Name: visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing
Uploaded: 2021-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

מחקר זה נתמך על ידי הפרויקט של תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (קוד פרויקט מס ' 2019YFC1709103; מס ' 2018YFC1707804) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (קוד פרויקט מס ' 81774211; מס ' 81774432; מס ' 81801561).

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה של המכון לדיקור סיני ומוקסיבושציה, האקדמיה הסינית למדעי הרפואה הסינית (מספר סימוכין D2018-09-29-1). כל ההליכים בוצעו בהתאם למדריך הלאומי לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (הוצאת האקדמיה הלאומית, וושינגטון, ד.C,1996). במחקר זה נעשה שימוש ב-12 חולדות זכרות בוגרות Sprague-Dawley...

<ol>
	<li>Kekere, V., Alsayouri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Head+and+Neck,+Dura+Mater.">Anatomy, Head and Neck, Dura Mater.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+origin+of+TRPV1+receptor-containing+nerve+fibers+in+the+dura+mater+of+rat.">Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat.</a> Brain Research. 1173, 84-91 (2007).</li><li>Jacobs, B., Dussor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+contributions+to+migraine:+moving+beyond+vasodilation.">Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation.</a> Neuroscience. 338, 130-144 (2016).</li><li>Dodick, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase-by-phase+review+of+migraine+pathophysiology.">A phase-by-phase review of migraine pathophysiology.</a> Headache. 58, 4-16 (2018).</li><li>Amin, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+pathophysiological+mechanisms+of+migraine+attacks+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-38.">Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38.</a> Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).</li><li>Keller, J. T., Marfurt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidergic+and+serotoninergic+innervation+of+the+rat+dura+mater.">Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).</li><li>Messlinger, K., Hanesch, U., Baumg&#228;rtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+the+dura+mater+encephali+of+cat+and+rat:+ultrastructure+and+calcitonin+gene-related+peptide-like+and+substance+P-like+immunoreactivity.">Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity.</a> Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).</li><li>Lennerz, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor-like+receptor+(CLR),+receptor+activity-modifying+protein+1+(RAMP1),+and+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+immunoreactivity+in+the+rat+trigeminovascular+system:+differences+between+peripheral+and+central+CGRP+receptor+distribution.">Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).</li><li>Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+nerve+fibers+storing+CGRP+and+CGRP+receptors+in+the+peripheral+trigeminovascular+system.">Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system.</a> The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).</li><li>Xu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+distribution+of+blood+vessels+and+nerve+fibers+in+the+skin+tissues+of+acupoint+"Taichong"+(LR3)+in+the+rat.">Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat.</a> Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).</li><li>Cui, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+calcitonin+gene-related+peptide+on+the+neurons+associated+Zusanli+(ST+36)+in+rats.">The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+fibres+and+their+terminals+of+the+dura+mater+encephali+of+the+rat.">Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat.</a> Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).</li><li>Leng, C., Chen, L., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+P2X1-6+receptor+expression+in+retrograde+Fluorogold-labeled+DRG+neurons+from+rat+chronic+neuropathic+pain+model.">Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model.</a> Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).</li><li>Huang, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold+in+an+animal+optic+nerve+crush+model.">Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model.</a> Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).</li><li>Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+protective+effect+of+local+administration+of+triamcinolone+or+systemic+treatment+with+methylprednisolone+against+damages+caused+by+optic+nerve+crush+in+rats.">Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).</li><li>Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+recombinant+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+(G-CSF)+in+neurodegeneration+after+optic+nerve+crush+in+rats.">Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).</li><li>Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcitonin+gene-related+peptide+in+peripheral+and+central+pain+mechanisms+including+migraine.">The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine.</a> Pain. 158 (4), 543-559 (2017).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Kou, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+neural+circuits+from+peripheral+afferents+to+the+spinal+cord:+possible+implications+for+diabetic+polyneuropathy+in+streptozotocin-induced+type+1+diabetic+rats.">Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).</li><li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+express+&#945;-smooth+muscle+actin,+which+requires+prevention+of+filamentous-actin+depolymerization+for+detection.">Capillary pericytes express &#945;-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection.</a> eLife. 7, 34861 (2018).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+sensory+innervation+of+the+rat+superior+sagittal+sinus.">Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus.</a> Neuroscience. 129, 431-437 (2004).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+the+sensory+innervation+of+the+rat+middle+meningeal+artery.">Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery.</a> Brain Research. 1208, 103-110 (2008).</li><li>Schmued, L. C., Fallon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Gold:+a+new+fluorescent+retrograde+axonal+tracer+with+numerous+unique+properties.">Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties.</a> Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).</li></ol>

