Name: a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH-anslagen (NS108763, NS100419, NS095064 och HD080429 till C.Y.K.; och NS106592 till Y.Y.S.).

Detta protokoll är godkänt av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Virginia och följer National Institutes of Health Guideline for Care and Use of Laboratory Animals. Figur 1A visar sekvensen av kirurgiska ingrepp i detta protokoll.
1. Upplägg för kirurgi
<ol><li>Placera en värmedyna med en temperaturinställning på 37 °C på smådjursadaptern minst 15 minuter före operationen. Förbered en nosklämma för adapter som g?...

<ol>
	<li>Lyden, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).</li><li>Linfante, I., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+reperfusion+therapies+in+the+era+of+mechanical+thrombectomy.">Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy.</a> Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).</li><li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endovascular+Therapy+for+Ischemic+stroke+with+perfusion-imaging+selection.">Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).</li><li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li><li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis.">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li><li>Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+blood+flow+restoration+and+reperfusion+injury+after+ultraviolet+laser-facilitated+middle+cerebral+artery+recanalization+in+rat+thrombotic+stroke.">Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke.</a> Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).</li><li>Uzdensky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombotic+stroke+as+a+model+of+ischemic+stroke.">Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke.</a> Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).</li><li>Karatas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+produced+by+topical+FeCl(3)+application:+a+novel+model+suitable+for+intravital+microscopy+and+thrombolysis+studies.">Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion.">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Alteplase+in+a+mouse+model+of+acute+ischemic+stroke:+A+retrospective+pooled+analysis.">Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis.</a> Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).</li><li>Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+model+of+cerebral+infarction.+Homologous+blood+clot+emboli+in+rats.">An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats.</a> Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).</li><li>Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+model+of+thromboembolic+stroke+and+rt-PA+induced+reperfusion+in+the+rat.">Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat.</a> Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).</li><li>Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Tenecteplase+with+Alteplase+on+clinical+rating+scores+following+small+clot+embolic+strokes+in+rabbits.">Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits.</a> Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+combined+tPA-Edaravone+therapy+in+experimental+thrombotic+stroke.">Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke.</a> PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Edaravone+prevents+transient+hypoxic-ischemic+brain+injury:+Implications+for+perioperative+neuroprotection.">Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection.</a> Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+mice+are+sensitive+to+hypoxia/ischemia-induced+stroke+but+respond+to+tissue-type+plasminogen+activator+treatment.">Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment.</a> Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).</li><li>Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thrombotic+stroke+model+based+on+transient+cerebral+hypoxia-ischemia.">A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).</li><li>Pena-Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+neutrophil+extracellular+traps+reverses+thrombotic+stroke+tPA+(tissue-type+plasminogen+activator)+resistance.">Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance.</a> Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).</li><li>Denorme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAMTS13-mediated+thrombolysis+of+t-PA-resistant+occlusions+in+ischemic+stroke+in+mice.">ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice.</a> Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).</li><li>Marder, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombi+retrieved+from+cerebral+arteries+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke.</a> Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).</li><li>Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+thrombi+retrieved+in+stroke+due+to+large+vessel+occlusion.">Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+photothrombotic+stroke+model+with+an+increased+fibrin+content+and+improved+responses+to+tPA-lytic+treatment.">A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment.</a> Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).</li><li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).</li><li>Gupta, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+gelsolin+in+acute+pulmonary+thromboembolism+and+thrombosis+in+the+carotid+artery+of+mice.">Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice.</a> PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).</li><li>Carroll, B. J., Piazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercoagulable+states+in+arterial+and+venous+thrombosis:+When,+how,+and+who+to+test.">Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test.</a> Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).</li><li>Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenecteplase+for+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke:+A+review+of+completed+and+ongoing+randomized+controlled+trials.">Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials.</a> International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).</li><li>McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+antiplatelet+therapies:+emphasis+on+preserving+haemostasis.">Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).</li><li>Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+crculation+in+ischemic+stroke:+Assessment+tools+and+therapeutic+strategies.">Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies.</a> Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).</li><li>Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+etymology+of+the+collateral+circulation.">A brief etymology of the collateral circulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).</li></ol>

Den traditionella RB-fototrombotiska stroken, som introducerades 1985, är en attraktiv modell för fokal cerebral ischemi för enkla kirurgiska ingrepp, låg dödlighet och hög reproducerbarhet av hjärninfarkt. 5 I denna modell aktiverar det fotodynamiska färgämnet RB snabbt blodplättar vid ljusexcitation, vilket leder till täta aggregat som täpper till blodkärlet 5,8,23. Den lilla mängden fibri...

