Name: visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing
Uploaded: 2021-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

Denne undersøgelse blev støttet af projektet national key R&d Program of China (Project Code no. 2019YFC1709103; no. 2018YFC1707804) og National Natural Science Foundation of China (Project Code no. 81774211; nr. 81774432; nr. 81801561).

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité ved Institute of Akupunktur og Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referencenummer D2018-09-29-1). Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for care and use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Tolv voksne Sprague-Dawley hanrotter (vægt 220 ± 20 g) blev anvendt i denne undersøgelse. Dyr [licensnummer SCXK (JING) 2017-0005] blev leveret af National Institutes for ...

<ol>
	<li>Kekere, V., Alsayouri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Head+and+Neck,+Dura+Mater.">Anatomy, Head and Neck, Dura Mater.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+origin+of+TRPV1+receptor-containing+nerve+fibers+in+the+dura+mater+of+rat.">Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat.</a> Brain Research. 1173, 84-91 (2007).</li><li>Jacobs, B., Dussor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+contributions+to+migraine:+moving+beyond+vasodilation.">Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation.</a> Neuroscience. 338, 130-144 (2016).</li><li>Dodick, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase-by-phase+review+of+migraine+pathophysiology.">A phase-by-phase review of migraine pathophysiology.</a> Headache. 58, 4-16 (2018).</li><li>Amin, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+pathophysiological+mechanisms+of+migraine+attacks+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-38.">Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38.</a> Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).</li><li>Keller, J. T., Marfurt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidergic+and+serotoninergic+innervation+of+the+rat+dura+mater.">Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).</li><li>Messlinger, K., Hanesch, U., Baumg&#228;rtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+the+dura+mater+encephali+of+cat+and+rat:+ultrastructure+and+calcitonin+gene-related+peptide-like+and+substance+P-like+immunoreactivity.">Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity.</a> Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).</li><li>Lennerz, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor-like+receptor+(CLR),+receptor+activity-modifying+protein+1+(RAMP1),+and+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+immunoreactivity+in+the+rat+trigeminovascular+system:+differences+between+peripheral+and+central+CGRP+receptor+distribution.">Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).</li><li>Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+nerve+fibers+storing+CGRP+and+CGRP+receptors+in+the+peripheral+trigeminovascular+system.">Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system.</a> The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).</li><li>Xu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+distribution+of+blood+vessels+and+nerve+fibers+in+the+skin+tissues+of+acupoint+"Taichong"+(LR3)+in+the+rat.">Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat.</a> Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).</li><li>Cui, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+calcitonin+gene-related+peptide+on+the+neurons+associated+Zusanli+(ST+36)+in+rats.">The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+fibres+and+their+terminals+of+the+dura+mater+encephali+of+the+rat.">Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat.</a> Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).</li><li>Leng, C., Chen, L., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+P2X1-6+receptor+expression+in+retrograde+Fluorogold-labeled+DRG+neurons+from+rat+chronic+neuropathic+pain+model.">Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model.</a> Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).</li><li>Huang, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold+in+an+animal+optic+nerve+crush+model.">Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model.</a> Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).</li><li>Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+protective+effect+of+local+administration+of+triamcinolone+or+systemic+treatment+with+methylprednisolone+against+damages+caused+by+optic+nerve+crush+in+rats.">Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).</li><li>Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+recombinant+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+(G-CSF)+in+neurodegeneration+after+optic+nerve+crush+in+rats.">Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).</li><li>Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcitonin+gene-related+peptide+in+peripheral+and+central+pain+mechanisms+including+migraine.">The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine.</a> Pain. 158 (4), 543-559 (2017).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Kou, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+neural+circuits+from+peripheral+afferents+to+the+spinal+cord:+possible+implications+for+diabetic+polyneuropathy+in+streptozotocin-induced+type+1+diabetic+rats.">Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).</li><li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+express+&#945;-smooth+muscle+actin,+which+requires+prevention+of+filamentous-actin+depolymerization+for+detection.">Capillary pericytes express &#945;-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection.</a> eLife. 7, 34861 (2018).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+sensory+innervation+of+the+rat+superior+sagittal+sinus.">Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus.</a> Neuroscience. 129, 431-437 (2004).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+the+sensory+innervation+of+the+rat+middle+meningeal+artery.">Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery.</a> Brain Research. 1208, 103-110 (2008).</li><li>Schmued, L. C., Fallon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Gold:+a+new+fluorescent+retrograde+axonal+tracer+with+numerous+unique+properties.">Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties.</a> Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).</li></ol>

I denne undersøgelse har vi med succes demonstreret distributionen og oprindelsen af CGRP-immunoreaktive nervefibre i kraniedura mater ved hjælp af immunfluorescens, 3D-rekonstruktion og neurale sporingsmetoder med CGRP-antistof og FG neurale sporstof, hvilket giver de histologiske og kemiske beviser for bedre at forstå det durale neurovaskulære netværk.
Som det var kendt, CGRP spiller en kritisk rolle i patogenese af migræne4,17...

