Name: a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model
Uploaded: 2021-06-04T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibeleri (NS108763, NS100419, NS095064 ve HD080429'den C.Y.K.'ye; NS106592 Y.Y.S.'ye) desteklenmiştir.

Bu protokol, Virginia Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu takip eder. Şekil 1A , bu protokolün cerrahi prosedürlerinin sırasını özetlemektedir.
1. Ameliyat kurulumu
<ol><li>Ameliyattan en az 15 dakika önce küçük hayvan adaptörünün üzerine 37 °C sıcaklık ayarlı bir ısıtma pedi y...

<ol>
	<li>Lyden, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , (2015).</li><li>Linfante, I., Cipolla, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+reperfusion+therapies+in+the+era+of+mechanical+thrombectomy.">Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy.</a> Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).</li><li>Campbell, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endovascular+Therapy+for+Ischemic+stroke+with+perfusion-imaging+selection.">Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection.</a> The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).</li><li>Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+pathophysiologies+of+focal+brain+ischemia:+implications+for+translational+stroke+research.">The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).</li><li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats.">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li><li>Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+reproducible+brain+infarction+by+photochemically+initiated+thrombosis.">Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis.</a> Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).</li><li>Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+blood+flow+restoration+and+reperfusion+injury+after+ultraviolet+laser-facilitated+middle+cerebral+artery+recanalization+in+rat+thrombotic+stroke.">Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke.</a> Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).</li><li>Uzdensky, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photothrombotic+stroke+as+a+model+of+ischemic+stroke.">Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke.</a> Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).</li><li>Karatas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombotic+distal+middle+cerebral+artery+occlusion+produced+by+topical+FeCl(3)+application:+a+novel+model+suitable+for+intravital+microscopy+and+thrombolysis+studies.">Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+in+situ+thromboembolic+stroke+and+reperfusion.">Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion.</a> Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).</li><li>Orset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+Alteplase+in+a+mouse+model+of+acute+ischemic+stroke:+A+retrospective+pooled+analysis.">Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis.</a> Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).</li><li>Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+animal+model+of+cerebral+infarction.+Homologous+blood+clot+emboli+in+rats.">An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats.</a> Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).</li><li>Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+model+of+thromboembolic+stroke+and+rt-PA+induced+reperfusion+in+the+rat.">Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat.</a> Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).</li><li>Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Tenecteplase+with+Alteplase+on+clinical+rating+scores+following+small+clot+embolic+strokes+in+rabbits.">Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits.</a> Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergy+of+combined+tPA-Edaravone+therapy+in+experimental+thrombotic+stroke.">Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke.</a> PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Edaravone+prevents+transient+hypoxic-ischemic+brain+injury:+Implications+for+perioperative+neuroprotection.">Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection.</a> Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+mice+are+sensitive+to+hypoxia/ischemia-induced+stroke+but+respond+to+tissue-type+plasminogen+activator+treatment.">Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment.</a> Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).</li><li>Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thrombotic+stroke+model+based+on+transient+cerebral+hypoxia-ischemia.">A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).</li><li>Pena-Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+modulation+of+neutrophil+extracellular+traps+reverses+thrombotic+stroke+tPA+(tissue-type+plasminogen+activator)+resistance.">Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance.</a> Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).</li><li>Denorme, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ADAMTS13-mediated+thrombolysis+of+t-PA-resistant+occlusions+in+ischemic+stroke+in+mice.">ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice.</a> Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).</li><li>Marder, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thrombi+retrieved+from+cerebral+arteries+of+patients+with+acute+ischemic+stroke.">Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke.</a> Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).</li><li>Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+thrombi+retrieved+in+stroke+due+to+large+vessel+occlusion.">Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).</li><li>Sun, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+photothrombotic+stroke+model+with+an+increased+fibrin+content+and+improved+responses+to+tPA-lytic+treatment.">A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment.</a> Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).</li><li>Su, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+PDGF-CC+by+tissue+plasminogen+activator+impairs+blood-brain+barrier+integrity+during+ischemic+stroke.">Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke.</a> Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).</li><li>Gupta, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+gelsolin+in+acute+pulmonary+thromboembolism+and+thrombosis+in+the+carotid+artery+of+mice.">Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice.</a> PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).</li><li>Carroll, B. J., Piazza, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypercoagulable+states+in+arterial+and+venous+thrombosis:+When,+how,+and+who+to+test.">Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test.</a> Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).</li><li>Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenecteplase+for+the+treatment+of+acute+ischemic+stroke:+A+review+of+completed+and+ongoing+randomized+controlled+trials.">Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials.</a> International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).</li><li>McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+and+future+antiplatelet+therapies:+emphasis+on+preserving+haemostasis.">Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis.</a> Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).</li><li>Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+crculation+in+ischemic+stroke:+Assessment+tools+and+therapeutic+strategies.">Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies.</a> Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).</li><li>Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+etymology+of+the+collateral+circulation.">A brief etymology of the collateral circulation.</a> Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).</li></ol>