במחקר זה, הדגמנו בהצלחה את ההתפלגות ואת המקור של סיבי עצב CGRP-immunoreactive בדורא מאטר הגולגולתי באמצעות immunofluorescence, שחזור תלת מימדי וגישות מעקב עצבי עם נוגדן CGRP ומעקב עצבי FG, מתן ראיות היסטולוגיות וכימיות כדי להבין טוב יותר את הרשת neurovascular dural.
כפי שהיה ידוע, CGRP ממלא תפקיד קריטי בפתו...

ה דורה מאטר גולגולתי הוא השכבה החיצונית ביותר של קרום המוח כדי להגן על המוח ומכיל כלי דם בשפע וסוגים שונים של סיבי עצב1,2. מחקרים רבים הראו כי דורה דורה גולגולתית רגישה עשויה להיות הגורם העיקרי המוביל להתרחשות של כאבי ראש, מעורבים vasodilation חריגה innervation3,4,5. לכן, הידע של מבנה neurovascular ב דורה הגולגולתי mater חשוב להבנת הפתוגנזה של כאבי ראש, במיוחד עבור מיגרנה.
למרות innervation דורה נחקרה בעבר עם אימונוהיסטוכימיה קונבנציונאלי, המתאם המרחבי של סיבי עצב וכלי דם ב דורה גולגולתי מאטר נחקרו פחות6,7,8,9. על מנת לחשוף את המבנה הנוירו-וסקולרי הדוראלי ביתר פירוט, פפטיד הקשור לגנים קלציטונין (CGRP) ופאלואידין נבחרו כסמנים להכתמת סיבי העצבים וכלי הדם של דוראלי בכל הר דורה גולגולתי עם כשל חיסוני והיסטוכימיה פלואורסצנטית10. זה עשוי להיות בחירה אופטימלית כדי לקבל תצוגה תלת מימדית (3D) של מבנה neurovascular. בנוסף, fluorogold (FG) יושם על האזור סביב עורק קרום המוח האמצעי (MMA) ב dura הגולגולתי מאטר כדי לקבוע את המקור של סיבי עצב CGRP-immunoreactive, ועקבות גנגליון trigeminal (TG) וצוואר הרחם (C) שורש הגב הגרעיני (DRGs), בעוד נוירונים FG שכותרתו נבדקו יחד עם CGRP באמצעות immunofluscence.
מטרת מחקר זה הייתה לספק כלי יעיל לחקירת המבנה המוחי בדורה הגולגולתי עבור innervation CGRP-immunoreactive ומקורו. על ידי ניצול היתרון של הר דורה מאטר שקוף כולו ושילוב של immunofluorescence, מעקב מדרדר, טכניקות confocal, ושחזור 3D, ציפינו להציג תצוגה תלת-ממדית חדשנית של המבנה הנוירו-וסקולרי בדורה מאטר הגולגולתי. גישות מתודולוגיות אלה עשויות לשמש עוד יותר לחקר הפתוגנזה של כאבי ראש שונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Protect from light; RRID: AB_141607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain stereotaxis instrument</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Dimension</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 1.1</td>
			<td>Software of fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogold (FG)</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>52-9400</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Microm International&#160;GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FV10-ASW 4.2a</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td>Confocal image processing software system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill</td>
			<td>Saeyang Microtech</td>
			<td>Marathon-N7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CGRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81887</td>
			<td>RRID: AB_1658411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 568</td>
			<td>Molecular&#160;Probes</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop and&#160; Illustration</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>CS6</td>
			<td>Photo editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- Fluorogold</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab153</td>
			<td>RRID: AB_90738</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>National Institutes for Food and Drug Control</td>
			<td>SCXK (JING) 2014-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>#4951PLUS-001</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing

מטרת מחקר זה הייתה לבחון את ההתפלגות והמקור של פפטיד הקשורות לגנים קלציטונין (CGRP)-אימונואקטיבי סיבי עצב חושיים של דורה דורה גולגולתית באמצעות immunofluorescence, תלת מימדי (3D) שחזור טכניקת מעקב מדרדר. כאן, סיבי העצב וכלי הדם היו מוכתמים באמצעות כשל חיסוני וטכניקות היסטוכימיה עם CGRP ופאלואידין פלואורסצנטי, בהתאמה. המתאם המרחבי של סיבי עצב CGRP-immuoreactive dural וכלי דם הוכחו על ידי שחזור 3D. בינתיים, המקור של סיבי העצבים CGRP-immunoreactive זוהו על ידי טכניקת מעקב עצבי עם fluorogold (FG) מהאזור סביב עורק קרום המוח האמצעי (MMA) ב דורה גולגולתי מאטר כדי גנגליון trigeminal (TG) וצוואר הרחם (C) גרעיני שורש הגב (DRGs). בנוסף, המאפיינים הכימיים של נוירונים עם תווית FG ב- TG ו- DRGs נבדקו גם יחד עם CGRP באמצעות immunofluorescences כפול. תוך ניצול דגימת ההרה כולה השקופה ושחזור תלת-ממדי, הוכח כי סיבי עצב CGRP-immunoreactive ועורקים עם תווית פאלודין פועלים יחד או יוצרים בנפרד רשת נוירו-וסקולרית דוראלית בתצוגה תלת-ממדית, בעוד נוירונים FG שכותרתו נמצאו בענפים עיניים, maxillary, ו mandibular של TG, כמו גם C2-3 DRGs ipsilateral לצד של יישום מעקב שבו חלק נוירונים FG שכותרתו הציג עם ביטוי CGRP-immunoreactive. עם גישות אלה, הדגמנו את המאפיינים ההפצתיים של סיבי עצב CGRP-immunoreactive סביב כלי הדם ב דורה גולגולתי מאטר, כמו גם את המקור של סיבי עצב אלה מ TG ו DRGs. מנקודת המבט של המתודולוגיה, זה עשוי לספק התייחסות חשובה להבנת המבנה המוחי המסובך של דורה גולגולתי מאטר תחת המצב הפיזיולוגי או הפתולוגי.

מבנה נוירו-וסקולרי של הדורה מאטר הגולגולתי לאחר כתמים היסטוכימיים אימונופלואורסצנטיים ופלואורסצנטיים עם CGRP ופלאודין, סיבי עצב CGRP-immunoreactive ועורקים דוראליים עם תווית פאלודין ורקמות חיבור הוכחו בבירור לאורך כל ההר דורה דורה גולגולתי בדפוס תלת-ממדי(א...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לדמיין מתאם מרחבי של פפטיד הקשורות לגנים קלציטונין (CGRP)-אימונואקטיבי סיבי עצב וכלי דם ב דורה גולגולתי mater באמצעות immunofluorescence והיסטוכימיה פלואורסצנטית עם CGRP ו phalloidin, בהתאמה. בנוסף, מקורם של סיבי עצב אלה היה מדרדר נעוצים במעקב עצבי פלואורסצנטי.