Endovaskulär trombektomi och tPA-medierad trombolys är de enda två behandlingar av akut ischemisk stroke som godkänts av U.S. Food and Drug Administration (FDA) och som drabbar ~700 000 patienter årligeni USA. Eftersom tillämpningen av trombektomi är begränsad till ocklusion av stora kärl (LVO), medan tPA-trombolys kan lindra ocklusioner av små kärl, är båda värdefulla terapier av akut ischemisk stroke2. Dessutom förbättrar kombinationen av båda behandlingarna (t.ex. initiering av tPA-trombolys inom 4,5 timmar efter strokedebut, följt av trombektomi) reperfusionen och de funktionella resultaten3. Att optimera trombolys är därför fortfarande ett viktigt mål för strokeforskningen, även i trombektomins tidevarv.
Tromboemboliska modeller är ett viktigt verktyg för preklinisk strokeforskning som syftar till att förbättra trombolytiska behandlingar. Detta beror på att mekaniska vaskulära ocklusionsmodeller (t.ex. intraluminal sutur MCA-ocklusion) inte ger blodproppar, och dess snabba återhämtning av cerebralt blodflöde efter avlägsnande av mekanisk ocklusion är alltför idealiserad 4,5. Hittills inkluderar de viktigaste tromboembolimodellerna fototrombos 6,7,8, topikal järnklorid (FeCl3) applicering 9, mikroinjektion av trombin i MCA-grenen 10,11, injektion av ex vivo (mikro)emboli i MCA eller gemensam halspulsåder (CCA)12,13,14 och övergående hypoxi-ischemi (tHI)15,16, 17,18. Dessa strokemodeller skiljer sig åt i den histologiska sammansättningen av efterföljande blodproppar och känsligheten för tPA-medierad lytisk terapi (tabell 1). De varierar också i det kirurgiska behovet av kraniotomi (som behövs för trombininjektion in situ och topikal applicering av FeCl3), konsistensen av infarktens storlek och läge (t.ex. CCA-infusion av mikroemboli ger mycket varierande resultat) och globala effekter på det kardiovaskulära systemet (t.ex. tHI ökar hjärtfrekvensen och hjärtminutvolymen för att kompensera för hypoxi-inducerad perifer vasodilatation).
Den RB-färgbaserade fototrombotiska strokemodellen (PTS) har många attraktiva egenskaper, inklusive enkla kraniotomifria kirurgiska ingrepp, låg dödlighet (vanligtvis < 5 %) och en förutsägbar storlek och plats för infarkt (i MCA-försörjningsområdet), men den har två stora begränsningar. 8 Den första invändningen är svagt till noll svar på tPA-medierad trombolysbehandling, vilket också är en nackdel med FeCl3 modell 7,19,20. Den andra invändningen mot PTS- och FeCl 3-taktsmodeller är att de efterföljande tromberna består av tätt packade trombocytaggregat med en liten mängd fibrin, vilket inte bara leder till dess motståndskraft mot tPA-lytisk behandling, utan också avviker från mönstret av blandade trombocyter:fibrintrombi hos patienter med akut ischemisk stroke21,22. Däremot består in situ trombin-mikroinjektionsmodellen huvudsakligen av polymeriserat fibrin och ett osäkert innehåll av trombocyter10.
Givet ovanstående resonemang antog vi att blandning av RB och en subtrombotisk dos av trombin för MCA-riktad fotoaktivering genom förtunnad skalle kan öka fibrinkomponenten i den resulterande trombin och öka känsligheten för tPA-medierad lytisk behandling. Vi har bekräftat denna hypotes,23 och här beskriver vi detaljerade procedurer för den modifierade (T+RB) fototrombotiska strokemodellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8877</td>
			<td>infarct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon monofilament suture</td>
			<td>LOOK</td>
			<td>766B</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>624143</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>543nm laser beam</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>25-LGP-193-249</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adult male mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>10~14 weeks old (22~30 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia bar for mouse adaptor</td>
			<td>machine shop, UVA</td>
			<td></td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td>euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Dentamerica</td>
			<td>Rotex 782</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microscope</td>
			<td>Dino-Lite</td>
			<td>AM2111</td>
			<td>brain imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ40</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (serrated)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11370-31</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (smooth)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11373-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa Fluro 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>13008-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pump with warming pad</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP700</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>200</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with 31G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>328291</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser protective google 532nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam SR</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>NSAID analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holders</td>
			<td>FST</td>
			<td>12060-01</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoorFLPI-2 blood flow imager</td>
			<td>Moor</td>
			<td>780-nm laser source</td>
			<td>Laser Speckle Contrast Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>68014</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet ointment</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0138063</td>
			<td>eye dryness prevention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractor tips</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Surgi-5014-2</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>198250</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7513</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue glue</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>NC9855218</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tPA</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>Cathflo activase 2mg</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51425</td>
			<td>TTC infacrt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model