1985 yılında tanıtılan geleneksel RB fototrombotik inme, basit cerrahi prosedürler, düşük mortalite ve beyin enfarktüsünün yüksek tekrarlanabilirliği için çekici bir fokal serebral iskemi modelidir. 5 Bu modelde, fotodinamik boya RB, ışık uyarımı üzerine trombositleri hızla aktive eder ve kan damarını tıkayan yoğun agregalara yol açar 5,8,23. Bununla birlikte, RB ile indüklenen...

Endovasküler trombektomi ve tPA aracılı tromboliz, Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda ~ 700.000 hastayı etkileyen akut iskemik inmenin ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı iki tedavisidir1. Trombektomi uygulaması büyük damar tıkanıklığı (LVO) ile sınırlı olduğundan, tPA-tromboliz küçük damar tıkanıklıklarını hafifletebildiğinden, her ikisi de akut iskemik inme için değerli tedavilerdir2. Ayrıca, her iki tedavinin kombinasyonu (ör., inme başlangıcından sonraki 4.5 saat içinde tPA-trombolizin başlatılması, ardından trombektomi) reperfüzyonu ve fonksiyonel sonuçları iyileştirir3. Bu nedenle, trombolizi optimize etmek, trombektomi çağında bile inme araştırmaları için önemli bir hedef olmaya devam etmektedir.
Tromboembolik modeller, trombolitik tedavileri iyileştirmeyi amaçlayan klinik öncesi inme araştırmaları için önemli bir araçtır. Bunun nedeni, mekanik vasküler oklüzyon modellerinin (örneğin, intraluminal sütür MCA oklüzyonu) kan pıhtıları üretmemesi ve mekanik oklüzyonun çıkarılmasından sonra serebral kan akışının hızlı bir şekilde geri kazanılmasının aşırı derecede idealize edilmesidir 4,5. Bugüne kadar, başlıca tromboembolik modeller arasında fototromboz 6,7,8, topikal ferrik klorür (FeCl3) uygulaması9, MCA dalına trombin mikroenjeksiyonu10,11, MCA veya ortak karotis artere (CCA) ex vivo (mikro) emboli enjeksiyonu12,13,14 ve geçici hipoksi-iskemi (tHI)15,16, 17,18. Bu inme modelleri, takip eden pıhtıların histolojik bileşimi ve tPA aracılı litik tedavilere duyarlılık açısından farklılık gösterir (Tablo 1). Ayrıca kraniotominin cerrahi gereksinimi (in situ trombin enjeksiyonu ve FeCl3'ün topikal uygulaması için gereklidir), enfarktüs boyutunun ve yerinin tutarlılığı (ör., mikroembolinin CCA infüzyonu çok değişken sonuçlar verir) ve kardiyovasküler sistem üzerindeki küresel etkiler (örneğin, tHI, hipoksi kaynaklı periferik vazodilatasyonu telafi etmek için kalp atış hızını ve kalp debisini arttırır).
RB boya bazlı fototrombotik inme (PTS) modeli, basit kraniyotomi içermeyen cerrahi prosedürler, düşük mortalite (tipik olarak %5'<) ve öngörülebilir bir enfarktüs boyutu ve yeri (MCA sağlayan bölgede) dahil olmak üzere birçok çekici özelliğe sahiptir, ancak iki ana sınırlaması vardır. 8 İlk uyarı, aynı zamanda FeCl3 modeli 7,19,20'nin bir dezavantajı olan tPA aracılı trombolitik tedaviye zayıftan sıfıra yanıttır. PTS ve FeCl3 inme modellerinin ikinci uyarısı, takip eden trombüslerin az miktarda fibrin içeren yoğun paketlenmiş trombosit agregatlarından oluşmasıdır, bu sadece tPA-litik tedaviye karşı direncine yol açmakla kalmaz, aynı zamanda akut iskemik inme hastalarında karıştırılmış trombosit:fibrin trombüs modelinden de sapar21,22. Buna karşılık, in situ trombin-mikroenjeksiyon modeli esas olarak polimerize fibrin ve belirsiz bir trombosit içeriğiiçerir 10.
Yukarıdaki mantık göz önüne alındığında, inceltilmiş kafatası yoluyla MCA hedefli fotoaktivasyon için RB ve sub-trombotik trombin dozunun karışımının, ortaya çıkan trombüsteki fibrin bileşenini artırabileceğini ve tPA aracılı litik tedaviye duyarlılığı artırabileceğini varsaydık. Bu hipotezi doğruladık,23 ve burada modifiye (T+RB) fototrombotik inme modelinin ayrıntılı prosedürlerini açıklıyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8877</td>
			<td>infarct</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon monofilament suture</td>
			<td>LOOK</td>
			<td>766B</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 silk suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>624143</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>543nm laser beam</td>
			<td>Melles Griot</td>
			<td>25-LGP-193-249</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adult male mice</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>10~14 weeks old (22~30 g)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia bar for mouse adaptor</td>
