Name: visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing
Uploaded: 2021-01-06T13:00:00
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Diese Studie wurde durch das Projekt des National Key F&D Program of China (Projektcode-Nr. 2019YFC1709103; Nr. 2018YFC1707804) und der National Natural Science Foundation of China (Projektcode-Nr. 81774211; Nr. 81774432; Nr. 81801561) unterstützt.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Akupunktur und Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (Referenznummer D2018-09-29-1) genehmigt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996) durchgeführt. Zwölf erwachsene Sprague-Dawley männliche Ratten (Gewicht 220 ± 20 g) wurden in dieser Studie verwendet. Tiere [Lizenznummer SCXK (JING) 2017-0005] wurden v...

<ol>
	<li>Kekere, V., Alsayouri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Head+and+Neck,+Dura+Mater.">Anatomy, Head and Neck, Dura Mater.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+origin+of+TRPV1+receptor-containing+nerve+fibers+in+the+dura+mater+of+rat.">Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat.</a> Brain Research. 1173, 84-91 (2007).</li><li>Jacobs, B., Dussor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+contributions+to+migraine:+moving+beyond+vasodilation.">Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation.</a> Neuroscience. 338, 130-144 (2016).</li><li>Dodick, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase-by-phase+review+of+migraine+pathophysiology.">A phase-by-phase review of migraine pathophysiology.</a> Headache. 58, 4-16 (2018).</li><li>Amin, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+pathophysiological+mechanisms+of+migraine+attacks+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-38.">Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38.</a> Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).</li><li>Keller, J. T., Marfurt, C. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor-like+receptor+(CLR),+receptor+activity-modifying+protein+1+(RAMP1),+and+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+immunoreactivity+in+the+rat+trigeminovascular+system:+differences+between+peripheral+and+central+CGRP+receptor+distribution.">Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).</li><li>Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+nerve+fibers+storing+CGRP+and+CGRP+receptors+in+the+peripheral+trigeminovascular+system.">Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system.</a> The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).</li><li>Xu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+distribution+of+blood+vessels+and+nerve+fibers+in+the+skin+tissues+of+acupoint+"Taichong"+(LR3)+in+the+rat.">Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat.</a> Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).</li><li>Cui, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+calcitonin+gene-related+peptide+on+the+neurons+associated+Zusanli+(ST+36)+in+rats.">The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+fibres+and+their+terminals+of+the+dura+mater+encephali+of+the+rat.">Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat.</a> Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).</li><li>Leng, C., Chen, L., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+P2X1-6+receptor+expression+in+retrograde+Fluorogold-labeled+DRG+neurons+from+rat+chronic+neuropathic+pain+model.">Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model.</a> Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).</li><li>Huang, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold+in+an+animal+optic+nerve+crush+model.">Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model.</a> Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).</li><li>Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+protective+effect+of+local+administration+of+triamcinolone+or+systemic+treatment+with+methylprednisolone+against+damages+caused+by+optic+nerve+crush+in+rats.">Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).</li><li>Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+recombinant+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+(G-CSF)+in+neurodegeneration+after+optic+nerve+crush+in+rats.">Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).</li><li>Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcitonin+gene-related+peptide+in+peripheral+and+central+pain+mechanisms+including+migraine.">The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine.</a> Pain. 158 (4), 543-559 (2017).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+neural+circuits+from+peripheral+afferents+to+the+spinal+cord:+possible+implications+for+diabetic+polyneuropathy+in+streptozotocin-induced+type+1+diabetic+rats.">Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).</li><li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+express+&#945;-smooth+muscle+actin,+which+requires+prevention+of+filamentous-actin+depolymerization+for+detection.">Capillary pericytes express &#945;-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection.</a> eLife. 7, 34861 (2018).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+sensory+innervation+of+the+rat+superior+sagittal+sinus.">Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus.</a> Neuroscience. 129, 431-437 (2004).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+the+sensory+innervation+of+the+rat+middle+meningeal+artery.">Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery.</a> Brain Research. 1208, 103-110 (2008).</li><li>Schmued, L. C., Fallon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Gold:+a+new+fluorescent+retrograde+axonal+tracer+with+numerous+unique+properties.">Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties.</a> Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).</li></ol>

