Name: visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing
Uploaded: 2021-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

Denna studie stöddes av projektet national key R&D Program of China (Project Code nr 2019YFC1709103; nr 2018YFC1707804) och National Natural Science Foundation of China (Project Code nr 81774211; nr 81774432; nr 81801561).

Denna studie godkändes av etikkommittén vid Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referensnummer D2018-09-29-1). Alla ingrepp utfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Tolv vuxna Sprague-Dawley hanråttor (vikt 220 ± 20 g) användes i denna studie. Djur [licensnummer SCXK (JING) 2017-0005] tillhandahölls av National Institutes for Food and Drug Control.
<p ...

<ol>
	<li>Kekere, V., Alsayouri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Head+and+Neck,+Dura+Mater.">Anatomy, Head and Neck, Dura Mater.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+origin+of+TRPV1+receptor-containing+nerve+fibers+in+the+dura+mater+of+rat.">Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat.</a> Brain Research. 1173, 84-91 (2007).</li><li>Jacobs, B., Dussor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+contributions+to+migraine:+moving+beyond+vasodilation.">Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation.</a> Neuroscience. 338, 130-144 (2016).</li><li>Dodick, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase-by-phase+review+of+migraine+pathophysiology.">A phase-by-phase review of migraine pathophysiology.</a> Headache. 58, 4-16 (2018).</li><li>Amin, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+pathophysiological+mechanisms+of+migraine+attacks+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-38.">Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38.</a> Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).</li><li>Keller, J. T., Marfurt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidergic+and+serotoninergic+innervation+of+the+rat+dura+mater.">Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).</li><li>Messlinger, K., Hanesch, U., Baumg&#228;rtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+the+dura+mater+encephali+of+cat+and+rat:+ultrastructure+and+calcitonin+gene-related+peptide-like+and+substance+P-like+immunoreactivity.">Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity.</a> Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).</li><li>Lennerz, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor-like+receptor+(CLR),+receptor+activity-modifying+protein+1+(RAMP1),+and+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+immunoreactivity+in+the+rat+trigeminovascular+system:+differences+between+peripheral+and+central+CGRP+receptor+distribution.">Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).</li><li>Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+nerve+fibers+storing+CGRP+and+CGRP+receptors+in+the+peripheral+trigeminovascular+system.">Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system.</a> The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).</li><li>Xu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+distribution+of+blood+vessels+and+nerve+fibers+in+the+skin+tissues+of+acupoint+"Taichong"+(LR3)+in+the+rat.">Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat.</a> Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).</li><li>Cui, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+calcitonin+gene-related+peptide+on+the+neurons+associated+Zusanli+(ST+36)+in+rats.">The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+fibres+and+their+terminals+of+the+dura+mater+encephali+of+the+rat.">Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat.</a> Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).</li><li>Leng, C., Chen, L., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+P2X1-6+receptor+expression+in+retrograde+Fluorogold-labeled+DRG+neurons+from+rat+chronic+neuropathic+pain+model.">Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model.</a> Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).</li><li>Huang, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold+in+an+animal+optic+nerve+crush+model.">Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model.</a> Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).</li><li>Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+protective+effect+of+local+administration+of+triamcinolone+or+systemic+treatment+with+methylprednisolone+against+damages+caused+by+optic+nerve+crush+in+rats.">Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).</li><li>Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+recombinant+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+(G-CSF)+in+neurodegeneration+after+optic+nerve+crush+in+rats.">Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).</li><li>Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcitonin+gene-related+peptide+in+peripheral+and+central+pain+mechanisms+including+migraine.">The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine.</a> Pain. 158 (4), 543-559 (2017).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Kou, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+neural+circuits+from+peripheral+afferents+to+the+spinal+cord:+possible+implications+for+diabetic+polyneuropathy+in+streptozotocin-induced+type+1+diabetic+rats.">Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).</li><li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+express+&#945;-smooth+muscle+actin,+which+requires+prevention+of+filamentous-actin+depolymerization+for+detection.">Capillary pericytes express &#945;-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection.</a> eLife. 7, 34861 (2018).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+sensory+innervation+of+the+rat+superior+sagittal+sinus.">Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus.</a> Neuroscience. 129, 431-437 (2004).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+the+sensory+innervation+of+the+rat+middle+meningeal+artery.">Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery.</a> Brain Research. 1208, 103-110 (2008).</li><li>Schmued, L. C., Fallon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Gold:+a+new+fluorescent+retrograde+axonal+tracer+with+numerous+unique+properties.">Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties.</a> Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).</li></ol>