			<td>machine shop, UVA</td>
			<td></td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td>euthanasia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental drill</td>
			<td>Dentamerica</td>
			<td>Rotex 782</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital microscope</td>
			<td>Dino-Lite</td>
			<td>AM2111</td>
			<td>brain imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ40</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (serrated)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11370-31</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine curved forceps (smooth)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11373-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti-rabbit Alexa Fluro 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsted-Mosquito hemostats</td>
			<td>FST</td>
			<td>13008-12</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat pump with warming pad</td>
			<td>Gaymar</td>
			<td>TP700</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>200</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringe with 31G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>328291</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser protective google 532nm</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>LG3</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meloxicam SR</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>NSAID analgesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro needle holders</td>
			<td>FST</td>
			<td>12060-01</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>surgical instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoorFLPI-2 blood flow imager</td>
			<td>Moor</td>
			<td>780-nm laser source</td>
			<td>Laser Speckle Contrast Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse adaptor</td>
			<td>RWD</td>
			<td>68014</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet ointment</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC0138063</td>
			<td>eye dryness prevention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retractor tips</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>Surgi-5014-2</td>
			<td>surgical setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>198250</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7513</td>
			<td>photothrombosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue glue</td>
			<td>Abbott Laboratories</td>
			<td>NC9855218</td>
			<td>surgical supplies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tPA</td>
			<td>Genetech</td>
			<td>Cathflo activase 2mg</td>
			<td>thrombolytic treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51425</td>
			<td>TTC infacrt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>CCM, UVA</td>
			<td></td>
			<td>anesthesia</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a fibrin-enriched and tpa-sensitive photothrombotic stroke model

İdeal bir tromboembolik inme modeli, düşük mortaliteye sahip nispeten basit cerrahi prosedürler, tutarlı bir enfarktüs boyutu ve yeri, trombositin çökelmesi: hastalardakine benzer fibrin karışımlı kan pıhtıları ve fibrinolitik tedaviye yeterli duyarlılık gibi belirli özellikler gerektirir. Gül bengal (RB) boya bazlı fototrombotik inme modeli ilk iki gereksinimi karşılar, ancak muhtemelen trombosit açısından zengin, ancak fibrin açısından fakir pıhtı bileşimi nedeniyle tPA aracılı litik tedaviye oldukça dirençlidir. Orta serebral arterin (MCA) proksimal dalına yönelik fotoaktivasyon için RB boyası (50 mg/kg) ve subtrombotik trombin dozu (80 U/kg) kombinasyonunun fibrin ile zenginleştirilmiş ve tPA'ya duyarlı pıhtılar üretebileceğini düşünüyoruz. Gerçekten de, trombin ve RB (T + RB) kombine fototromboz modeli, immün boyama ve immünoblotlarla gösterildiği gibi karışık trombosit: fibrin kan pıhtılarını tetikledi ve tutarlı enfarktüs boyutları ve konumları ile düşük mortaliteyi korudu. Ayrıca, fotoaktivasyondan sonraki 2 saat içinde intravenöz tPA (Alteplaz, 10 mg/kg) enjeksiyonu, T+RB fototrombozunda enfarktüs boyutunu önemli ölçüde azalttı. Bu nedenle, trombin ile zenginleştirilmiş fototrombotik inme modeli, yeni trombolitik tedavileri test etmek için yararlı bir deneysel model olabilir.

