Name: visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing
Uploaded: 2021-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

この研究は、中国国家キーR&Dプログラム(プロジェクトコード番号2019YFC1709103;No.2018YFC1707804)と中国国立自然科学財団(プロジェクトコード番号81774211;no.81774432;no.818015611)のプロジェクトによって支えられました。

この研究は、中国医学アカデミー鍼灸研究所の倫理委員会(参考番号D2018-09-29-1)によって承認されました。すべての手順は、実験動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイド(国立アカデミー出版局、ワシントンD.C、1996)に従って行われました。この研究では、12匹の成人スプレイグ・ドーリー雄ラット(体重220±20g)を使用した。動物[ライセンス番号SCXK(JING)2017-0005]は、国立食品医薬品管理研?...

<ol>
	<li>Kekere, V., Alsayouri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Head+and+Neck,+Dura+Mater.">Anatomy, Head and Neck, Dura Mater.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+origin+of+TRPV1+receptor-containing+nerve+fibers+in+the+dura+mater+of+rat.">Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat.</a> Brain Research. 1173, 84-91 (2007).</li><li>Jacobs, B., Dussor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+contributions+to+migraine:+moving+beyond+vasodilation.">Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation.</a> Neuroscience. 338, 130-144 (2016).</li><li>Dodick, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase-by-phase+review+of+migraine+pathophysiology.">A phase-by-phase review of migraine pathophysiology.</a> Headache. 58, 4-16 (2018).</li><li>Amin, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+pathophysiological+mechanisms+of+migraine+attacks+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-38.">Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38.</a> Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).</li><li>Keller, J. T., Marfurt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidergic+and+serotoninergic+innervation+of+the+rat+dura+mater.">Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).</li><li>Messlinger, K., Hanesch, U., Baumg&#228;rtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+the+dura+mater+encephali+of+cat+and+rat:+ultrastructure+and+calcitonin+gene-related+peptide-like+and+substance+P-like+immunoreactivity.">Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity.</a> Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).</li><li>Lennerz, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor-like+receptor+(CLR),+receptor+activity-modifying+protein+1+(RAMP1),+and+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+immunoreactivity+in+the+rat+trigeminovascular+system:+differences+between+peripheral+and+central+CGRP+receptor+distribution.">Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).</li><li>Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+nerve+fibers+storing+CGRP+and+CGRP+receptors+in+the+peripheral+trigeminovascular+system.">Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system.</a> The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).</li><li>Xu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+distribution+of+blood+vessels+and+nerve+fibers+in+the+skin+tissues+of+acupoint+"Taichong"+(LR3)+in+the+rat.">Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat.</a> Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).</li><li>Cui, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+calcitonin+gene-related+peptide+on+the+neurons+associated+Zusanli+(ST+36)+in+rats.">The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+fibres+and+their+terminals+of+the+dura+mater+encephali+of+the+rat.">Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat.</a> Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).</li><li>Leng, C., Chen, L., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+P2X1-6+receptor+expression+in+retrograde+Fluorogold-labeled+DRG+neurons+from+rat+chronic+neuropathic+pain+model.">Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model.</a> Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).</li><li>Huang, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold+in+an+animal+optic+nerve+crush+model.">Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model.</a> Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).</li><li>Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+protective+effect+of+local+administration+of+triamcinolone+or+systemic+treatment+with+methylprednisolone+against+damages+caused+by+optic+nerve+crush+in+rats.">Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).</li><li>Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+recombinant+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+(G-CSF)+in+neurodegeneration+after+optic+nerve+crush+in+rats.">Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).</li><li>Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcitonin+gene-related+peptide+in+peripheral+and+central+pain+mechanisms+including+migraine.">The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine.</a> Pain. 158 (4), 543-559 (2017).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Kou, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+neural+circuits+from+peripheral+afferents+to+the+spinal+cord:+possible+implications+for+diabetic+polyneuropathy+in+streptozotocin-induced+type+1+diabetic+rats.">Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).</li><li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+express+&#945;-smooth+muscle+actin,+which+requires+prevention+of+filamentous-actin+depolymerization+for+detection.">Capillary pericytes express &#945;-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection.</a> eLife. 7, 34861 (2018).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+sensory+innervation+of+the+rat+superior+sagittal+sinus.">Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus.</a> Neuroscience. 129, 431-437 (2004).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+the+sensory+innervation+of+the+rat+middle+meningeal+artery.">Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery.</a> Brain Research. 1208, 103-110 (2008).</li><li>Schmued, L. C., Fallon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Gold:+a+new+fluorescent+retrograde+axonal+tracer+with+numerous+unique+properties.">Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties.</a> Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).</li></ol>