In dieser Studie haben wir erfolgreich die Verteilung und den Ursprung von CGRP-immunreaktiven Nervenfasern in der Schädel-Dura-Mater unter Verwendung von Immunfluoreszenz, 3D-Rekonstruktion und neuronalen Tracing-Ansätzen mit CGRP-Antikörper und FG-neuralem Tracer nachgewiesen, was die histologischen und chemischen Beweise liefert, um das durale neurovaskuläre Netzwerk besser zu verstehen.
Bekanntlich spielt CGRP eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Migräne4...

Die Schädel-Dura-Mater ist die äußerste Schicht von Hirnhäuschen, um das Gehirn zu schützen und enthält reichlich Blutgefäße und verschiedene Arten von Nervenfasern1,2. Viele Studien haben gezeigt, dass sensibilisierte Schädel-Dura mater kann der Schlüsselfaktor, der das Auftreten von Kopfschmerzen, mit der abnormalen Vasodilatation und Innervation3,4,5. Daher ist das Wissen über die neurovaskuläre Struktur in der Schädel-Dura-Mater wichtig für das Verständnis der Pathogenese von Kopfschmerzen, insbesondere bei Migräne.
Obwohl die Dura-Innervation zuvor mit der konventionellen Immunhistochemie untersucht wurde, wurde die räumliche Korrelation von Nervenfasern und Blutgefäßen in der Schädel-Dura-Mater weniger untersucht6,7,8,9. Um die durale neurovaskuläre Struktur genauer zu zeigen, wurden Calcitonin-Gen-bezogenes Peptid (CGRP) und Phalloidin als Marker für die jeweils Färbung der duralen Nervenfasern und Blutgefäße in der vollbepfebten Kranial-Dura-Mater mit Immunfluoreszenz und fluoreszierender Histochemie10ausgewählt. Es kann eine optimale Wahl sein, um eine dreidimensionale (3D) Ansicht der neurovaskulären Struktur zu erhalten. Zusätzlich wurde Fluorgold (FG) auf dem Gebiet um die mittlere Meningealarterie (MMA) in der Schädel-Dura-Mater angewendet, um den Ursprung von CGRP-immunreaktiven Nervenfasern zu bestimmen, und auf das trigeminale Ganglion (TG) und die zervikale (C) dorsale Wurzelganglien (DRGs) zurückverfolgt, während die FG-markierten Neuronen zusammen mit CGRP weiter untersucht wurden.
Ziel dieser Studie war es, ein wirksames Instrument zur Untersuchung der neurovaskulären Struktur im Schädel-Dura-Mater für die CGRP-immunreaktive Innervation und ihren Ursprung bereitzustellen. Durch die Nutzung des transparenten Vollmontage-Dura-Maters und die Kombination von Immunfluoreszenz, retrogradetracing, konfokalen Techniken und 3D-Rekonstruktion, erwarteten wir, eine neuartige 3D-Ansicht der neurovaskulären Struktur in der Schädel-Dura-Mater zu präsentieren. Diese methodischen Ansätze können weiter zur Erforschung der Pathogenese verschiedener Kopfschmerzen dienen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Protect from light; RRID: AB_141607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain stereotaxis instrument</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Dimension</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 1.1</td>
			<td>Software of fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogold (FG)</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>52-9400</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Microm International&#160;GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FV10-ASW 4.2a</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td>Confocal image processing software system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill</td>
			<td>Saeyang Microtech</td>
			<td>Marathon-N7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CGRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81887</td>
			<td>RRID: AB_1658411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 568</td>
			<td>Molecular&#160;Probes</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop and&#160; Illustration</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>CS6</td>
			<td>Photo editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- Fluorogold</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab153</td>
			<td>RRID: AB_90738</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>National Institutes for Food and Drug Control</td>
			<td>SCXK (JING) 2014-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>#4951PLUS-001</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing

Ziel dieser Studie war es, die Verteilung und den Ursprung des Calcitonin-Gen-bezogenen Peptids (CGRP)-immunreaktiven sensorischen Nervenfasern der Schädel-Dura-Mater mittels Immunfluoreszenz, dreidimensionaler (3D) Rekonstruktion und retrogradeTracing-Technik zu untersuchen. Hierwurden die Nervenfasern und Blutgefäße mit Immunfluoreszenz- und Histochemietechniken mit CGRP bzw. fluoreszierendem Phalloidin gefärbt. Die räumliche Korrelation von duralen CGRP-immuoreaktiven Nervenfasern und Blutgefäßen wurde durch 3D-Rekonstruktion nachgewiesen. In der Zwischenzeit wurde der Ursprung der CGRP-immunreaktiven Nervenfasern durch neuronale Tracing-Technik mit Fluorgold (FG) aus dem Bereich um die mittlere Meningealarterie (MMA) in der Schädel-Dura-Mater zum trigeminalen Ganglion (TG) und zervikalen (C) dorsalen Wurzelganglien (DRGs) nachgewiesen. Darüber hinaus wurden die chemischen Eigenschaften von FG-markierten Neuronen in den TG und DRGs zusammen mit CGRP mit doppelten Immunfluoreszenzenzen untersucht. Unter Ausnutzung der transparenten Ganzmontageprobe und der 3D-Rekonstruktion wurde gezeigt, dass CGRP-immunreaktive Nervenfasern und phalloidin-markierte Arteriolen zusammenlaufen oder in einer 3D-Ansicht getrennt ein durales neurovaskuläres Netzwerk bilden. während die FG-markierten Neuronen in den ophthalmologischen, kiefer-, unterkiefer- und unterkieferförmigen Zweigen von TG gefunden wurden, sowie die C2-3 DRGs ipsilateral zur Seite der Tracer-Anwendung, in der einige fg-markierte Neuronen mit CGRP-immunreaktiver Expression präsentierten. Mit diesen Ansätzen demonstrierten wir die Verteilungseigenschaften von CGRP-immunreaktiven Nervenfasern um die Blutgefäße in der Schädel-Dura-Mater sowie den Ursprung dieser Nervenfasern aus TG und DRGs. Aus der Perspektive der Methodik kann es eine wertvolle Referenz für das Verständnis der komplizierten neurovaskulären Struktur der Schädel-Dura-Mater unter dem physiologischen oder pathologischen Zustand bieten.

Neurovaskuläre Struktur der Schädel-Dura-Mater Nach immunfluoreszierenden und fluoreszierenden histochemischen Färbungen mit CGRP und Phalloidin wurden CGRP-immunreaktive Nervenfasern und phalloidin-markierte Duralarteriolen und Bindegewebe in der gesamten Cranial-Dura-Mater in einem 3D-Muster deutlich vorgeführt ( Abbildung2C,D,E,F). Es wurde gezeigt, dass sowohl dicke als auch dünne CGRP-immunreaktive Nervenfasern p...

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Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

Hier stellen wir ein Protokoll zur Visualisierung der räumlichen Korrelation von Calcitonin-Gen-bezogenen Peptid (CGRP)-immunreaktiven Nervenfasern und Blutgefäßen in der Schädel-Dura-Mater unter Verwendung von Immunfluoreszenz bzw. fluoreszierender Histochemie mit CGRP bzw. Phalloidin vor. Darüber hinaus wurde der Ursprung dieser Nervenfasern mit einem fluoreszierenden neuronalen Tracer retrograd nachverfolgt.

Visualisierung der Calcitonin Gene-Related Pepact Immunoreactive Innervation der Ratte Cranial Dura Mater mit Immunfluoreszenz und neuronaler Tracing

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...