İlk olarak, RB ile T + RB fototrombozunun neden olduğu kan pıhtılarındaki fibrin içeriğini karşılaştırdık. Fareler, fotoaktivasyondan 2 saat sonra fiksatiflerin transkardiyal perfüzyonu ile sakrifiye edildi ve uzunlamasına ve enine düzlemlerde MCA dalının immünofloresan boyanması için beyinler çıkarıldı. RB fototrombozunda, MCA dalı yoğun olarak CD41+ trombositler ve az miktarda fibrin ile doluydu (Şekil 2A,C). Buna karşılık, T+RB fot...

Watch this Scientific Journal Video about A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model at JoVE.com

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

Geleneksel fototrombotik inme (PTS) modelleri esas olarak doku plazminojen aktivatörü (tPA) litik tedavisine karşı yüksek dirençli yoğun trombosit agregatlarını indükler. Burada, fotoaktivasyon için trombin ve ışığa duyarlı boyanın birlikte enjekte edilmesiyle modifiye edilmiş bir murin PTS modeli tanıtıldı. Trombin ile zenginleştirilmiş PTS modeli, karışık trombosit:fibrin pıhtıları üretir ve tPA-trombolizine karşı oldukça hassastır.

Fibrin ile zenginleştirilmiş ve tPA'ya duyarlı fototrombotik inme modeli

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

Hasta örneklerine benzer kan pıhtısı üreten ve klinik ilgili trombolitik tedaviye yanıt veren bir inme modeli oluşturmak istiyoruz. Bu nedenle, klasik fototrombotik inme modelini değiştiriyoruz ve fotoaktivasyondan önce trombin ve fotodinamik boya gül bengalini karıştırıyoruz. Bu prosedürün gerçekten de tPA aracılı tromboliz için oldukça hassas olan kan pıhtısı oluşturmasından memnunuz.Bu modifiye fototrombotik inme modeli, düşük mortalite oranına sahip çok basit cerrahi prosedürler kullanır ve oldukça tutarlı bir enfarktüs boyutu ve konumu üretir. Ayrıca akut inme hastasındakine benzer bir fibrin ve trombosit karışık kan pıhtısı üretirsiniz. Bu nedenle, daha etkili trombolitik tedaviler geliştirmek için klinik öncesi inme araştırmaları için oldukça yararlı olduğunu düşünüyoruz.Modelimizi daha fazla insanın kullanmasını umuyoruz. Prosedürü gösteren, grubumuzdaki araştırma görevlisi doçentimiz Dr.Yu-Yo Sun olacaktır. Ameliyattan 30 dakika önce, bir analjezik enjekte ederek fareyi hazırlayın.Fareyi uyuşturduktan sonra, tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için ayak parmağınızı sıkıştırın. Daha sonra sol boyun ve baştaki tüyleri tüy dökücü kremle alın. Fareyi sırtüstü pozisyonda küçük hayvan adaptörünün üzerine yerleştirin ve cerrahi cilt bölgesini üç alternatif povidon iyot ve %70 etanol ile silerek sterilize edin.Diseksiyon mikroskobu altında, orta hattın yaklaşık 0,2 santimetre lateralinde bir çift mikro makas ve düz forseps kullanarak 0,5 santimetre sol servikal kesi yapın. Daha sonra, bir çift ince tırtıklı forseps kullanarak, LCCA'yı ortaya çıkarmak için yumuşak dokuyu ve fasyayı ayırın. Daha sonra bir çift ince pürüzsüz forseps kullanarak, LCCA'yı vagal sinirden dikkatlice ayırın.5-0 ipek sütür kullanarak LCCA'nın etrafına kalıcı bir çift düğümlü sütür yerleştirin. Fareyi yüzüstü konuma çevirin ve burun klipsi rulosunu 15 derece döndürün. Daha sonra cildi üç alternatif Betadine ve% 70 etanol ile silerek cerrahi alanı sterilize edin.Temporalis kasını ortaya çıkarmak için sol göz ve kulak boyunca bir çift mikro makas ve düz forseps kullanarak kafa derisinde 0,8 santimetrelik bir kesi yapın. Daha sonra, sol parietal kemikteki temporalis kasının kenarı boyunca 0,5 santimetrelik bir kesi yapın. Daha sonra temporalis kası üzerinde 0.3 santimetrelik ikinci bir dikey kesi yapın ve parietal kemiğin ve skuamöz kemiğin kenarını ortaya çıkarmak için kası geri çekin.Frontal ve parietal kemikler arasındaki koronal sütürün dönüm noktasını görselleştirdiğinizden emin olun. Daha sonra, sol MCA'yı ortaya çıkarmak için steril salin uygulayarak kafatasını nemlendirin ve skuamöz kemik üzerindeki proksimal MCA dalını bir işaretleyici ile işaretleyin. Pnömatik bir diş matkabı ile bu işaretli alanı çevreleyen bir milimetre çapında bir daireyi yavaşça çizin.Ardından, alt duraya dokunmadan kafatasını yaklaşık 0,2 milimetre derinliğinde inceltin. Çok ince bir kemik tabakası kaldığında delmeyi