I denna studie har vi framgångsrikt visat fördelningen och ursprunget för CGRP-immunoreactive nerv fibrer i hjärnskålen dura mater med hjälp av immunofluorescens, 3D återuppbyggnad och neurala spårning metoder med CGRP antikroppar och FG neurala spårämne, ger histologiska och kemiska bevis för att bättre förstå hamburg neurovaskulära nätverket.
Som det var känt spelar CGRP en kritisk roll i patogenesen vid migrän4,17....

Hjärnskålen dura mater är det yttersta lagret av hjärnhinnor för att skydda hjärnan och innehåller rikliga blodkärl och olika typer av nervfibrer1,2. Många studier har visat att sensibiliserad hjärnskålen dura mater kan vara den viktigaste faktorn som leder till förekomsten av huvudvärk, som involverar onormal vasodilatation och innervation3,4,5. Således är kunskapen om neurovaskulär struktur i hjärnskålen dura mater viktig för att förstå patogenesen vid huvudvärk, särskilt för migrän.
Även om dura innervation har studerats tidigare med konventionella immunohistokemi, var den rumsliga korrelationen mellan nervfibrer och blodkärl i hjärnskålen dura mater mindrestuderade 6,7,8,9. För att avslöja hamburg neurovaskulära struktur mer detaljerat, calcitonin gen-relaterade peptid (CGRP) och falloidin valdes som markörer för respektive färgning hamburg nerv fibrer och blodkärl i hela mount hjärnskålen dura mater med immunofluorescens och fluorescerande histokemi10. Det kan vara ett optimalt val att få en tredimensionell (3D) syn på neurovaskulär struktur. Dessutom applicerades fluorogold (FG) på området runt mellersta meningeal gatan (MMA) i hjärnskålen dura mater för att bestämma ursprunget till CGRP-immunoreactive nerv fibrer, och spåras till trigeminal ganglion (TG) och massundersökning (C) dorsala rot ganglier (DRGs), medan FG-märkta nervceller undersöktes ytterligare tillsammans med CGRP med hjälp av immunofluorescens.
Syftet med denna studie var att tillhandahålla ett effektivt verktyg för att undersöka den neurovaskulära strukturen i hjärnskålen dura mater för CGRP-immunoreactive innervation och dess ursprung. Genom att dra nytta av den transparenta fullmonterade dura mater och kombinera immunofluorescens, bakåtsträvande spårning, konfokala tekniker och 3D-återuppbyggnad, förväntade vi oss att presentera en ny 3D-vy över den neurovaskulära strukturen i hjärnskålen dura mater. Dessa metodologiska metoder kan ytterligare tjänas för att utforska patogenesen vid olika huvudvärk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Protect from light; RRID: AB_141607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain stereotaxis instrument</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Dimension</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 1.1</td>
			<td>Software of fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogold (FG)</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>52-9400</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Microm International&#160;GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FV10-ASW 4.2a</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td>Confocal image processing software system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill</td>
			<td>Saeyang Microtech</td>
			<td>Marathon-N7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CGRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81887</td>
			<td>RRID: AB_1658411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 568</td>
			<td>Molecular&#160;Probes</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop and&#160; Illustration</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>CS6</td>
			<td>Photo editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- Fluorogold</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab153</td>
			<td>RRID: AB_90738</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>National Institutes for Food and Drug Control</td>
			<td>SCXK (JING) 2014-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>#4951PLUS-001</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing

Syftet med denna studie var att undersöka fördelningen och ursprunget av calcitonin genrelaterad peptid (CGRP)-immunoreactive sensoriska nerv fibrer av hjärnskålen dura mater med hjälp av immunofluorescens, tredimensionell (3D) återuppbyggnad och bakåtsträvande spårning teknik. Här var nervfibrerna och blodkärlen färgade med immunofluorescens och histokemi tekniker med CGRP och fluorescerande falloider, respektive. Den rumsliga korrelationen av hamburg CGRP-immuoreactive nerv fibrer och blodkärl visades av 3D återuppbyggnad. Under tiden upptäcktes ursprunget till CGRP-immunoreactive nerv fibrer genom neurala spårning teknik med fluorogold (FG) från området runt mellersta meningeal gatan (MMA) i hjärnskålen dura mater till trigeminal ganglion (TG) och massundersökning (C) dorsala rot ganglier (DRGs). Dessutom undersöktes de kemiska egenskaperna hos FG-märkta nervceller i TG och DRGs också tillsammans med CGRP med dubbla immunofluorescenser. Dra nytta av det transparenta helmonteringsprovet och 3D-rekonstruktionen visades att CGRP-immunoreaktiva nervfibrer och falloidinmärkta arterioler löper samman eller separat bildar ett hamburg neurovaskulärt nätverk i en 3D-vy, medan FG-märkta nervceller hittades i oftalmiska, maxillary och mandibular grenar av TG, samt C2-3 DRGs ipsilateral till sidan av spårämne ansökan där några av FG-märkta nervceller presenteras med CGRP-immunoreactive uttryck. Med dessa metoder visade vi de fördelningsegenskaperna hos CGRP-immunoreactive nerv fibrer runt blodkärlen i hjärnskålen dura mater, liksom ursprunget till dessa nerv fibrer från TG och DRGs. Ur metodiskt perspektiv kan det ge en värdefull referens för att förstå den komplicerade neurovaskulära strukturen hos hjärnskålen dura mater under det fysiologiska eller patologiska tillståndet.

Neurovaskulär struktur av hjärnskålen dura mater Efter immunofluorescent och fluorescerande histochemical färgning med CGRP och falloidin, CGRP-immunoreactive nerv fibrer och falloidin-märkt hamburg artärer och bindväv visades tydligt i hela mount hjärnskålen dura mater i ett 3D mönster (Figur 2C,D, E, F). Det visade sig att både tjocka och tunna CGRP-immunoreaktiva nervfibrer löper parallellt med hamburgartär...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

Här presenterar vi ett protokoll för att visualisera rumslig korrelation av calcitonin gen-relaterade peptid (CGRP)-immunoreactive nerv fibrer och blodkärl i hjärnskålen dura mater med hjälp av immunofluorescens och fluorescerande histokemi med CGRP och phalloidin, respektive. Dessutom spårades ursprunget till dessa nerv fibrer bakåtsträvande med en fluorescerande neurala spårämne.

Visualisera Calcitonin Genrelaterad peptid immunoreaktiv innervation av råtta hjärnskålen Dura Mater med immunofluorescens och neural spårning

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...