Dieses Protokoll kann eine variable methodische Referenz für das Verständnis der komplizierten neurovaskulären Struktur der kranialen Dura mater auf den physiologischen oder pathologischen Zustand liefern. Unter Nutzung der transparenten Whole Mount Dura Mater kann die räumliche Korrelation von duralen CGRP-immunreaktiven Nervenfasern und Blutgefäßen in einer 3D-Ansicht demonstriert werden. Nach dem Einschläfern einer Ratte transkardiert mit 100 Millilitern 0,9% normaler Kochsalzlösung, gefolgt von 250 bis 300 Millilitern 4% Paraformaldehyd in 0,1 Molarphosphatpuffer.Wenn Sie fertig sind, entfernen Sie die Kopfhaut und öffnen Sie den Schädel, um die Dura mater und die dorsale Seite des Gehirns freizulegen. Sezieren Sie die Kranialdura mater entlang des Hirnstamms bis zum Riechkolben in einem ganzen Montagemuster. Spülen Sie die Kranialdura mater in 0,1 Molarphosphatpuffer für etwa eine Minute aus und inkubieren Sie sie in einer blockierenden Lösung.Übertragen Sie die Dura mater über Nacht in den Anti-CGRP-Antikörper der Maus. Am folgen Tag die Dura mater dreimal in 0,1 Molarphosphatpuffer waschen. Inkubieren Sie die Dura mater in einer Mischlösung aus Esel-Anti-Maus Alexa Fluor 488 sekundären Antikörper und Phalloidin 568 in 0,1.Molarer Phosphatpuffer mit 1% normalem Eselserum und 0,5% Triton X-100 für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Dura mater dreimal in 0,1 Molarphosphatpuffer, trimmen Sie die Kanten und montieren Sie sie auf Objektträgern. Vor der Beobachtung auf Deckzettel mit 50% Glycerin legen.Stellen Sie sich die gesamte Mount Dura Mater mit einem Fluoreszenzmikroskop ab und machen Sie dann Bilder der immunreaktiven CGRP-Nervenfasern und Phalloidin-markierten Blutgefäße in der Dura mater mit einem konfokalen Mikroskop. Rasieren Sie den Kopf der Ratte mit einem elektrischen Rasierer, legen Sie dann stumpfe Ohrbügel auf die Ratte und legen Sie sie auf das stereotaxische Gerät. Positionieren Sie den Mundhalter und tragen Sie ophthalmische Salbe auf die Augen auf.Reinigen Sie die chirurgische Seite der Kopfhaut mit 75% Ethanol und machen Sie einen Schnitt entlang der Mittellinie der Kopfhaut. Entfernen Sie das Periost und das Muskelgewebe mit sterilen Applikatoren mit Baumwollspitze stumpf vom Schädel entfernt. Bohren Sie ein kleines Loch mit einem Gratbohrer mit einem runden Spitzenbiss an den linken Parietal- und Schläfenknochen oberhalb der mittleren Meningealarterie.Bauen Sie eine Bank um das Loch mit Dentalsilikatzement und fügen Sie zwei Mikroliter Fluorgold in das Loch um die mittlere Meningealarterie mit einer 10-Mikroliter-Mikrospritze hinzu. Bedecken Sie das Loch mit einem kleinen Stück hämostatischem Schwamm. Legen Sie ein Stück Paraffinfilm auf das Loch und versiegeln Sie die Kanten mit Knochenwachs.Nähen Sie die Wunde mit sterilem Faden. Halten Sie die Ratten in einem warmen Bereich, bis sie sich vollständig erholt haben. Dann bringen Sie die Ratten zurück in ihre Käfige.Nach sieben Überlebenstagen perfundieren Sie diese Ratten mit 0,9% normaler Kochsalzlösung, gefolgt von 4% Paraformaldehyd in 0,1 Molarphosphatpuffer. Sezieren Sie die TG und die zervikalen ein bis vier DRGs und schneiden Sie sie dann mit einer Dicke von 30 Mikrometern auf einem Kryostatmikrotomsystem in sagittaler Richtung. Und montieren Sie die Profile auf silanbeschichteten Glasobjektträgern.Umkreisen Sie die Abschnitte mit einem histochemischen Pen und inkubieren Sie sie für 30 Minuten in Blocklösung. Die Proben in die Lösung