durdurun. Daha sonra, farenin vücut ağırlığına göre trombin ve gül bengal çözeltisini karıştırın ve karışımı 31 gauge iğne ile retro-orbital sinüse yavaşça enjekte edin.Kuruluğu önlemek için her iki göze de göz merhemi sürün. Aydınlatıcıyı 532 nanometre lazer ışığıyla delinmiş alana 20 dakika boyunca iki inçlik bir mesafede uygulayın. Lazer projeksiyon gözlükleri ile MCA'nın proksimal dalındaki aydınlatmayı görselleştirin.20 dakika sonra lazer aydınlatmasını durdurun. Kafatasının parietal kemiği üzerinde üç milimetre çapında bir kafatası penceresi yapın ve üzerine bir kapak camı yerleştirin. Ardından distal MCA'yı 20x suya daldırma objektif merceğinin altına yerleştirin.Görüntülemeden beş dakika önce DyLight 488 konjuge anti-GP1b-beta antikorunun kuyruk damarı enjeksiyonu ile dolaşımdaki trombositi etiketleyin. Daha sonra retro-orbital olarak trombin ve gül bengal çözeltisi karışımını enjekte edin. 10 mikrometre çapında bir lazer ışını ile 532 nanometre lazer sistemi kullanarak MCA'yı fotoaktif hale getirin ve görüntüyü trombüs oluşana kadar kaydedin.TPA uygulaması için, anestezi uygulanmış hayvanı 37 santigrat derece ılık bir ped üzerine yerleştirin. Kuyruğunu, seçilen fotoaktivasyon sonrası zaman noktasında bir dakika boyunca 45 santigrat derece ılık ıslak gazlı bezle sarın. Daha sonra, rekombinant insan tPA'sını kuyruk damarından enjekte edin.%50'sini bolus olarak enjekte edin ve kalan %50'yi bir infüzyon pompası kullanarak 30 dakika boyunca demleyin. Serebral kan akışını izlemek için, kafatası açıkta kalacak şekilde kafa derisinde orta hat kesisi yapın. Kafatasını steril tuzlu suyla nemlendirin ve üzerine ultrason jelini nazikçe uygulayın, jelde saç veya hava kabarcıkları olmadığından emin olun.Lazer benek kontrast görüntüleyici altında her iki serebral hemisferdeki serebral kan akışını 10 dakika boyunca izleyin. İmmünofloresan etiketleme, gül bengal boyası bazlı fototrombozda, MCA dalının CD41 pozitif trombositler ve az miktarda fibrin ile yoğun bir şekilde paketlendiğini göstermektedir. Buna karşılık, trombin artı gül bengal fototrombozunda, MCA dalı rastgele karışık trombosit ve fibrin pıhtıları ile tıkandı.İmmünoblotlama analizi, trombin artı gül bengal fototrombozunda ipsilateral hemisferde fibrin birikiminde tek başına gül bengal'e kıyasla iki kattan fazla bir artış gösterdi. Konfokal mikroskop tabanlı intravital görüntüleme, intravenöz trombin enjeksiyonunun lazer aydınlatması altında bile trombosit agregatlarını indükleyemediğini gösterdi. Trombositler, gül bengal fototrombozu modelinde homojen pıhtılar oluştururken, trombin artı gül bengal modelinde çok sayıda soluk bölgeye sahip düzensiz agregalar oluşturdu.Aynı farenin tPA öncesi ve sonrası 24 saat içinde araç tedavisine karşı CBF'si, lazer benek kontrast görüntüleme ile ölçüldü ve kontralateral hemisfere normalize edildi. Gül bengal fototrombozunda, tPA tedavisi, özellikle iskemik sınır bölgesinde, araçla tedavi edilen farelere kıyasla CBF iyileşme eğilimine yol açtı. Trombin artı gül bengal fototrombozunda, tPA ile tedavi edilen farelerde CBF'nin iyileşmesi daha belirgindi ve proksimal MCA dalları genellikle 24 saatte görünür hale geldi.Gül bengal fototrombozunda, araçla tedavi edilen ve tPA ile tedavi edilen farelerde benzer bir enfarktüs boyutu tespit edildi. Buna karşılık, trombin artı gül bengal fototrombozunda, tPA litik tedavisi, araçla tedavi edilen farelere kıyasla fotoaktivasyondan altı saat sonra 0.5, bir veya iki saatte enfarktüsü önemli ölçüde azalttı, Trombin aracılı fibrin üretimi bu prosedürde trombüs oluşumu için çok önemlidir. Bu yöntem, pıhtı kompozisyonunu araştırmak ve trombolitik tedavileri daha fazla incelemek için kullanılabilir.Bu işlemi takiben, tromboliz tedavisinin diğer yöntemleri uygulanabilir ve daha sonra etkinliği belirlenebilir. Trombin eklenmesi, pıhtı kompozisyonunu fibrin açısından fakirden fibrin fakirine ayarlamayı mümkün kılar ve araştırmacıların klinik olarak ilgili terapötik stratejiler geliştirmelerine olanak tanır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Sinirler, yolları ve Floresan Boyalar ile Spinal Roots Retrograd Yükleniyor