本研究では、免疫蛍光、3D再構成、および神経トレーサーによる神経トレーサによる脳神経障害におけるCGRP免疫反応性神経線維の分布と起源を実証し、神経血管網の理解を深める組織学的および化学的証拠を提供した。
それが知られていたように、CGRPは片頭痛4、17の病因において重要な役割を果たしている。増加したCGRPは、3...

頭蓋硬膜は、脳を保護するための髄膜の最外層であり、豊富な血管と神経線維の異なる種類1、2が含まれています。多くの研究は、感作頭蓋硬膜が異常な血管拡張およびインナーベーション3、4、5を含む頭痛の発生につながる重要な要因である可能性があることを示している。したがって、頭蓋硬膜における神経血管構造の知識は、特に片頭痛の発病を理解するために重要である。
硬膜の内膜は従来の免疫検査で以前に研究されてきたが、頭蓋硬膜における神経線維と血管の空間的相関は6、7、8、9より少なかった。より詳細に神経血管構造を明らかにするために、カルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)およびファロイジンを、免疫蛍光および蛍光組織化学10を有する全実装頭蓋デュラ・マテルにおける硬膜神経線維および血管をそれぞれ染色するためのマーカーとして選択した。神経血管構造の三次元(3D)ビューを得るのに最適な選択であり得る。さらに、 フルオロゴールド(FG)は、脳神経筋の中髄膜動脈(MMA)周辺領域に適用され、CGRP免疫反応性神経線維の起源を決定し、3叉神経節(TG)および子宮頸部(C)後頭根神経節(DRG)に追跡され、FG標識ニューロンは免疫伝達を用いてさらに一緒に検査した。
本研究の目的は、CGRP免疫反応性の内挿とその起源に対する頭蓋硬膜の神経血管構造を調査するための有効なツールを提供することであった。透明な全実装型DURa materを利用し、免疫蛍光、逆行トレーシング、共焦点技術、および3D再構成を組み合わせることで、頭蓋デュラマーターにおける神経血管構造の新しい3Dビューを提示することが期待された。これらの方法論的アプローチは、異なる頭痛の病因を探索するためにさらに役立つ可能性がある。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Protect from light; RRID: AB_141607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain stereotaxis instrument</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Dimension</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 1.1</td>
			<td>Software of fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogold (FG)</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>52-9400</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Microm International&#160;GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FV10-ASW 4.2a</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td>Confocal image processing software system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill</td>
			<td>Saeyang Microtech</td>
			<td>Marathon-N7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CGRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81887</td>
			<td>RRID: AB_1658411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 568</td>
			<td>Molecular&#160;Probes</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop and&#160; Illustration</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>CS6</td>
			<td>Photo editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- Fluorogold</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab153</td>
			<td>RRID: AB_90738</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>National Institutes for Food and Drug Control</td>
			<td>SCXK (JING) 2014-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>#4951PLUS-001</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing

本研究の目的は、免疫蛍光、三次元(3D)再構成および逆行トレーシング技術を用いた頭蓋硬膜のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)免疫反応性感覚神経線維の分布と起源を調べることであった。ここで、神経線維と血管は、それぞれCGRPおよび蛍光ファロイジンを用いた免疫蛍光および組織化学技術を用いて染色した。硬膜CGRP-インミュール活性神経線維と血管の空間的相関を3D再構成によって実証した。一方、CGRP免疫反応神経線維の起源は、頭蓋頭膜神経節(TG)および子宮頸部側神経節(DrGs)の中髄膜動脈(MMA)周辺領域からフルオロゴールド(FG)を用いた神経学的追跡技術によって検出された。また、TGおよびDRGにおけるFG標識ニューロンの化学的特徴も、二重免疫蛍光を用いたCGRPと併せて調べた。透明な全実装サンプルと3D再構成を利用して、CGRP免疫反応性神経線維とファロイジン標識動脈が一緒に動くか、または別々に3Dビューで神経血管網を形成することを示した、 一方、FG標識ニューロンは、TGの眼、上顎、下顎の枝、およびFG標識ニューロンの一部がCGRP-免疫反応性を示すトレーサー適用の側にC2-3 DRGのイプシララルで発見された。これらのアプローチにより、頭蓋硬膜の血管周囲のCGRP免疫反応性神経線維の分布特性、ならびにTGおよびDRGからのこれらの神経線維の起源を実証した。方法論の観点から、生理学的または病理学的状態下での頭蓋硬膜の複雑な神経血管構造を理解するための貴重な参考文献を提供し得る。

頭蓋硬膜の神経血管構造 CGRPおよびファロイジンによる免疫蛍光および蛍光組織化学的染色の後、CGRP免疫反応性神経線維およびファロイジン標識された硬動脈および結合組織は、3Dパターンで全身に明示された(図2C、D、E、F)。厚くて薄いCGRP免疫反応神経線維は、両方とも、血管壁の周り、または血管間の硬膜動脈に?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

ここでは、CGRPおよびファロイジンを用いた免疫蛍光および蛍光組織化学を用いて、頭蓋デュラマー中のカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)免疫反応性神経線維および血管の空間相関を可視化するプロトコルを提示する。また、これらの神経線維の起源は、蛍光神経トレーサーで逆行トレースした。

ラットの脳神経デュラMaterのカルシトニン遺伝子関連ペプチド免疫反応性インナーケイを免疫蛍光と神経トレースによる可視化

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...