Den kraniale dura mater er det yderste lag af meninges for at beskytte hjernen og indeholder rigelige blodkar og forskellige former for nervefibre1,2. Mange undersøgelser har vist, at sensibiliseret kraniedura mater kan være den nøglefaktor, der fører til forekomsten af hovedpine, der involverer den unormale vasodilation og innervation3,4,5. Således er kendskabet til neurovaskulær struktur i kraniedura mater vigtig for at forstå patogenese af hovedpine, især for migræne.
Selv om dura innervation tidligere er blevet undersøgt med den konventionelle immunohistochemistry, den rumlige korrelation af nervefibre og blodkar i kraniet dura mater var mindre undersøgt6,7,8,9. For at afsløre den durale neurovaskulære struktur mere detaljeret blev calcitonin genrelateret peptid (CGRP) og falloidin valgt som markører for henholdsvis farvning af duralnervefibre og blodkar i hele monteret kranie dura mater med immunfluorescens og fluorescerende histokemi10. Det kan være et optimalt valg at opnå en tredimensionel (3D) visning af neurovaskulær struktur. Derudover blev fluorogold (FG) anvendt på området omkring midterste meningeal arterie (MMA) i kraniet dura mater at bestemme oprindelsen af CGRP-immunoreaktive nervefibre, og spores til trigeminus ganglion (TG) og livmoderhalskræft (C) dorsal rod ganglier (DRGs), mens FG-mærkede neuroner blev undersøgt yderligere sammen med CGRP ved hjælp af immunofluorescens.
Formålet med denne undersøgelse var at tilvejebringe et effektivt redskab til undersøgelse af den neurovaskulære struktur i kraniedura mater for CGRP-immunoreaktiv innervation og dens oprindelse. Ved at drage fordel af den gennemsigtige helmonteringsdura mater og kombinere immunfluorescens, retrograd sporing, konfokale teknikker og 3D-rekonstruktion forventede vi at præsentere et nyt 3D-billede af den neurovaskulære struktur i kraniedura mater. Disse metodologiske tilgange kan yderligere serveres til at udforske patogenese af forskellige hovedpiner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Protect from light; RRID: AB_141607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain stereotaxis instrument</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Dimension</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 1.1</td>
			<td>Software of fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogold (FG)</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>52-9400</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Microm International&#160;GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FV10-ASW 4.2a</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td>Confocal image processing software system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill</td>
			<td>Saeyang Microtech</td>
			<td>Marathon-N7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CGRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81887</td>
			<td>RRID: AB_1658411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 568</td>
			<td>Molecular&#160;Probes</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop and&#160; Illustration</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>CS6</td>
			<td>Photo editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- Fluorogold</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab153</td>
			<td>RRID: AB_90738</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>National Institutes for Food and Drug Control</td>
			<td>SCXK (JING) 2014-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>#4951PLUS-001</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge fordelingen og oprindelsen af calcitonin genrelateret peptid (CGRP)-immunoreaktive sensoriske nervefibre af kraniet dura mater ved hjælp af immunfluorescens, tre-dimensionel (3D) genopbygning og retrograd sporing teknik. Her blev nervefibrene og blodkarrene farvet ved hjælp af immunfluorescens og histokemiteknikker med henholdsvis CGRP og fluorescerende falloidin. Den rumlige korrelation mellem dural CGRP-immuoreaktive nervefibre og blodkar blev demonstreret ved 3D-rekonstruktion. I mellemtiden blev oprindelsen af CGRP-immunoreaktive nervefibre opdaget ved neural sporingsteknik med fluorogold (FG) fra området omkring mellempulsåren (MMA) i kraniedura mater til trigeminal ganglion (TG) og cervikal (C) dorsal rod ganglier (DRGs). Desuden blev de kemiske egenskaber ved FG-mærkede neuroner i TG og DRGs også undersøgt sammen med CGRP ved hjælp af dobbelt immunfluorescens. Ved at drage fordel af den gennemsigtige helmonteringsprøve og 3D-rekonstruktion blev det påvist, at CGRP-immunoreaktive nervefibre og falloidinmærkede arterioler løber sammen eller danner et dural neurovaskulært netværk i 3D-visning, mens FG-mærkede neuroner blev fundet i oftalmiske, maxillary, og mandibulære grene af TG, samt C2-3 DRGs ipsilateral til siden af sporstof ansøgning, hvor nogle af FG-mærkede neuroner præsenteret med CGRP-immunoreaktive udtryk. Med disse tilgange demonstrerede vi de fordelingsmæssige egenskaber ved CGRP-immunoreaktive nervefibre omkring blodkarrene i kraniedura mater samt oprindelsen af disse nervefibre fra TG og DRGs. Set ud fra et metodeperspektiv kan det give en værdifuld reference til forståelse af den komplicerede neurovaskulære struktur af kraniedura mater under den fysiologiske eller patologiske tilstand.