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

Astrositik Transporter Akımlar bir Dekonvolüsyon Analizi ile Glutamat Gümrükleme gün Dersin türetilmesi

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Utilizing 3D Printing Technology to Merge MRI with Histology: A Protocol for Brain Sectioning

3D Baskı Teknolojisini kullanan Histoloji ile MRG Birleştirme: Beyin için Protokol Kesit

Magnetic resonance imaging (MRI) allows for the delineation between normal and abnormal tissue on a macroscopic scale, sampling an entire tissue volume ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Kan - beyin bariyerini bozulma iskemik inme, bir fare modeli Vivo içinde değerlendirilmesi

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

A Preclinical Model to Assess Brain Recovery After Acute Stroke in Rats

Sıçanlarda Akut İnme Sonrası Beyin İyileşmesini Değerlendiren Bir Preklinik Model

The purpose of this study was to establish and validate an animal brain ischemia model in the recovery and sequela stages. A middle cerebral artery ...

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Drosophila Nöronlarının Geliştirilmesinde Hızlı Dendritik Dal Dinamiğinin Hızlandırılmış Canlı Görüntüleme ve Nicelleştirilmesi

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Confocal Microscopy to Measure Three Modes of Fusion Pore Dynamics in Adrenal Chromaffin Cells

Adrenal Kromafin Hücrelerinde Üç Füzyon Gözenek Dinamiği Modunu Ölçmek için Konfokal Mikroskopi

Dynamic fusion pore opening and closure mediate exocytosis and endocytosis and determine their kinetics. Here, it is demonstrated in detail how confocal ...