Name: visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing
Uploaded: 2021-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

Deze studie werd ondersteund door het project van national key R&d program of China (projectcode nr. 2019YFC1709103; nr. 2018YFC1707804) en National Natural Science Foundation of China (projectcode nr. 81774211; nr. 81774432; nr. 81801561).

Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referentienummer D2018-09-29-1). Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Twaalf volwassen Sprague-Dawley mannelijke ratten (gewicht 220 ± 20 g) werden gebruikt in deze studie. Dieren [licentienummer SCXK (JING) 2017-0005] werde...

<ol>
	<li>Kekere, V., Alsayouri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Head+and+Neck,+Dura+Mater.">Anatomy, Head and Neck, Dura Mater.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+origin+of+TRPV1+receptor-containing+nerve+fibers+in+the+dura+mater+of+rat.">Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat.</a> Brain Research. 1173, 84-91 (2007).</li><li>Jacobs, B., Dussor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+contributions+to+migraine:+moving+beyond+vasodilation.">Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation.</a> Neuroscience. 338, 130-144 (2016).</li><li>Dodick, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase-by-phase+review+of+migraine+pathophysiology.">A phase-by-phase review of migraine pathophysiology.</a> Headache. 58, 4-16 (2018).</li><li>Amin, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+pathophysiological+mechanisms+of+migraine+attacks+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-38.">Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38.</a> Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).</li><li>Keller, J. T., Marfurt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidergic+and+serotoninergic+innervation+of+the+rat+dura+mater.">Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).</li><li>Messlinger, K., Hanesch, U., Baumg&#228;rtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+the+dura+mater+encephali+of+cat+and+rat:+ultrastructure+and+calcitonin+gene-related+peptide-like+and+substance+P-like+immunoreactivity.">Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity.</a> Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).</li><li>Lennerz, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor-like+receptor+(CLR),+receptor+activity-modifying+protein+1+(RAMP1),+and+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+immunoreactivity+in+the+rat+trigeminovascular+system:+differences+between+peripheral+and+central+CGRP+receptor+distribution.">Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).</li><li>Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+nerve+fibers+storing+CGRP+and+CGRP+receptors+in+the+peripheral+trigeminovascular+system.">Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system.</a> The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).</li><li>Xu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+distribution+of+blood+vessels+and+nerve+fibers+in+the+skin+tissues+of+acupoint+"Taichong"+(LR3)+in+the+rat.">Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat.</a> Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).</li><li>Cui, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+calcitonin+gene-related+peptide+on+the+neurons+associated+Zusanli+(ST+36)+in+rats.">The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+fibres+and+their+terminals+of+the+dura+mater+encephali+of+the+rat.">Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat.</a> Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).</li><li>Leng, C., Chen, L., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+P2X1-6+receptor+expression+in+retrograde+Fluorogold-labeled+DRG+neurons+from+rat+chronic+neuropathic+pain+model.">Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model.</a> Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).</li><li>Huang, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold+in+an+animal+optic+nerve+crush+model.">Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model.</a> Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).</li><li>Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+protective+effect+of+local+administration+of+triamcinolone+or+systemic+treatment+with+methylprednisolone+against+damages+caused+by+optic+nerve+crush+in+rats.">Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).</li><li>Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+recombinant+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+(G-CSF)+in+neurodegeneration+after+optic+nerve+crush+in+rats.">Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).</li><li>Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcitonin+gene-related+peptide+in+peripheral+and+central+pain+mechanisms+including+migraine.">The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine.</a> Pain. 158 (4), 543-559 (2017).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Kou, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+neural+circuits+from+peripheral+afferents+to+the+spinal+cord:+possible+implications+for+diabetic+polyneuropathy+in+streptozotocin-induced+type+1+diabetic+rats.">Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).</li><li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+express+&#945;-smooth+muscle+actin,+which+requires+prevention+of+filamentous-actin+depolymerization+for+detection.">Capillary pericytes express &#945;-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection.</a> eLife. 7, 34861 (2018).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+sensory+innervation+of+the+rat+superior+sagittal+sinus.">Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus.</a> Neuroscience. 129, 431-437 (2004).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+the+sensory+innervation+of+the+rat+middle+meningeal+artery.">Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery.</a> Brain Research. 1208, 103-110 (2008).</li><li>Schmued, L. C., Fallon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Gold:+a+new+fluorescent+retrograde+axonal+tracer+with+numerous+unique+properties.">Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties.</a> Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).</li></ol>

In deze studie hebben we met succes de distributie en de oorsprong van CGRP-immunoreactieve zenuwvezels in de craniale dura mater aangetoond met behulp van immunofluorescentie, 3D-reconstructie en neurale tracing-benaderingen met CGRP-antilichaam en FG neurale tracer, die de histologische en chemische bewijzen leveren om het auditieve neurovasculaire netwerk beter te begrijpen.
Zoals bekend speelt CGRP een cruciale rol bij de pathogenese van migraine4,<sup cl...

