypoxic-ischemic+brain+injury:+Implications+for+perioperative+neuroprotection.">Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection.</a> Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+mice+are+sensitive+to+hypoxia/ischemia-induced+stroke+but+respond+to+tissue-type+plasminogen+activator+treatment.">Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment.</a> Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).</li><li>Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thrombotic+stroke+model+based+on+transient+cerebral+hypoxia-ischemia.">A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).</li><li>Pena-Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+neutrophil+extracellular+traps+reverses+thrombotic+stroke+tPA+(tissue-type+plasminogen+activator)+resistance.">Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance.</a> Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).</li><li>Denorme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAMTS13-mediated+thrombolysis+of+t-PA-resistant+occlusions+in+ischemic+stroke+in+mice.">ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice.</a> Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).</li><li>Marder, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombi+retrieved+from+cerebral+arteries+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke.</a> Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).</li><li>Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+thrombi+retrieved+in+stroke+due+to+large+vessel+occlusion.">Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+photothrombotic+stroke+model+with+an+increased+fibrin+content+and+improved+responses+to+tPA-lytic+treatment.">A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment.</a> Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).</li><li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).</li><li>Gupta, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+gelsolin+in+acute+pulmonary+thromboembolism+and+thrombosis+in+the+carotid+artery+of+mice.">Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice.</a> PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).</li><li>Carroll, B. J., Piazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercoagulable+states+in+arterial+and+venous+thrombosis:+When,+how,+and+who+to+test.">Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test.</a> Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).</li><li>Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenecteplase+for+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke:+A+review+of+completed+and+ongoing+randomized+controlled+trials.">Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials.</a> International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).</li><li>McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+antiplatelet+therapies:+emphasis+on+preserving+haemostasis.">Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).</li><li>Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+crculation+in+ischemic+stroke:+Assessment+tools+and+therapeutic+strategies.">Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies.</a> Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).</li><li>Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+etymology+of+the+collateral+circulation.">A brief etymology of the collateral circulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).</li></ol>

O tradicional acidente vascular cerebral fototrombótico RB, introduzido em 1985, é um modelo atraente de isquemia cerebral focal para procedimentos cirúrgicos simples, baixa mortalidade e alta reprodutibilidade do infarto cerebral. 5 Nesse modelo, o corante fotodinâmico RB ativa rapidamente as plaquetas à excitação luminosa, levando a agregados densos que ocluem o vaso sanguíneo 5,8,23. No entanto...