En idealisk tromboembolisk strokemodell kräver vissa egenskaper, inklusive relativt enkla kirurgiska ingrepp med låg mortalitet, en konsekvent infarktstorlek och infallsplats, utfällning av blodplättar-fibrin-blandade blodproppar liknande dem hos patienter och en adekvat känslighet för fibrinolytisk behandling. Den färgämnesbaserade fototrombotiska strokemodellen uppfyller de två första kraven men är mycket resistent mot tPA-medierad lytisk behandling, förmodligen på grund av dess blodplättsrika, men fibrinfattiga koagelsammansättning. Vi resonerar att kombinationen av RB-färgämne (50 mg/kg) och en subtrombotisk dos av trombin (80 E/kg) för fotoaktivering riktad mot den proximala grenen av mellersta hjärnartären (MCA) kan ge fibrinberikade och tPA-känsliga blodproppar. Faktum är att den trombin- och RB (T+RB)-kombinerade fototrombosmodellen utlöste blandade blodplättar-fibrinblodproppar, vilket visades genom immunfärgning och immunbloter, och bibehöll konsekventa infarktstorlekar och platser plus låg dödlighet. Dessutom minskade intravenös injektion av tPA (Alteplas, 10 mg/kg) inom 2 timmar efter fotoaktivering signifikant infarktstorleken vid T+RB-fototrombos. Således kan den trombinförstärkta fototrombotiska strokemodellen vara en användbar experimentell modell för att testa nya trombolytiska terapier.

Först jämförde vi fibrinhalten i RB kontra T+RB fototrombosinducerade blodproppar. Möss avlivades genom transkardiell perfusion av fixeringsmedel 2 timmar efter fotoaktivering, och hjärnor avlägsnades för immunofluorescensfärgning av MCA-grenen i längsgående och tvärgående plan. Vid RB-fototrombos var MCA-grenen tätt packad med CD41+-blodplättar och lite fibrin (Figur 2A,C). Däremot var MCA-grenen i T+RB-fototrombos ockluderad av slumpmässigt bland...

Watch this Scientific Journal Video about A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model at JoVE.com

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

Traditionella modeller för fototrombotisk stroke (PTS) inducerar huvudsakligen täta trombocytaggregat med hög resistens mot vävnadsplasminogenaktivator (tPA)-lytisk behandling. Här introduceras en modifierad murin PTS-modell genom saminjektion av trombin och ljuskänsligt färgämne för fotoaktivering. Den trombinförstärkta PTS-modellen ger blandade blodplättar-fibrin-koaguler och är mycket känslig för tPA-trombolys.