De craniale dura mater is de buitenste laag van hersenvliezen om de hersenen te beschermen en bevat overvloedige bloedvaten en verschillende soorten zenuwvezels1,2. Vele studies hebben aangetoond dat gesensibiliseerde craniale dura mater de belangrijkste factor kan zijn die leidt tot het optreden van hoofdpijn, waarbij de abnormale vasodilatatie en innervatie3,4,5betrokken zijn . De kennis van de neurovasculaire structuur in de craniale dura mater is dus belangrijk voor het begrijpen van de pathogenese van hoofdpijn, vooral voor migraine.
Hoewel de dura-innervatie eerder is bestudeerd met de conventionele immunohistochie , werd de ruimtelijke correlatie van zenuwvezels en bloedvaten in de craniale dura mater minder bestudeerd6,7,8,9. Om de dural neurovasculaire structuur in meer detail te onthullen, werden calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) en phalloïdine geselecteerd als de markers voor respectievelijk het kleuren van de dural zenuwvezels en bloedvaten in de hele schedel dura mater met immunofluorescentie en fluorescerende histochemie10. Het kan een optimale keuze zijn om een driedimensionale (3D) weergave van de neurovasculaire structuur te verkrijgen. Bovendien werd fluorgoud (FG) aangebracht op het gebied rond de middelste hersenvliesslagader (MMA) in de schedel dura mater om de oorsprong van CGRP-immunoreactieve zenuwvezels te bepalen, en getraceerd naar het trigeminus ganglion (TG) en cervicale (C) dorsale wortel ganglia (DRG's), terwijl de FG-gelabelde neuronen verder werden onderzocht samen met CGRP met behulp van immunofluorescentie.
Het doel van deze studie was om een effectief hulpmiddel te bieden voor het onderzoeken van de neurovasculaire structuur in de craniale dura mater voor de CGRP-immunoreactieve innervatie en de oorsprong ervan. Door gebruik te maken van de transparante whole-mount dura mater en de combinatie van de immunofluorescentie, retrograde tracing, confocale technieken en 3D-reconstructie, verwachtten we een nieuw 3D-beeld van de neurovasculaire structuur in de craniale dura mater te presenteren. Deze methodologische benaderingen kunnen verder worden gediend voor het onderzoeken van de pathogenese van verschillende hoofdpijnen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Protect from light; RRID: AB_141607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain stereotaxis instrument</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Dimension</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 1.1</td>
			<td>Software of fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogold (FG)</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>52-9400</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Microm International&#160;GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FV10-ASW 4.2a</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td>Confocal image processing software system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill</td>
			<td>Saeyang Microtech</td>
			<td>Marathon-N7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CGRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81887</td>
			<td>RRID: AB_1658411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 568</td>
			<td>Molecular&#160;Probes</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop and&#160; Illustration</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>CS6</td>
			<td>Photo editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- Fluorogold</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab153</td>
			<td>RRID: AB_90738</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>National Institutes for Food and Drug Control</td>
			<td>SCXK (JING) 2014-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>#4951PLUS-001</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing

Het doel van deze studie was om de verdeling en oorsprong van het calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP)-immunoreactieve sensorische zenuwvezels van de craniale dura mater te onderzoeken met behulp van immunofluorescentie, driedimensionale (3D) reconstructie en retrograde tracing techniek. Hier werden de zenuwvezels en bloedvaten gekleurd met behulp van immunofluorescentie- en histochemietechnieken met respectievelijk CGRP en fluorescerende falloïdine. De ruimtelijke correlatie van dural CGRP-immuoreactieve zenuwvezels en bloedvaten werd aangetoond door 3D-reconstructie. Ondertussen werd de oorsprong van de CGRP-immunoreactieve zenuwvezels gedetecteerd door neurale tracing techniek met fluorogold (FG) van het gebied rond de middelste meningeale slagader (MMA) in de craniale dura mater naar het trigeminus ganglion (TG) en cervicale (C) dorsale wortel ganglia (DRG's). Bovendien werden de chemische kenmerken van FG-gelabelde neuronen in de TG en DRG's ook samen met CGRP onderzocht met behulp van dubbele immunofluorescenten. Gebruikmakend van het transparante whole-mount monster en 3D-reconstructie, werd aangetoond dat CGRP-immunoreactieve zenuwvezels en arteriolen met falloidine-label samen lopen of afzonderlijk een dural neurovasculaire netwerk vormen in een 3D-weergave, terwijl de FG-gelabelde neuronen werden gevonden in de oogheelkundige, maxillaire en mandibulaire takken van TG, evenals de C2-3 DRGs ipsilaterale toepassing. Met deze benaderingen hebben we de distributiekenmerken van CGRP-immunoreactieve zenuwvezels rond de bloedvaten in de craniale dura mater aangetoond, evenals de oorsprong van deze zenuwvezels uit TG en DRG's. Vanuit het perspectief van de methodologie kan het een waardevolle referentie zijn voor het begrijpen van de gecompliceerde neurovasculaire structuur van de craniale dura mater onder de fysiologische of pathologische aandoening.