A trombectomia endovascular e a trombólise mediada por tPA são as duas únicas terapias aprovadas pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA para acidente vascular cerebral isquêmico agudo, que acomete ~700.000 pacientes anualmente nos Estados Unidos1. Como a aplicação da trombectomia é limitada à oclusão de grandes vasos (LVO), enquanto a trombólise tPA pode aliviar as oclusões de pequenos vasos, ambas são terapias valiosas do acidente vascular cerebral isquêmico agudo2. Além disso, a combinação de ambas as terapias (por exemplo, início de trombólise tPA-dentro de 4,5 horas do início do AVC, seguido de trombectomia) melhora a reperfusão e os resultados funcionais3. Assim, otimizar a trombólise continua sendo um objetivo importante para a pesquisa do AVC, mesmo na era da trombectomia.
Os modelos tromboembólicos são uma ferramenta essencial para a pesquisa pré-clínica de AVC com o objetivo de melhorar as terapias trombolíticas. Isso ocorre porque os modelos de oclusão vascular mecânica (por exemplo, oclusão da ACM por sutura intraluminal) não produzem coágulos sanguíneos, e sua rápida recuperação do fluxo sanguíneo cerebral após a remoção da oclusão mecânica é excessivamente idealizada 4,5. Até o momento, os principais modelos tromboembólicos incluem fototrombose6,7,8, aplicação tópica de cloreto férrico (FeCl3)9, microinjeção de trombina no ramo da ACM 10,11, injeção ex vivo de (micro)êmbolos na ACM ou artéria carótida comum (ACC)12,13,14 e hipóxia-isquemia transitória (tHI)15,16, 17,18. Esses modelos de AVC diferem na composição histológica dos coágulos subsequentes e na sensibilidade às terapias líticas mediadas por tPA (Tabela 1). Eles também variam na necessidade cirúrgica de craniotomia (necessária para injeção in situ de trombina e aplicação tópica de FeCl3), na consistência do tamanho e localização do infarto (por exemplo, a infusão de microêmbolos com CCA produz resultados muito variáveis) e nos efeitos globais sobre o sistema cardiovascular (por exemplo, o tHI aumenta a frequência cardíaca e o débito cardíaco para compensar a vasodilatação periférica induzida por hipóxia).
O modelo de AVC fototrombótico (PTS) baseado em corante RB tem muitas características atraentes, incluindo procedimentos cirúrgicos simples sem craniotomia, baixa mortalidade (tipicamente < 5%) e um tamanho e localização previsíveis do infarto (no território fornecedor de MCA), mas tem duas limitações principais. 8 A primeira ressalva é a resposta fraca a nula ao tratamento trombolítico mediado por tPA, o que também é uma desvantagem do modelo FeCl3 7,19,20. A segunda ressalva dos modelos de PTS e FeCl3 stroke é que os trombos subsequentes consistem em agregados plaquetários densamente embalados com uma pequena quantidade de fibrina, o que não apenas leva à sua resiliência à terapia lítica tPA, mas também se desvia do padrão de trombos mistos de plaquetas:fibrina em pacientes com AVC isquêmicoagudo 21,22. Em contraste, o modelo de microinjeção de trombina-microinjeção in situ compreende principalmente fibrina polimerizada e conteúdo incerto de plaquetas10.
Dado o raciocínio acima, levantamos a hipótese de que a mistura de RB e uma dose subtrombótica de trombina para fotoativação direcionada à MCA através do crânio afinado pode aumentar o componente de fibrina nos trombos resultantes e aumentar a sensibilidade ao tratamento lítico mediado por tPA. Confirmamos essa hipótese23 e descrevemos detalhadamente os procedimentos do modelo fototrombótico de AVC modificado (T+RB).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8877</td>
			<td>infarct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon monofilament suture</td>
			<td>LOOK</td>
			<td>766B</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>624143</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>543nm laser beam</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>25-LGP-193-249</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adult male mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>10~14 weeks old (22~30 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia bar for mouse adaptor</td>
			<td>machine shop, UVA</td>
			<td></td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td>euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Dentamerica</td>
			<td>Rotex 782</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microscope</td>
			<td>Dino-Lite</td>
			<td>AM2111</td>
			<td>brain imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ40</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (serrated)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11370-31</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (smooth)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11373-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa Fluro 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>13008-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pump with warming pad</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP700</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>200</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with 31G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>328291</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser protective google 532nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam SR</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>NSAID analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holders</td>
			<td>FST</td>
			<td>12060-01</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoorFLPI-2 blood flow imager</td>
			<td>Moor</td>
			<td>780-nm laser source</td>
			<td>Laser Speckle Contrast Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>68014</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet ointment</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0138063</td>
			<td>eye dryness prevention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractor tips</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Surgi-5014-2</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>198250</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7513</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue glue</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>NC9855218</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tPA</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>Cathflo activase 2mg</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51425</td>
			<td>TTC infacrt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model

Um modelo ideal de AVC tromboembólico requer certas propriedades, incluindo procedimentos cirúrgicos relativamente simples com baixa mortalidade, tamanho e localização consistentes do infarto, precipitação de coágulos sanguíneos mistos plaquetas:fibrina semelhantes aos dos pacientes e sensibilidade adequada ao tratamento fibrinolítico. O modelo de AVC fototrombótico baseado em corante rosa bengala (RB) atende aos dois primeiros requisitos, mas é altamente refratário ao tratamento lítico mediado por tPA, presumivelmente devido à sua composição de coágulo rica em plaquetas, mas pobre em fibrina. Argumentamos que a combinação de corante RB (50 mg/kg) e uma dose subtrombótica de trombina (80 U/kg) para fotoativação visando o ramo proximal da artéria cerebral média (ACM) pode produzir coágulos enriquecidos com fibrina e sensíveis a tPA. De fato, o modelo de fototrombose combinada com trombina e RB (T+RB) desencadeou coágulos sanguíneos mistos plaquetas:fibrina, como demonstrado por imunomarcação e imunomanchas, e manteve tamanhos e locais de infarto consistentes, além de baixa mortalidade. Além disso, a injeção intravenosa de tPA (Alteplase, 10 mg/kg) dentro de 2 h após a fotoativação diminuiu significativamente o tamanho do infarto na fototrombose T+RB. Assim, o modelo de AVC fototrombótico com trombina pode ser um modelo experimental útil para testar novas terapias trombolíticas.

Primeiro, comparamos o conteúdo de fibrina em coágulos sanguíneos induzidos por fototrombose RB versus T+RB. Camundongos foram sacrificados por perfusão transcárdica de fixadores 2 h após a fotoativação, e cérebros foram removidos para coloração por imunofluorescência do ramo da ACM nos planos longitudinal e transversal. Na fototrombose RB, o ramo da ACM estava densamente preenchido com plaquetas CD41+ e pouca fibrina (Figura 2A,C). Em contraste, o ram...