En fibrinberikad och tPA-känslig fototrombotisk strokemodell

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Vi vill skapa en strokemodell som ger blodpropp som liknar patientprover och svarar på den kliniskt relevanta trombolysbehandlingen. Därför modifierar vi den klassiska fototrombotiska strokemodellen och blandar trombin och det fotodynamiska färgämnet rose bengal före fotoaktiveringen. Vi är glada över att detta ingrepp verkligen skapar blodproppar som är mycket känsliga för tPA-medierad trombolys.Denna modifierade fototrombotiska strokemodell använder mycket enkla kirurgiska ingrepp med låg dödlighet och gav en mycket konsekvent infarktstorlek och plats. Du producerar också en fibrin- och trombocytblandad blodpropp som liknar dem hos den akuta strokepatienten. Därför tror vi att det är ganska användbart för preklinisk strokeforskning att utveckla mer effektiva trombolytiska terapier.Vi hoppas att fler använder vår modell. Dr.Yu-Yo Sun, vår forskningsassistent i vår grupp, kommer att demonstrera proceduren. 30 minuter före operationen, förbered musen genom att injicera ett smärtstillande medel.Efter att ha bedövt musen, gör ett tånyp för att säkerställa att den är helt bedövad. Ta sedan bort håret på vänster nacke och huvud med hårborttagningskräm. Placera musen på smådjursadaptern i ryggläge och sterilisera det kirurgiska hudområdet genom att torka av det med tre alternerande svep av povidonjod och 70 % etanol.Under ett dissektionsmikroskop gör du ett 0,5 centimeter vänster cervikalt snitt med hjälp av en mikrosax och rak pincett cirka 0,2 centimeter lateralt om mittlinjen. Använd sedan en fin tandad pincett och dra isär mjukvävnaden och fascian för att exponera LCCA. Använd sedan en fin slät pincett och separera försiktigt LCCA från vagusnerven.Placera en permanent dubbelknutsutur runt LCCA med en 5-0 silkessutur. Vänd musen till ett bukläge och vrid näsklämmans rulle 15 grader. Sterilisera sedan operationsområdet genom att torka av huden med tre omväxlande svep Betadine och 70% etanol.Gör ett 0,8 centimeter långt snitt i hårbotten med hjälp av en mikrosax och rak pincett längs vänster öga och öra för att exponera temporalismuskeln. Gör sedan ett 0,5 centimeter långt snitt längs kanten av temporalismuskeln på vänster parietalben. Gör sedan ett andra 0,3 centimeter vertikalt snitt på temporalismuskeln och dra tillbaka muskeln för att exponera kanten på parietalbenet och squamosalbenet.Se till att visualisera landmärket för den koronala suturen mellan frontal- och parietalbenen. Fukta sedan skallen genom att applicera steril koksaltlösning för att avslöja den vänstra MCA, och markera den proximala MCA-grenen på squamosalbenet med en markör. Rita försiktigt en cirkel med en millimeterdiameter som omger detta markerade område med en pneumatisk tandläkarborr.Tunna sedan ut skallen ca 0,2 millimeter djupt utan att vidröra undersidan. Avbryt borrningen när ett mycket tunt lager ben återstår. Blanda sedan trombin- och rosenbengallösningen baserat på musens kroppsvikt och injicera långsamt blandningen i retroorbital sinus med en 31-gauge nål.Applicera ögonsalva på båda ögonen för att förhindra torrhet. Applicera belysningen med ett 532-nanometer laserljus på den borrade platsen inom ett avstånd på två tum i 20 minuter. Visualisera belysningen vid den proximala grenen av MCA genom laserprojektionsglasögon.Stoppa laserbelysningen efter 20 minuter. Gör ett kranialfönster med en diameter på tre millimeter på skallbenet och placera ett täckglas på det. Leta sedan upp den distala MCA:n under en 20x objektivlins för nedsänkning i vatten.Märk det cirkulerande blodplätten genom svansveninjektion av DyLight 488 konjugerad anti-GP1b-beta-antikropp fem minuter före avbildning. Injicera sedan trombin- och rosenbengallösningsblandningen retroorbitalt. Fotoaktivera MCA med ett 532-nanometers lasersystem med en laserstråle med en diameter på 10 mikrometer och spela in bilden tills trombbildning.För administrering av tPA, placera det sövda djuret på en 37-graders varm dyna. Linda in svansen med en 45-graders varm våt gasbinda i en minut vid den valda tidpunkten efter fotoaktiveringen. Därefter injiceras den rekombinanta humana tPA genom svansvenen.Injicera 50 % som en bolus och infundera resterande 50 % under 30 minuter med hjälp av en infusionspump. För att övervaka hjärnans blodflöde, gör ett snitt i mitten av hårbotten med skallen exponerad. Återfukta skallen med steril koksaltlösning och applicera försiktigt ultraljudsgelen på den, se till att undvika hår eller luftbubblor i gelen.