Neurovasculaire structuur van de craniale dura mater Na immunofluorescente en fluorescerende histochemische kleuring met CGRP en falloïdine werden CGRP-immunoreactieve zenuwvezels en phalloidine-gelabelde dural arteriolen en bindweefsels duidelijk aangetoond in de hele craniale dura mater in een 3D-patroon(figuur 2C,D, E, F). Het werd aangetoond dat zowel dikke als dunne CGRP-immunoreactieve zenuwvezels parallel lopen met...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

Hier presenteren we een protocol om ruimtelijke correlatie van calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP)-immunoreactieve zenuwvezels en bloedvaten in de schedel dura mater te visualiseren met behulp van immunofluorescentie en fluorescerende histochemie met respectievelijk CGRP en falloïdine. Bovendien was de oorsprong van deze zenuwvezels retrograde getraceerd met een fluorescerende neurale tracer.

Visualiseren van de Calcitonine Gen-Gerelateerde Peptide Immunoreactieve Innervation van de Rat Cranial Dura Mater met Immunofluorescentie en Neural Tracing

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...

Dit protocol kan een variabele methodologische referentie bieden voor het begrijpen van de gecompliceerde neurovasculaire structuur van de craniale dura mater op de fysiologische of pathologische aandoening. Profiterend van transparante gehele mount dura mater, kan de spaciale correlatie van dural CGRP immunoreactieve zenuwvezels en bloedvaten worden aangetoond in een 3D-weergave. Na euthanasie van een rat, transcardially doordrenkt met 100 milliliter van 0,9% normale zoutoplossing gevolgd door 250 tot 300 milliliter 4% paraformaldehyde in 0,1 molaire fosfaatbuffer.Als u klaar bent, verwijdert u de hoofdhuid en opent u de schedel om de dura mater en dorsale kant van de hersenen bloot te leggen. Ontleed de craniale dura mater langs de hersenstam naar de olfactorische bol in een heel mount patroon. Spoel de craniale dura mater ongeveer een minuut af in 0,1 molaire fosfaatbuffer en incubeer deze in een blokkerende oplossing.Breng de dura mater 's nachts over in het anti-CGRP-antilichaam van de muis. Was de dura mater de volgende dag driemaal in 0,1 molaire fosfaatbuffer. Incubeer de dura mater in een gemengde oplossing van ezel antimuis Alexa Fluor 488 secundair antilichaam en falloïde 568 in 0.1.Molaire fosfaatbuffer met 1%normaal ezelsserum en 0,5%Triton X-100 gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. Was vervolgens de dura mater drie keer in 0,1 molaire fosfaatbuffer, knip de randen bij en monteer deze op microscoopglaasjes. Doe op cover slips met 50%glycerine voor observatie.Beeld de hele mount dura mater met een fluorescerende microscoop, maak vervolgens beelden van de CGRP immunoreactieve zenuwvezels en falloïdine-gelabelde bloedvaten in de dura mater met behulp van een confocale microscoop. Scheer het hoofd van de rat met een elektrisch scheermes, leg vervolgens stompe oorstangen tegen de rat en plaats deze op het stereotaxic-apparaat. Plaats de mondhouder en breng oogzalf aan op de ogen.Reinig de chirurgische kant van de hoofdhuid met 75% ethanol en maak een incisie langs de middellijn van de hoofdhuid. Verwijder het periosteum en de spierweefsels botweg van de schedel met steriele applicators met katoenen punt. Boor een klein gaatje met behulp van een braamboor met een ronde puntbit op de linker pariëtale en temporale botten boven de middelste hersenvliesslagader.Bouw een bank rond het gat met tandsilicaatcement en voeg twee microliters fluorgoud toe aan het gat rond de middelste meningeale slagader met een microsyringe van 10 microliter. Bedek het gat met een klein stukje hemostatische spons. Leg een stuk paraffinefilm op het gat en sluit de randen af met beenderwas.Hecht de wond met steriele draad. Houd de ratten in een warme omgeving totdat ze volledig zijn hersteld. Breng de ratten dan terug naar hun kooien.Na zeven overlevingsdagen, perfuseer deze ratten met 0,9% normale