Neurovaskulær struktur af kraniedura mater Efter immunfluorescerende og fluorescerende histokemisk farvning med CGRP og falloidin blev CGRP-immunoreaktive nervefibre og falloidinmærkede duralarterioler og bindevæv tydeligt demonstreret i hele monterings kraniedura mater i et 3D-mønster (Figur 2C,D, E, F). Det blev vist, at både tykke og tynde CGRP-immunoreaktive nervefibre løber parallelt med duralarterilerne, omkrin...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

Her præsenterer vi en protokol til visualisering af rumlig korrelation af calcitonin genrelateret peptid (CGRP)-immunoreaktive nervefibre og blodkar i kraniedura mater ved hjælp af immunfluorescens og fluorescerende histokemi med henholdsvis CGRP og falloidin. Derudover var oprindelsen af disse nervefibre retrograd spores med en fluorescerende neurale sporstof.

Visualisering af Calcitonin Gene-Related Peptid Immunoreactive Innervation af Rat Cranial Dura Mater med immunfluorescens og neural sporing

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...

Denne protokol kan give en variabel metodologisk reference til forståelse af kraniedura materens komplicerede neurovaskulære struktur med hensyn til fysiologisk eller patologisk tilstand. Drage fordel af gennemsigtige hele mount dura mater, den spacial korrelation af dural CGRP immunoreaktive nervefibre og blodkar kan påvises i en 3D-visning. Efter aflivning af en rotte perfunderede den transcardialt med 100 milliliter 0,9% normal saltvand efterfulgt af 250 til 300 milliliter 4%paraformaldehyd i 0,1 molarphosphatbuffer.Når du er færdig, skal du fjerne hovedhuden og åbne kraniet for at udsætte dura mater og dorsal side af hjernen. Dissekere kranie dura mater langs hjernestammen til olfaktoriske pære i en hel mount mønster. Cranial dura mater skylles i 0,1 molarphosphatbuffer i ca. et minut, og den inkuberes i en blokeringsopløsning.Overfør dura mater i mus anti-CGRP antistof natten. Den følgende dag vaskes dura mater tre gange i 0,1 molarphosphatbuffer. Dura mater inkuberes i en blandet opløsning af æselantimusen Alexa Fluor 488 sekundært antistof og falloidin 568 i 0,1.Molarphosphatbuffer indeholdende 1%normalt æselserum og 0,5%Triton X-100 i 1,5 timer ved stuetemperatur. Vask derefter dura mater tre gange i 0,1 molarphosphatbuffer, trim kanterne og monter den på mikroskopdias. Sæt på dæksedler med 50% glycerin før observation.Billede hele mount dura mater med en fluorescerende mikroskop, derefter tage billeder af CGRP immunoreaktive nervefibre og falloidin-mærkede blodkar i dura mater ved hjælp af en konfokal mikroskop. Barber rottens hoved med en elektrisk barbermaskine, læg derefter stumpe ørestænger til rotten og læg det på den stereotaxiske enhed. Placer mundholderen, og påfør oftalmisk salve på øjnene.Rengør den kirurgiske side af hovedhuden ved hjælp af 75% ethanol og lav et snit langs midterlinjen i hovedbunden. Fjern periosteum og muskelvæv væk fra kraniet ved hjælp af sterile bomuldsspidsapplikatorer. Bor et lille hul ved hjælp af en burr boremaskine med en rund spids smule på venstre parietal og tidsmæssige knogler over den midterste meningeal arterie.Byg en bank rundt om hullet med dental silikat cement og tilsæt to mikroliter fluorogold i hullet omkring den midterste meningeal arterie med en 10 mikroliter microsyringe. Dæk hullet med et lille stykke hemostatisk svamp. Sæt et stykke paraffinfilm på hullet og forsegle kanterne med knoglevoks.Sutur såret med steril tråd. Hold rotterne i et varmt område, indtil de er helt kommet sig. Så returnere rotterne tilbage til deres bure.Efter syv overlevelsesdage, perfuse disse rotter med 