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A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

Os modelos tradicionais de AVC fototrombótico (STP) induzem principalmente agregados plaquetários densos de alta resistência ao tratamento lítico com ativador do plasminogênio tecidual (tPA). Aqui um modelo de PTS murino modificado é introduzido pela co-injeção de trombina e corante fotossensível para fotoativação. O modelo de PTS com trombina produz coágulos mistos plaquetas:fibrina e é altamente sensível à trombólise tPA.

Modelo de AVC fototrombótico enriquecido com fibrina e sensível ao tPA

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Queremos criar um modelo de AVC que produza coágulo sanguíneo semelhante às amostras de pacientes e responda à terapia trombolítica clinicamente relevante. Portanto, modificamos o modelo clássico de AVC fototrombótico e misturamos trombina e o corante fotodinâmico rosa bengala antes da fotoativação. Estamos satisfeitos que este procedimento realmente cria coágulos sanguíneos que são altamente sensíveis à trombólise mediada por tPA.Este modelo de AVC fototrombótico modificado usa procedimentos cirúrgicos muito simples com uma baixa taxa de mortalidade produziu um tamanho e localização do infarto altamente consistentes. Você também produz um coágulo sanguíneo misto de fibrina e plaquetas que são semelhantes aos do paciente com AVC agudo. Portanto, achamos que é bastante útil para a pesquisa pré-clínica de AVC desenvolver terapias trombolíticas mais eficazes.Esperamos que mais pessoas usem nosso modelo. Quem demonstrará o procedimento será o Dr. Yu-Yo Sun, nosso professor assistente de pesquisa em nosso grupo. 30 minutos antes da cirurgia, prepare o rato injetando um analgésico.Depois de anestesiar o mouse, execute uma pinça do dedo do pé para garantir que ele esteja totalmente anestesiado. Em seguida, remova os pelos do pescoço esquerdo e da cabeça com creme de depilação. Coloque o rato sobre o adaptador de pequenos animais em posição supina e esterilize a área da pele cirúrgica limpando-a com três toques alternados de iodopovidona e etanol a 70%.Sob um microscópio dissecante, faça uma incisão cervical esquerda de 0,5 centímetro usando uma microtesoura e pinça reta a cerca de 0,2 centímetros lateral à linha média. Em seguida, com um par de pinças finas serrilhadas, afaste o tecido mole e a fáscia para expor a ACCE. Em seguida, usando um par de pinças lisas finas, separe cuidadosamente a ACCE do nervo vago.Coloque uma sutura permanente de duplo nó ao redor da ACE usando uma sutura de seda 5-0. Vire o mouse para uma posição prona e gire o rolo do clipe do nariz em 15 graus. Em seguida, esterilize a área cirúrgica limpando a pele com três toques alternados de Betadine e etanol 70%.Faça uma incisão de 0,8 centímetro no couro cabeludo usando uma microtesoura e pinça reta ao longo do olho esquerdo e orelha para expor o músculo temporal. Em seguida, fazer uma incisão de 0,5 centímetro ao longo da borda do músculo temporal no osso parietal esquerdo. Em seguida, faça uma segunda incisão vertical de 0,3 centímetro no músculo temporal e retraia o músculo para expor a borda do osso parietal e do osso escamoso.Certifique-se de visualizar o ponto de referência da sutura coronal entre os ossos frontal e parietal. Em seguida, umedeça o crânio aplicando soro fisiológico estéril para revelar a ACM esquerda e marque o ramo proximal da ACM no osso escamoso com um marcador. Desenhe suavemente um círculo de um milímetro de diâmetro ao redor desta área marcada com uma broca dentária pneumática.Em seguida, afinar o crânio cerca de 0,2 milímetros de profundidade sem tocar a dura-máter por baixo. Pare a perfuração quando uma camada muito fina de osso permanecer. Em seguida, misture a solução de trombina e rosa bengala com base no peso corporal do camundongo e injete lentamente a mistura no seio retroorbital com uma agulha de calibre 31.Aplique pomada ocular em ambos os olhos para evitar o ressecamento. Aplique o iluminador com uma luz laser de 532 nanômetros no local perfurado a uma distância de duas polegadas por 20 minutos. Visualize a iluminação no ramo proximal da ACM através de óculos de projeção a laser.Após 20 minutos, pare a iluminação a laser. Faça uma janela craniana de três milímetros de diâmetro no osso parietal do crânio e coloque um vidro de cobertura sobre ele. Em seguida, localize a ACM distal sob uma lente objetiva de imersão em água 20x.Rotular a plaqueta circulante por injeção na veia caudal do anticorpo conjugado anti-GP1b-beta DyLight 488 cinco minutos antes da aquisição de imagens. Em seguida, injetar retro-orbitalmente a mistura de trombina e solução de rosa bengala. Fotoative a ACM usando um sistema de laser de 532 nanômetros com um feixe de laser de 10 