Name: visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing
Uploaded: 2021-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

Este estudo foi apoiado pelo projeto do Programa Nacional de P&D da China (Project Code nº 2019YFC1709103; nº 2018YFC1707804) e Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Código de Projeto nº 81774211; nº 81774432; nº 81801561).

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto de Acupuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (número de referência D2018-09-29-1). Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia Nacional de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Foram utilizados neste estudo 12 ratos machos adultos Sprague-Dawley (peso 220 ± 20 g). Os animais [número de licença SCXK (JING) 2017-0005] foram fornecidos pelos Instituto...

<ol>
	<li>Kekere, V., Alsayouri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Head+and+Neck,+Dura+Mater.">Anatomy, Head and Neck, Dura Mater.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+origin+of+TRPV1+receptor-containing+nerve+fibers+in+the+dura+mater+of+rat.">Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat.</a> Brain Research. 1173, 84-91 (2007).</li><li>Jacobs, B., Dussor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+contributions+to+migraine:+moving+beyond+vasodilation.">Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation.</a> Neuroscience. 338, 130-144 (2016).</li><li>Dodick, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase-by-phase+review+of+migraine+pathophysiology.">A phase-by-phase review of migraine pathophysiology.</a> Headache. 58, 4-16 (2018).</li><li>Amin, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+pathophysiological+mechanisms+of+migraine+attacks+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-38.">Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38.</a> Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).</li><li>Keller, J. T., Marfurt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidergic+and+serotoninergic+innervation+of+the+rat+dura+mater.">Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).</li><li>Messlinger, K., Hanesch, U., Baumg&#228;rtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+the+dura+mater+encephali+of+cat+and+rat:+ultrastructure+and+calcitonin+gene-related+peptide-like+and+substance+P-like+immunoreactivity.">Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity.</a> Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).</li><li>Lennerz, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor-like+receptor+(CLR),+receptor+activity-modifying+protein+1+(RAMP1),+and+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+immunoreactivity+in+the+rat+trigeminovascular+system:+differences+between+peripheral+and+central+CGRP+receptor+distribution.">Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).</li><li>Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+nerve+fibers+storing+CGRP+and+CGRP+receptors+in+the+peripheral+trigeminovascular+system.">Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system.</a> The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).</li><li>Xu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+distribution+of+blood+vessels+and+nerve+fibers+in+the+skin+tissues+of+acupoint+"Taichong"+(LR3)+in+the+rat.">Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat.</a> Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).</li><li>Cui, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+calcitonin+gene-related+peptide+on+the+neurons+associated+Zusanli+(ST+36)+in+rats.">The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+fibres+and+their+terminals+of+the+dura+mater+encephali+of+the+rat.">Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat.</a> Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).</li><li>Leng, C., Chen, L., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+P2X1-6+receptor+expression+in+retrograde+Fluorogold-labeled+DRG+neurons+from+rat+chronic+neuropathic+pain+model.">Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model.</a> Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).</li><li>Huang, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold+in+an+animal+optic+nerve+crush+model.">Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model.</a> Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).</li><li>Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+protective+effect+of+local+administration+of+triamcinolone+or+systemic+treatment+with+methylprednisolone+against+damages+caused+by+optic+nerve+crush+in+rats.">Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).</li><li>Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+recombinant+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+(G-CSF)+in+neurodegeneration+after+optic+nerve+crush+in+rats.">Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).</li><li>Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcitonin+gene-related+peptide+in+peripheral+and+central+pain+mechanisms+including+migraine.">The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine.</a> Pain. 158 (4), 543-559 (2017).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Kou, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+neural+circuits+from+peripheral+afferents+to+the+spinal+cord:+possible+implications+for+diabetic+polyneuropathy+in+streptozotocin-induced+type+1+diabetic+rats.">Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).</li><li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+express+&#945;-smooth+muscle+actin,+which+requires+prevention+of+filamentous-actin+depolymerization+for+detection.">Capillary pericytes express &#945;-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection.</a> eLife. 7, 34861 (2018).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+sensory+innervation+of+the+rat+superior+sagittal+sinus.">Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus.</a> Neuroscience. 129, 431-437 (2004).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+the+sensory+innervation+of+the+rat+middle+meningeal+artery.">Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery.</a> Brain Research. 1208, 103-110 (2008).</li><li>Schmued, L. C., Fallon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Gold:+a+new+fluorescent+retrograde+axonal+tracer+with+numerous+unique+properties.">Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties.</a> Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).</li></ol>

Neste estudo, demonstramos com sucesso a distribuição e a origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP no dura-pena craniano usando imunofluorescência, reconstrução 3D e abordagens de rastreamento neural com anticorpo CGRP e rastreador neural FG, fornecendo as evidências histológicas e químicas para entender melhor a rede neurovascular dural.
Como era conhecido, o CGRP desempenha um papel crítico na patogênese da enxaqueca4,17</su...