הדמיה של פפטיד אימונואקטיבי הקשורות לגן קלציטונין של דורה מאטר גולגולת החולדה עם אימונופלואורסצנטיות ומעקב עצבי

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...

פרוטוקול זה עשוי לספק התייחסות מתודולוגית משתנה להבנת המבנה המוחי המורכב של דורה דורה גולגולתית על המצב הפיזיולוגי או הפתולוגי. ניצול של הר דורה מאטר שקוף, המתאם מרחבי של סיבי עצב אימונואקטיביים CGRP dural וכלי דם ניתן להדגים בתצוגה 3D. לאחר המתת חסד חולדה, טרנסקרדיאלית perfused אותה עם 100 מיליליטר של 0.9% מלוחים נורמלי ואחריו 250 כדי 300 מיליליטר של 4% paraformaldehyde ב 0.1 חוצץ פוספט טוחן.בסיום, להסיר את העור בראש ולפתוח את הגולגולת כדי לחשוף את הדורה מאטר ואת הצד הגבי של המוח. לנתח את דורה דורה גולגולתי מאטר לאורך גזע המוח אל נורת הריח בתבנית הר שלם. יש לשטוף את הדורה מאטר הגולגולתי ב-0.1 חוצץ פוספט טוחן למשך כדקה ולהדגיר אותו בתמיסת חסימה.העבר את דורה מאטר לתוך נוגדן נגד CGRP העכבר לילה. למחרת, לשטוף את הדורה מאטר שלוש פעמים 0.1 חוצץ פוספט טוחן. דגירה דורה מאטר בתמיסה מעורבת של חמור נגד העכבר אלקסה פלואור 488 נוגדן משני ו phalloidin 568 ב 0.1.חיץ פוספט טוחנת המכיל 1% סרום חמור רגיל ו 0.5% טריטון X-100 במשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שטפו את הדורה מאטר שלוש פעמים במאגר פוספט טוחן 0.1, חתכו את הקצוות והרכיבו אותו על מגלשות מיקרוסקופ. שים על תלושי כיסוי עם 50% גליצרין לפני התצפית.דמיין את כל הר דורה מאטר עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ואז לצלם את סיבי העצב האימונואקטיביים CGRP וכלי דם עם תווית פאלואידין בדורה מאטר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. לגלח את ראשו של החולדה עם סכין גילוח חשמלי, ואז לשים מוטות אוזניים קהים לחולדה ומניחים אותו על המכשיר סטראוטקסי. מקם את מחזיק הפה ולהחיל משחה עיניים על העיניים.לנקות את הצד הכירורגי של העור הראש באמצעות 75% אתנול ולעשות חתך לאורך קו האמצע של הקרקפת. הסר בבוטות את periosteum ורקמות שריר מן הגולגולת באמצעות אפליקטורים כותנה סטרילית הטה. לקדוח חור קטן באמצעות מקדחה בר עם קצה עגול קצת על עצמות הקודקוד השמאלי זמן מעל עורק קרום הכלי האמצעי.לבנות בנק סביב החור עם מלט סיליקט שיניים ולהוסיף שני microliters של fluorogold לתוך החור סביב עורק קרום הקרום האמצעי עם 10 מיקרוליטר microsyringe. מכסים את החור עם חתיכה קטנה של ספוג hemostatic. שים חתיכת סרט פרפין על החור ולאטום את הקצוות עם שעווה בעצמות.לתפור את הפצע עם חוט סטרילי. שמור את החולדות באזור חם עד שהם התאוששו לחלוטין. ואז להחזיר את החולדות בחזרה לכלובים שלהם.לאחר שבעה ימי הישרדות, לחלחל חולדות אלה עם 0.9% מלוחים נורמלי ואחריו 4% paraformaldehyde ב 0.1 חוצץ פוספט טוחנת. לנתח את TG וצוואר הרחם אחד עד ארבעה DRGs, ואז לחתוך אותם בעובי של 30 מיקרומטרים על מערכת microtome cryostat בכיוון sagittal. ולהרכיב את החלקים על מגלשות זכוכית מצופות סילאן.מקיפים את החלקים בעט היסטוכימי ומדגרים אותם במשך 30 דקות בחסימת פתרון. להעביר את הדגימות לתוך הפתרון של ארנב אנטי פלואורוגולד ועכבר נגד CGRP נוגדן דגירה בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת, לשטוף את החלקים שלוש פעמים 0.1 חוצץ פוספט טוחן.