micrômetros de diâmetro e registre a imagem até a formação do trombo.Para a administração de tPA, coloque o animal anestesiado em uma almofada quente de 37 graus Celsius. Envolva sua cauda com uma gaze úmida quente de 45 graus Celsius por um minuto no ponto de tempo pós-fotoativação selecionado. Em seguida, injete o tPA humano recombinante através da veia da cauda.Injetar 50% em bolus e infundir os restantes 50% durante 30 minutos utilizando uma bomba de perfusão. Para monitorar o fluxo sanguíneo cerebral, faça uma incisão na linha média do couro cabeludo com o crânio exposto. Hidrate o crânio com soro fisiológico estéril e aplique suavemente o gel de ultrassom sobre ele, evitando bolhas de cabelo ou ar no gel.Monitore o fluxo sanguíneo cerebral em ambos os hemisférios cerebrais sob o imageador de contraste speckle laser por 10 minutos. A marcação por imunofluorescência mostra que, na fototrombose baseada no corante rosa bengala, o ramo da ACM estava densamente preenchido com plaquetas CD41-positivas e pouca fibrina. Em contraste, na fototrombose de trombina mais rosa bengala, o ramo da ACM foi ocluído por coágulos de plaquetas e fibrina aleatoriamente misturados.A análise de immunoblotting mostrou um aumento maior que duas vezes na deposição de fibrina no hemisfério ipsilateral na fototrombose de trombina mais rosa bengala em comparação com a rosa bengala isoladamente. Imagens intravitais baseadas em microscópio confocal mostraram que uma injeção intravenosa de trombina falhou em induzir agregados plaquetários, mesmo sob iluminação a laser. As plaquetas formaram coágulos homogêneos no modelo de fototrombose da rosa bengala, mas agregados desiguais com múltiplas regiões tênues no modelo trombina mais rosa bengala.O FSC do mesmo camundongo pré e 24 horas pós-tPA versus tratamento com veículo foi medido por meio de contraste speckle laser e normalizado para o hemisfério contralateral. Na fototrombose da rosa bengala, o tratamento com tPA levou a uma tendência de recuperação do FSC, particularmente na área de borda isquêmica em comparação com camundongos tratados com veículo. Na fototrombose da trombina associada à rosa bengala, a recuperação do FSC em camundongos tratados com tPA foi mais proeminente, e os ramos proximais da ACM frequentemente tornaram-se visíveis em 24 horas.Na fototrombose de rosa bengala, um tamanho de infarto semelhante foi detectado em camundongos tratados com veículo e tPA. Em contraste, na trombina associada à fototrombose de rosa bengala, o tratamento lítico tPA reduziu significativamente o infarto em 0,5, uma ou duas horas, mas não em seis horas após a fotoativação em comparação com camundongos tratados com veículo, a geração de fibrina mediada por trombina é crucial para a formação de trombo nesse procedimento. Este método pode ser usado para investigar a composição do coágulo e para estudar mais profundamente tratamentos trombolíticos.Após esse procedimento, outros métodos de terapia de trombólise podem ser aplicados e a eficácia posterior determinada. A adição de trombina torna possível ajustar a composição do coágulo de pobre em fibrina para rica em fibrina, permitindo que os pesquisadores desenvolvam estratégias terapêuticas clinicamente relevantes.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Carregando retrógrado de Nervos, folhetos, e raízes nervosas com corantes fluorescentes

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

Neurociência

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Derivando o Curso momento do desembaraço glutamato com uma Análise de Deconvolução das correntes Transporter astrocitárias

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

Utilizando tecnologia de impressão 3D para mesclar MRI com Histologia: Um protocolo para o Cérebro Seccionamento

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Avaliação da função bioenergética em células endoteliais Vascular Cerebral

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Medindo a endocitose da vesícula sináptica nos neurônios Hippocampal culturas

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Uma avaliação In Vivo do rompimento da barreira hemato - encefálica em um modelo do rato de acidente vascular cerebral isquêmico

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

Um modelo pré-clínico para avaliar a recuperação do cérebro após acidente vascular cerebral agudo em ratos

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Tempo-lapso de imagem ao vivo e quantificação da dinâmica da filial dendrítica rápida no desenvolvimento de neurônios de Drosophila

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Microscopia Confocal para medir três modos de dinâmica de poros de fusão em células adrenal chromaffin

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...