zoutoplossing gevolgd door 4% paraformaldehyde in 0,1 molaire fosfaatbuffer. Ontleed de TG en cervicale één tot vier DRG's en snijd ze vervolgens op de dikte van 30 micrometer op een cryostaatmicrotomesysteem in de sagittale richting. En monteer de secties op silane gecoate glazen dia's.Omcirkel de secties met een histochemische pen en incubeer ze gedurende 30 minuten in een blokkerende oplossing. Breng de monsters over in de oplossing van konijn anti-fluorgoud en muis anti-CGRP antilichaam en incubeer bij vier graden Celsius 's nachts. Was de volgende dag de secties drie keer in 0,1 molaire fosfaatbuffer.Incubeer de gewassen secties in een gemengde oplossing van ezel anti-konijn Alexa Fluor 594 en ezel anti-muis Alexa Fluor 488 secundaire antilichaam. Was ze vervolgens drie keer in 0,1 molaire fosfaatbuffer en breng afdekstroken aan met 50% glycerine ter observatie. Maak foto's van de fluorgoud gelabelde neuronen in TG en DRG's onder UV-verlichting met behulp van een fluorescerende microscoop.Leg vervolgens beelden vast van de fluorgoud en CGRP gelabelde neuronen in TG en DRG's. Na immunofluorescente en fluorescerende histochemische kleuring met CGRP en phalloidine, werden CGRP immunoreactieve zenuwvezels en phalloïdine gelabeld dural arterioles en bindweefsels duidelijk gevisualiseerd in de hele mount cranial dura mater in een 3D-patroon. Zowel dikke als dunne CGRP immunoreactieve zenuwvezels lopen parallel aan de dural arteriële rond de vaatwand of tussen de bloedvaten.Zeven dagen na fluorgoudtoepassing op het gebied van de middelste hersenvliesslagader en de schedel dura mater van de rat, werden de fluorgoud gelabelde neuronen gedetecteerd in TG en cervicale DRG's aan de ipsilaterale kant van de tracertoepassing, die direct werd waargenomen onder de UV-verlichting van de fluorescerende microscopie. Fluorogold gelabelde neuronen werden gevonden in alle drie de takken van TG, met hogere concentraties op de oogheelkundige en maxillaire divisies en met lagere concentraties op de mandibulaire deling. Sommige van de fluorgoud gelabelde neuronen werden ook waargenomen in de cervicale twee tot drie DRG's.Deze dubbele immunofluorescentie representatieve foto's tonen sensorische neuronen in TG en DRG. De gelabelde neuronen met FG, CGRP en zowel FG als CGRP werden gevisualiseerd door dubbele immunofluorescentie. Wanneer u dit protocol probeert, vergeet dan niet om de craniale dura mater volledig te ontleden en op een dia te plakken in een heel montagepatroon.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypische Cerebellaire culturen: apoptotische uitdagingen en Detectie

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Investigating the Neural Mechanisms of Aware and Unaware Fear Memory with fMRI

Onderzoek naar de neurale mechanismen van Aware en zich niet bewust Fear geheugen met fMRI

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optische registratie van suprathreshold neurale activiteit met single-cell en single-spike resolutie

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Virale Tracing van genetische gedefinieerde neurale circuits

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation van neurale activiteit met Laser Verlichting in Semi-intacte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tijdafhankelijke toename in het netwerkrespons bij de stimulatie van neuronale celculturen op micro-elektrode arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

Verbetering van de toepassing van ultrahoog moleculair gewicht biotinyleerd Dextran Amine voor Thalamocortical projectie traceren in de Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Gelijktijdige opnamen van corticale lokale veld Potentials, elektrocardiogram Electromyogram en ademhaling ritme van een vrij bewegende Rat

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

De detectie van 5-Hydroxymethylcytosine in neurale stamcellen en hersenen van muizen

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...