A dura-máter craniana é a camada mais externa de meninges para proteger o cérebro e contém vasos sanguíneos abundantes e diferentes tipos de fibras nervosas1,2. Muitos estudos têm demonstrado que a dura-dura-maternidade craniana sensibilizada pode ser o fator-chave que leva à ocorrência de dores de cabeça, envolvendo a vasodilatação anormal e a inervação3,4,5. Assim, o conhecimento da estrutura neurovascular na dura-escola craniana é importante para a compreensão da patogênese das dores de cabeça, especialmente para a enxaqueca.
Embora a innervação dura tenha sido previamente estudada com a imunohistoquímica convencional, a correlação espacial das fibras nervosas e vasos sanguíneos na duracolia craniana foram menos estudadas6,7,8,9. Para revelar a estrutura neurovascular dural com mais detalhes, peptídeos relacionados a genes de calcitonina (CGRP) e faloideína foram selecionados como marcadores para, respectivamente, coloração das fibras nervosas durais e vasos sanguíneos na dura-dura craniana de todo o monte com imunofluorescência e histoquímica fluorescente10. Pode ser uma escolha ideal para obter uma visão tridimensional (3D) da estrutura neurovascular. Além disso, fluorogold (FG) foi aplicada na área em torno da artéria meningeal média (MMA) na dura-dura craniana para determinar a origem das fibras nervosas imunorreativas CGRP, e rastreada à gânglio trigeminal (TG) e gânglios de raiz dorsal (DRGs) cervicais (DRGs), enquanto os neurônios rotulados pelo FG foram examinados juntamente com CGRP usando imunofluorescência.
O objetivo deste estudo foi fornecer uma ferramenta eficaz para a investigação da estrutura neurovascular na dura mater craniana para a inervação CGRP-imunoreactive e sua origem. Aproveitando a dura-dura-montagem transparente e combinando a imunofluorescência, o rastreamento retrógrado, as técnicas confocal e a reconstrução 3D, esperamos apresentar uma nova visão 3D da estrutura neurovascular na dura-duracaca craniana. Essas abordagens metodológicas podem ser ainda mais servidas para explorar a patogênese de diferentes dores de cabeça.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Protect from light; RRID: AB_141607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain stereotaxis instrument</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Dimension</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 1.1</td>
			<td>Software of fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogold (FG)</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>52-9400</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Microm International&#160;GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FV10-ASW 4.2a</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td>Confocal image processing software system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill</td>
			<td>Saeyang Microtech</td>
			<td>Marathon-N7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CGRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81887</td>
			<td>RRID: AB_1658411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 568</td>
			<td>Molecular&#160;Probes</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop and&#160; Illustration</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>CS6</td>
			<td>Photo editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- Fluorogold</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab153</td>
			<td>RRID: AB_90738</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>National Institutes for Food and Drug Control</td>
			<td>SCXK (JING) 2014-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>#4951PLUS-001</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing

O objetivo deste estudo foi examinar a distribuição e a origem do peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras sensoriais imunoreativas do duracococa craniano utilizando imunofluorescência, reconstrução tridimensional (3D) e técnica de rastreamento retrógrado. Aqui, as fibras nervosas e vasos sanguíneos foram manchados usando imunofluorescência e técnicas histoquímicas com CGRP e fábula fluorescente, respectivamente. A correlação espacial das fibras nervosas e vasos nervosos transmotivos cgrp-immuoreactive dural e vasos sanguíneos foram demonstradas pela reconstrução 3D. Enquanto isso, a origem das fibras nervosas imunoreativas CGRP foram detectadas pela técnica de rastreamento neural com fluorogold (FG) da área ao redor da artéria meningeal média (MMA) na duracaca craniana mater à gânglio triginal (TG) e gânglios de raiz dorsal cervical (C) (DRGs). Além disso, as características químicas dos neurônios rotulados por FG nos TG e DRGs também foram examinadas juntamente com CGRP utilizando imunofluorescências duplas. Aproveitando a amostra transparente de montagem integral e a reconstrução 3D, mostrou-se que as fibras nervosas imunoreativas CGRP e as artérias rotuladas por fálico funcionam juntas ou formando separadamente uma rede neurovascular dural em uma visão 3D, enquanto os neurônios rotulados por FG foram encontrados nos ramos oftálmico, maxilar e mandibular de TG, bem como os IPS C2-3 ao lado da aplicação do rastreador em que alguns dos neurônios rotulados por FG apresentavam expressão CGRP-imunoreactive. Com essas abordagens, demonstramos as características distributivas das fibras nervosas cgrp-imunoreativas ao redor dos vasos sanguíneos na dura-duracaca craniana, bem como a origem dessas fibras nervosas de TG e DRGs. Do ponto de vista da metodologia, pode fornecer uma referência valiosa para a compreensão da complicada estrutura neurovascular da dura mater craniana sob a condição fisiológica ou patológica.

Estrutura neurovascular da dura mater craniana Após a coloração histoquímica imunofluorescente e fluorescente com CGRP e faloidina, as fibras nervosas imunoreativas CGRP e as artérias dural e tecidos conjuntivos foram claramente demonstradas em toda a duraza mater de todo o monte em um padrão 3D(Figura 2C, D,E,F). Mostrou-se que tanto as fibras nervosas espessas quanto as finas CGRP-imunoreactive funcionam em paralel...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

Aqui apresentamos um protocolo para visualizar a correlação espacial do peptídeo relacionado ao gene de calcitonina (CGRP)-fibras nervosas imunoreativas e vasos sanguíneos na duracolia craniana usando imunofluorescência e histoquímica fluorescente com CGRP e fábulina, respectivamente. Além disso, a origem dessas fibras nervosas foi retrógrada traçada com um rastreador neural fluorescente.

Visualizando a Interiorização Imunoreativa Do Peptídeo Relacionado ao Gene calcitonina do Rato Cranial Dura Mater com Imunofluorescência e Rastreamento Neural

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...