von Kaninchen-Anti-Fluorgold- und Maus-Anti-CGRP-Antikörpern überführen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Abschnitte dreimal in 0,1 Molarphosphatpuffer waschen.Inkubieren Sie die gewaschenen Abschnitte in einer Mischlösung aus Esel-Anti-Kaninchen Alexa Fluor 594 und Esel-Anti-Maus Alexa Fluor 488 sekundären Antikörper. Dann waschen Sie sie dreimal in 0,1 molaren Phosphatpuffer und tragen Sie Zur Beobachtung Deckzettel mit 50% Glycerin auf. Nehmen Sie Bilder der Fluorgold-markierten Neuronen in TG und DRGs unter UV-Beleuchtung mit einem Fluoreszenzmikroskop auf.Nehmen Sie dann Bilder der Fluorgold- und CGRP-markierten Neuronen in TG und DRGs auf. Nach immunfluoreszierender und fluoreszierender histochemischer Färbung mit CGRP und Phalloidin wurden CGRP-immunreaktive Nervenfasern und Phalloidin-markierte Duralarterien und Bindegewebe im gesamten Mount Cranial Dura Mater in einem 3D-Muster deutlich visualisiert. Sowohl dicke als auch dünne immunreaktive CGRP-Nervenfasern verlaufen parallel zu den Duralarterien um die Gefäßwand oder zwischen den Blutgefäßen.Sieben Tage nach der Anwendung von Fluorgold auf den Bereich der Arteria middle meningeal und des Schädels dura mater der Ratte wurden die fluorgoldmarkierten Neuronen in TG und zervikalen DRGs auf der ipsilateralen Seite der Tracerapplikation nachgewiesen, was direkt unter der UV-Beleuchtung der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet wurde. Fluorgold-markierte Neuronen wurden in allen drei Zweigen des TG gefunden, mit höheren Konzentrationen auf der Augen- und Oberkieferabteilung und mit niedrigeren Konzentrationen auf der Unterkieferteilung. Einige der Fluorgold-markierten Neuronen wurden auch in den zervikalen zwei bis drei DRGs beobachtet.Diese repräsentativen Doppelimmunfluoreszenzfotos zeigen sensorische Neuronen in TG und DRG. Die markierten Neuronen mit FG, CGRP und sowohl FG als auch CGRP wurden durch doppelte Immunfluoreszenz visualisiert. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, denken Sie daran, die Kranialdura mater vollständig zu sezieren und auf eine Rutsche in einem ganzen Mount-Muster einzufügen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypische Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Forschung

Neurowissenschaften

Investigating the Neural Mechanisms of Aware and Unaware Fear Memory with fMRI

Die Erforschung der neuronalen Mechanismen der Aware und Unkenntnis Angst Speicher mit fMRI

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optische Aufnahme überschwellige neuronale Aktivität mit Single-Cell-und Single-Spike Auflösung

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Bedingte Genetische transsynaptische Tracing in der embryonalen Maus-Gehirn

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Zeitabhängige Erhöhung der Netzwerkreaktion auf die Stimulation von neuronalen Zellkulturen auf Mikroelektroden-Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

Verbesserung der Anwendung des hochmolekularen Biotinylierte Dextran Amin für Thalamocortical Projektion Tracing in der Ratte

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Gleichzeitige Aufnahmen der kortikalen lokales Feld Potentiale, Elektrokardiogramm, Elektromyogramm und Atemrhythmus aus einem frei beweglichen Ratte

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Der Nachweis von 5-Hydroxymethylcytosin in neuralen Stammzellen und Gehirnen von Mäusen

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...