דגירה את החלקים שטף בתמיסה מעורבת של חמור נגד ארנב אלקסה פלואור 594 וחמור נגד העכבר אלקסה פלואור 488 נוגדן משני. ואז לשטוף אותם שלוש פעמים 0.1 חוצץ פוספט טוחן ולהחיל תלושי כיסוי עם 50% גליצרין להשגחה. צלם תמונות של נוירונים שכותרתו פלואורוגולד TG ו DRGs תחת תאורת UV באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.לאחר מכן, ללכוד תמונות של fluorogold ו CGRP שכותרתו נוירונים TG ו DRGs. לאחר כתמים היסטוכימיים אימונופלואורסצנטיים ופלואורסצנטיים עם CGRP ופאלואידין, סיבי עצב אימונואקטיביים של CGRP ופאלואידין שכותרתו עורקים דוראליים ורקמות חיבור הוצגו בבירור לאורך כל ההר גולגולתי דורה מאטר בתבנית 3D. סיבי עצב חיסוניים עבים ודקים של CGRP פועלים במקביל לעורקי הדור סביב דופן כלי הדם או בין כלי הדם.שבעה ימים לאחר יישום fluorogold על האזור של עורק קרום המוח האמצעי ואת החולדה גולגולת דורה מאטר, נוירונים שכותרתו fluorogold זוהו TG ו DRGs צוואר הרחם בצד ipsilateral של יישום tracer, אשר נצפתה ישירות תחת תאורת UV של מיקרוסקופ פלורסנט. נוירונים שכותרתו Fluorogold נמצאו בכל שלושת הענפים של TG, עם ריכוזים גבוהים יותר על חטיבות עיניים ו maxillary ועם ריכוזים נמוכים יותר על חלוקת הלסת התחתונה. חלק מהנוירונים שכותרתו fluorogold נצפו גם בצוואר הרחם שניים עד שלושה DRGs.אלה immunofluorescences כפול תצלומים מייצגים להראות נוירונים חושיים TG ו DRG. הנוירונים שכותרתו עם FG, CGRP, וגם FG ו CGRP היו דמיינו על ידי חיסוניות כפולה. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור לנתח לחלוטין את דורת הדורה הגולגולתית ולהדביק אותה על שקופית בתבנית הרכבה שלמה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Investigating the Neural Mechanisms of Aware and Unaware Fear Memory with fMRI

לחקור את המנגנונים העצביים של זיכרון הפחד מודע ולא מודע עם fMRI

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

הקלטה אופטית של פעילות עצבית suprathreshold עם רזולוצית תא בודד ויחיד ספייק

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

איתור נגיפי של מעגלים עצביים מוגדרים גנטי

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

הפרעות optogenetic של פעילות עצבית עם תאורת לייזר בחצי ללא פגע<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים בתנועה

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

זמן תלויי תגובת הרשת בתגובה לגירוי של תרבויות תאים עצביים על מערכי מיקרו-אלקטרודה

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

שיפור היישום של משקל מולקולרי גבוה Biotinylated לתוספי אמין עבור היטל Thalamocortical עקיבה בחולדה

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

הקלטות סימולטני של פוטנציאל קורטיקלית שדה מקומי, רל, Electromyogram נושם קצב מעכברוש נעה בחופשיות

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

זיהוי של 5-הידרוגרד מתילציטוסין בתאי גזע עצביים ומוחות של עכברים

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...