Este protocolo pode fornecer uma referência metodológica variável para compreender a complicada estrutura neurovascular da dura mater craniana na condição fisiológica ou patológica. Aproveitando-se de toda a montagem transparente dura mater, a correlação espacial de fibras nervosas imunoreativas dural CGRP e vasos sanguíneos pode ser demonstrada em uma visão 3D. Depois de eutanásia de um rato, transcardialmente perfundiu-o com 100 mililitros de soro fisiológico 0,9% normal seguido por 250 a 300 mililitros de 4% de paraformaldeído em 0,1 tampão molar fosfato.Quando terminar, remova a pele da cabeça e abra o crânio para expor o lado dura e dorsal do cérebro. Disseca a dura gêmea craniana ao longo do tronco cerebral à lâmpada olfativa em um padrão de montagem inteiro. Enxágüe a dura-máter craniana em 0,1 tampão de fosfato molar por cerca de um minuto e incuba-o em uma solução de bloqueio.Transfira o dura mater para o anticorpo anti-CGRP do mouse durante a noite. No dia seguinte, lave a dura mater três vezes em 0,1 tampão de fosfato molar. Incubar o dura mater em uma solução mista de anti-rato de burro Alexa Fluor 488 anticorpo secundário e faloidein 568 em 0.1.Tampão fosfato molar contendo soro de burro 1% normal e 0,5% Triton X-100 por 1,5 horas em temperatura ambiente. Em seguida, lave a dura mater três vezes em tampão de fosfato molar de 0,1, corte as bordas e monte-a em slides de microscópio. Coloque os deslizamentos de cobertura com 50% de glicerina antes da observação.Imagem toda a montagem dura mater com um microscópio fluorescente, em seguida, tirar imagens das fibras nervosas imunoreativas CGRP e vasos sanguíneos rotulados com falitina na dura mater usando um microscópio confocal. Raspe a cabeça do rato com uma navalha elétrica, depois coloque barras de ouvido cegas no rato e coloque-a no dispositivo estereotaxico. Posicione o porta-voz e aplique pomada oftálmica nos olhos.Limpe o lado cirúrgico da pele da cabeça usando 75% de etanol e faça uma incisão ao longo da linha média do couro cabeludo. Remova sem rodeios e tecidos musculares do crânio usando aplicadores de algodão estéril. Faça um pequeno furo usando uma broca de rebarba com uma ponta redonda nos ossos parietal esquerdo e temporal acima da artéria meningeal média.Construa um banco ao redor do buraco com cimento de sílica dental e adicione dois microliters de fluorogold no buraco ao redor da artéria meningeal média com uma microsiringe de 10 microliteres. Cubra o buraco com um pequeno pedaço de esponja hemostática. Coloque um pedaço de filme de parafina no buraco e sele as bordas com cera óssea.Sutura a ferida com fio estéril. Mantenha os ratos em uma área quente até que eles se recuperem completamente. Então devolva os ratos de volta às suas gaiolas.Após sete dias de sobrevivência, perfuse esses ratos com soro fisiológico 0,9% normal seguido de 4% de paraformaldeído em 0,1 tampão de fosfato molar. Disseca o TG e o cervical de um a quatro DRGs, em seguida, corte-os na espessura de 30 micrômetros em um sistema de microtome criostat na direção sagital. E monte as seções em lâminas de vidro revestidas de silano.Circule as seções com uma caneta histoquímica e incuba-as por 30 minutos na solução de bloqueio. Transfira as amostras para a solução de anticorpo anti-fluorogold e camundongo e incubar a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, lave as seções três vezes em 0,1 tampão molar fosfato.Incubar as seções lavadas em uma solução mista de anti-coelho de burro Alexa Fluor 594 e anti-rato de burro Alexa Fluor 488 anticorpo secundário. Em seguida, lave-os três vezes em 0,1 tampão molar fosfato e aplique deslizamentos de cobertura com 50% de glicerina para observação. Tire imagens dos neurônios rotulados fluorogold em TG e DRGs sob iluminação UV usando um microscópio fluorescente.Em seguida, capture imagens dos neurônios rotulados fluorogold e CGRP em TG e DRGs. Após a coloração histoquímica imunofluorescente e fluorescente com CGRP e faloidina, as fibras nervosas imunoreativas CGRP e a fálice rotulada dural arterioles e tecidos conjuntivos foram claramente visualizadas em todo o monte de duração craniana mater em um padrão 3D. As fibras nervosas imunoreativas CGRP grossas e finas funcionam em paralelo às artérias durais ao redor da parede vascular ou entre os vasos sanguíneos.Sete dias após a aplicação de fluorogold na região da artéria meningeal média e da dura-dura-rato, os neurônios rotulados fluorogold foram detectados em TG e DRGs cervicais no lado ipsilateral da aplicação do rastreador, que foi observado diretamente sob a iluminação UV da microscopia fluorescente. Os neurônios rotulados fluorogold foram encontrados nos três ramos de TG, com maiores concentrações nas divisões oftálmicas e maxilares e com menores concentrações na divisão mandibular. Alguns dos neurônios rotulados por fluorogold também foram observados nos drgs cervicais de dois a três drados.Estas fotografias representativas de imunofluorescências duplas mostram neurônios sensoriais em TG e DRG. Os neurônios rotulados com FG, CGRP e fg e CGRP foram visualizados por dupla imunofluorescência. Ao tentar este protocolo, lembre-se de dissecar completamente a dura-fé cranial e colá-la em um slide em um padrão de montagem inteiro.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Neurociência

Investigating the Neural Mechanisms of Aware and Unaware Fear Memory with fMRI

Investigar os mecanismos neurais da memória Fear Consciente e Inconsciente com fMRI

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

A gravação ótica da atividade neural supraliminares com resolução de uma única célula e um único pico

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Rastreamento de viral geneticamente definido Neural dos circuitos

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbação da atividade neural com Iluminação Laser no Semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Condicional Genetic transsináptica Tracing no Embryonic do cérebro do rato

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

Melhorar a aplicação de alto Peso Molecular Biotinylated dextrano amina para projeção Thalamocortical rastreamento em ratos

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Gravações simultâneas de potenciais de campo corticais Local, eletrocardiograma, eletromiograma e respirar o ritmo de um rato andando livremente

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

A detecção de 5-Hidroximetilcitosina em células-tronco neurais e cérebros de camundongos

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...