このプロトコルは、生理学的または病理学的状態上の頭蓋硬膜の複雑な神経血管構造を理解するための可変的な方法論的参照を提供し得る。透明な全体実装デュラマーを利用して、硬膜CGRP免疫反応性神経線維および血管の容量相関を3Dビューで実証することができる。ラットを安楽死させた後、経心的に0.9%の正常な生理食塩水の100ミリリットルでそれを透過し、続いて0.1モルリン酸緩衝液に4%パラホルムアルデヒドの250〜300ミリリットルが続いた。終了したら、頭の皮膚を取り除き、頭蓋骨を開いて脳の硬膜と後側を露出させます。脳幹に沿って頭蓋硬膜を全体のマウントパターンで嗅球に解剖する。頭蓋デュラマーターを0.1モルリン酸バッファーで約1分間リンスし、ブロッキング溶液にインキュベートします。硬膜をマウス抗CGRP抗体に一晩移す。翌日、0.1モルリン酸緩衝液で硬膜を3回洗浄します。ロバ抗マウスアレクサFluor 488二次抗体とファロイジン568の混合溶液中で硬膜をインキュベートする。1%正常ロバ血清および0.5%トリトンX-100を室温で1.5時間含有するリン酸モル緩衝液。次に、デュラマーターを0.1モルリン酸緩衝液で3回洗浄し、縁を整え、顕微鏡スライドに取り付けます。観察前に50%グリセリンでカバースリップを入れてください。蛍光顕微鏡で全体のマウントデュラマーを画像化し、その後、共焦点顕微鏡を使用して、デュラマーター内のCGRP免疫反応性神経線維およびファロイジン標識血管の画像を撮ります。電気カミソリでラットの頭を剃り、ラットに鈍い耳の棒を置き、ステレオタックスデバイスに置きます。口ホルダーを置き、眼の軟膏を目に当ててください。75%エタノールを使用してヘッドスキンの外科側をきれいにし、頭皮の正中に沿って切開を行います。無菌綿先端アプリケーターを使用して、頭蓋骨から骨膜および筋肉組織をぶっきらぼうに取り除きます。左頭頂部に丸い先端ビットを付け、中髄動脈の上側骨を用いて小さな穴を開けます。歯科ケイ酸塩セメントで穴の周りに銀行を建設し、10マイクロシリンジで中髄動脈の周りの穴にフルオロゴールドの2マイクロリットルを追加します。小さな止血スポンジで穴を覆います。穴にパラフィンフィルムを置き、骨ワックスでエッジを密封します。傷口を無菌糸で縫合する。ラットが完全に回復するまで、暖かい場所に保管してください。その後、ラットをケージに戻します。7日間の生存の後、これらのラットを0.9%正常生理食塩基に浸透させ、続いて0.1モルリン酸緩衝液に4%パラホルムアルデヒドを続ける。TGと子宮頸部を1~4個のDRGを解剖し、矢状方向のクライオスタットミクロトームシステムで30マイクロメートルの厚さで切断します。そして、シランコーティングガラススライド上のセクションをマウントします。セクションをヒストケミカルペンで囲み、ブロッキング溶液で30分間インキュベートします。サンプルをウサギの抗フルオロゴールドおよびマウス抗CGRP抗体の溶液に移し、一晩摂氏4度でインキュベートします。翌日、0.1モルリン酸緩衝液で3回セクションを洗浄します。洗浄した部分を、ロバ抗ウサギアレクサFluor 594とロバ抗マウスアレクサFluor 488二次抗体の混合溶液にインキュベートする。その後、0.1リン酸モルバッファーで3回洗浄し、観察のために50%グリセリンでカバースリップを適用します。蛍光顕微鏡を用いて、TGおよびDRGの蛍光金標識ニューロンをUV照明下で撮影します。次に、TGおよびDRGにおけるフルオロゴールドおよびCGRP標識ニューロンの画像をキャプチャする。CGRPおよびファロイジンによる免疫蛍光および蛍光組織化学的染色後、CGRP免疫反応性神経線維およびファロイジン標識された硬直動脈および結合組織は、3Dパターンで頭蓋デュラマー全体を通して明確に可視化された。厚くて薄いCGRP免疫反応神経線維は、血管壁の周りまたは血管間の硬膜動脈と並行して実行されます。中髄膜動脈およびラット頭蓋硬膜の領域にフルオロゴールドを塗布してから7日後、蛍光顕微鏡のUV照射下で直接観察されたトレーサー塗布のイプシラテラ側で、フルオロゴールド標識ニューロンがTGおよび子宮頸部DRGで検出された。フルオロゴールド標識ニューロンは、TGの3つの枝すべてで発見され、眼科および上顎分裂に高い濃度があり、下顎除算部の濃度が低かった。フルオロゴールド標識ニューロンの一部は、子宮頸部2〜3個のDRGでも観察された。これらの二重免疫蛍光の代表的な写真は、TGおよびDRGにおける感覚ニューロンを示す。FG、CGRP、およびFGおよびCGRPを用いた標識ニューロンを、二重免疫蛍光によって可視化した。このプロトコルを試みるとき、頭蓋デュラマーを完全に解剖し、全体のマウントパターンのスライドに貼り付けることを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

器官小脳文化：アポトーシス課題と検出

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Investigating the Neural Mechanisms of Aware and Unaware Fear Memory with fMRI

fMRIの持つ認識と非認識恐怖記憶の神経機構を調査する

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

単一セルと単スパイク分解能で閾値上神経活動の光記録

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

遺伝的に定義された神経回路のトレースウイルス

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動<em&gt;ショウジョウバエ</emイン·モーション&gt;幼虫

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

トレースのラットにおける視床皮質投射のビオチン標識デキストランの高分子量アミンの運用の改善

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

皮質局所電界電位、心電図、筋電図、呼吸リズム自由行動ラットからの同時録音

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

マウスの神経幹細胞と脳における5-ヒドロキシメチルシトシンの検出

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...