0,9% normal saltvand efterfulgt af 4%paraformaldehyd i 0,1 molar fosfat buffer. Dissekere TG og livmoderhalskræft en til fire DRGs, derefter skære dem på tykkelsen af 30 mikrometer på en kryostat mikrotom system i sagittal retning. Og montere sektioner på silane belagt glas dias.Cirkel sektionerne med en histokemisk pen og inkuber dem i 30 minutter i blokeringsopløsning. Prøverne overføres til opløsningen af kaninantifluororgold og mus anti-CGRP antistof og inkuberes ved fire grader Celsius natten over. Den næste dag vaskes sektionerne tre gange i 0,1 molarphosphatbuffer.Inkuber de vaskede sektioner i en blandet opløsning af æsel anti-kanin Alexa Fluor 594 og æsel anti-mus Alexa Fluor 488 sekundære antistof. Vask dem derefter tre gange i 0,1 molarphosphatbuffer og påfør dæksedler med 50% glycerin til observation. Tag billeder af fluorogold mærket neuroner i TG og DRGs under UV-belysning ved hjælp af et fluorescerende mikroskop.Derefter fange billeder af fluorogold og CGRP mærket neuroner i TG og DRGs. Efter immunfluorescerende og fluorescerende histokemisk farvning med CGRP og falloidin, CGRP immunoreaktive nervefibre og falloidin mærket dural arterioler og bindevæv blev tydeligt visualiseret i hele mount kranie dura mater i et 3D-mønster. Både tykke og tynde CGRP immunoreaktive nervefibre løber parallelt med duralarterierne omkring den vaskulære væg eller mellem blodkarrene.Syv dage efter fluorogold ansøgning om regionen i den midterste meningeal arterie og rotte kranial dura mater, fluorogold mærket neuroner blev påvist i TG og livmoderhalskræft DRGs på ipsilateral side af sporstof ansøgning, som blev direkte observeret under UV-belysning af fluorescerende mikroskopi. Fluorogold mærket neuroner blev fundet i alle tre grene af TG, med højere koncentrationer på oftalmiske og maxillary divisioner og med lavere koncentrationer på mandibular division. Nogle af de fluorogold mærket neuroner blev også observeret i livmoderhalskræft to til tre DRGs.Disse dobbelte immunfluorescences repræsentative fotografier viser sensoriske neuroner i TG og DRG. De mærkede neuroner med FG, CGRP, og både FG og CGRP blev visualiseret af dobbelt immunfluorescens. Når du forsøger denne protokol, skal du huske at dissekere den kraniale dura mater helt og indsætte den på et dias i et helt monteringsmønster.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Investigating the Neural Mechanisms of Aware and Unaware Fear Memory with fMRI

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optisk registrering af suprathreshold neurale aktivitet med enkelt-celle-og single-spike opløsning

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Viral Sporing af genetisk Defineret neurale kredsløb

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic forstyrrelse af neurale aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Betinget Genetisk transsynaptisk sporing i den embryoniske musehjerne

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsafhængig stigning i netværksresponset til stimulering af neuronale cellekulturer på mikroelektrodearrayer

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

Forbedring af anvendelsen af høj molekylvægt Biotinylated Dextran Amin for Thalamocortical projektion sporing i rotter

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Samtidige optagelser af kortikale lokale felt potentialer, elektrokardiogram, Electromyogram og vejrtrækning rytmen fra en frit bevægende rotte

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Påvisning af 5-Hydroxymethylcytosin i neurale stamceller og hjerner af mus

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...