Övervaka det cerebrala blodflödet i båda hjärnhalvorna under laserfläckkontrastkameran i 10 minuter. Immunofluorescensmärkning visar att i rose bengal-färgämnesbaserad fototrombos var MCA-grenen tätt packad med CD41-positiva blodplättar och lite fibrin. I kontrast till detta var MCA-grenen vid trombin plus rosebengalisk fototrombos ockluderad av slumpmässigt blandade trombocyt- och fibrinproppar.Immunoblot-analysen visade en mer än fördubblad ökning av fibrindepositionen i den ipsilaterala hemisfären i trombin plus rose bengal fototrombos jämfört med enbart rose bengal. Konfokalmikroskopbaserad intravital avbildning visade att en intravenös trombininjektion misslyckades med att inducera trombocytaggregat, även under laserbelysning. Trombocyter bildade homogena blodproppar i rose bengal fototrombosmodellen men ojämna aggregat med flera svaga regioner i trombin plus rose bengal-modellen.CBF hos samma mus före och 24 timmar efter tPA jämfört med vehikelbehandling mättes med laserfläckkontrastavbildning och normaliserades till den kontralaterala hemisfären. Vid fototrombos i rose bengal ledde tPA-behandlingen till en trend av CBF-återhämtning, särskilt i det ischemiska gränsområdet jämfört med vehikelbehandlade möss. Vid trombin plus rosebengalisk fototrombos var återhämtningen av CBF hos tPA-behandlade möss mer framträdande, och de proximala MCA-grenarna blev ofta synliga efter 24 timmar.Vid fototrombos upptäcktes en liknande infarktstorlek hos vehikelbehandlade och tPA-behandlade möss. Däremot, vid trombin plus rose bengal fototrombos, minskade tPA-lytisk behandling signifikant infarkt vid 0,5, en eller två timmar, men inte vid sex timmar efter fotoaktivering jämfört med vehikelbehandlade möss, trombinmedierad fibringenerering är avgörande för trombbildning i denna procedur. Denna metod kan användas för att undersöka blodproppssammansättning och för att ytterligare studera trombolytiska behandlingar.Efter denna procedur kan andra metoder för trombolysbehandling tillämpas och den senare effekten bestämmas. Tillsats av trombin gör det möjligt att justera koagulationssammansättningen från fibrinfattig till fibrinrik, vilket gör det möjligt för forskare att utveckla kliniskt relevanta terapeutiska strategier.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Retrograd Lastning av nerver, skrifter och spinalrötterna med fluorescerande färgämnen

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Progenitor-härledda oligodendrocyt Kultur System från human fetal hjärna

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Härledning tidsförloppet för Glutamat Räkenskapsavslutning en Deconvolution Analys av astrocytisk Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

Med hjälp av 3D Printing Technology till Merge MRI med histologi: Ett protokoll för Brain sektionering

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Utvärdering av bioenergetisk Funktion i Cerebral vaskulära endotelceller

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Mäta synaptiskt vesikelprotein endocytos i odlade nervceller i hippocampus

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

En In Vivo -bedömning av blod - hjärnbarriären störningar i en råtta modell av ischemisk Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

En preklinisk modell för att bedöma hjärn återhämtning efter akut stroke hos råttor

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging och kvantifiering av snabba dendritiska grenen dynamik i utvecklingen Drosophila nervceller

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Konfokalmikroskopi för att mäta tre lägen för fusionspordynamik i binjurekromaffinceller

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...