Detta protokoll kan ge en variabel metodologisk referens för att förstå den komplicerade neurovaskulära strukturen hos hjärnskålen dura mater på fysiologiska eller patologiska villkor. Dra nytta av transparent hela mount dura mater, spacial korrelationen av hamburg CGRP immunoreactive nerv fibrer och blodkärl kan visas i en 3D-vy. Efter att ha avlivat en råtta, transcardially perfused det med 100 milliliter 0,9%normal saltlösning följt av 250 till 300 milliliter 4%paraformaldehyd i 0,1 molar fosfatbuffert.När du är klar, ta bort huvudhuden och öppna skallen för att exponera dura mater och dorsala sidan av hjärnan. Dissekera hjärnskålen dura mater längs hjärnstammen till luktlampan i ett helt monteringsmönster. Skölj hjärnskålen i 0,1 molar fosfatbuffert i ungefär en minut och inkubera den i en blockerande lösning.Överför dura mater till mus anti-CGRP antikroppar över natten. Följande dag tvätta dura mater tre gånger i 0,1 molar fosfatbuffert. Inkubera dura mater i en blandad lösning av åsna anti-mus Alexa Fluor 488 sekundär antikropp och fallooidin 568 i 0,1.Molar fosfatbuffert som innehåller 1%normal åsneserum och 0,5%Triton X-100 i 1,5 timmar vid rumstemperatur. Tvätta sedan dura mater tre gånger i 0,1 molar fosfatbuffert, trimma kanterna och montera den på mikroskopbilder. Sätt på täckslipsar med 50% glycerin före observation.Avbilda hela berget dura mater med ett fluorescerande mikroskop, ta sedan bilder av CGRP immunoreaktiva nervfibrer och falloidinmärkta blodkärl i dura mater med hjälp av ett konfokalt mikroskop. Raka råttans huvud med en elektrisk rakhyvel, sätt sedan trubbiga öronstänger på råttan och placera det på stereotaxiska enheten. Placera munhållaren och applicera oftalmisk salva på ögonen.Rengör den kirurgiska sidan av huvudhuden med 75% etanol och gör ett snitt längs hårbottens mittlinje. Ta bort periosteum och muskelvävnader från skallen med steril bomullsspetsade applikatorer. Borra ett litet hål med en borrborr med en rund spetsbit på vänster parietal och temporala ben ovanför den mellersta meningealartären.Bygg en bank runt hålet med tandsilikatcement och tillsätt två mikroliter fluorblomma i hålet runt den mellersta meningealartären med en 10 mikroliter microsyringe. Täck hålet med en liten bit hemostatisk svamp. Sätt en bit paraffinfilm på hålet och försegla kanterna med benvax.Suturera såret med steril tråd. Håll råttorna i ett varmt område tills de har återhämtat sig helt. Återvänd sedan råttorna till sina burar.Efter sju överlevnad dagar, granska dessa råttor med 0,9% normala saltlösning följt av 4%paraformaldehyd i 0,1 molar fosfatbuffert. Dissekera ut TG och livmoderhalscancer en till fyra DRGs, sedan skära dem vid tjockleken 30 mikrometer på en cryostat microtome system i sagittal riktning. Och montera sektionerna på silanbelagda glasrutschbanor.Cirkla avsnitten med en histokemisk penna och inkubera dem i 30 minuter i blockeringslösning. Överför proverna till lösningen av kanin antifluor och mus anti-CGRP antikroppar och inkubera vid fyra grader Celsius över natten. Nästa dag tvätta sektionerna tre gånger i 0,1 molar fosfatbuffert.Inkubera de tvättade sektionerna i en blandad lösning av åsneantikaninen Alexa Fluor 594 och åsnans antimus Alexa Fluor 488 sekundär antikropp. Tvätta dem sedan tre gånger i 0,1 molar fosfatbuffert och applicera täckslipsar med 50% glycerin för observation. Ta bilder av fluorblomma märkta nervceller i TG och DRGs under UV-belysning med hjälp av ett fluorescerande mikroskop.Ta sedan bilder av fluorett och CGRP märkta nervceller i TG och DRGs. Efter immunofluorescent och fluorescerande histochemical färgning med CGRP och falloidin, CGRP immunoreactive nerv fibrer och falloidin märkt hamburg arterioles och bindväv var tydligt visualiserade hela berget hjärnskålen dura mater i ett 3D mönster. Både tjocka och tunna CGRP immunoreaktiva nervfibrer löper parallellt med hamburg kranskärlen runt kärlväggen eller mellan blodkärlen.Sju dagar efter fluorogold ansökan på regionen av mellersta meningeal gatan och råtta hjärnskålen dura mater, fluorogold märkta nervceller upptäcktes i TG och massundersökning DRGs på den ensidiga sidan av spårämne ansökan, som observerades direkt under UV belysning av fluorescerande mikroskopi. Fluorogold märkta nervceller hittades i alla tre grenar av TG, med högre koncentrationer på oftalmiska och maxillary divisioner och med lägre koncentrationer på mandibular divisionen. Några av fluorogold märkta nervceller observerades också i livmoderhalscancer två till tre DRGs.Dessa dubbla immunofluorescens representativa fotografier visar sensoriska nervceller i TG och DRG. De märkta nervcellerna med FG, CGRP och både FG och CGRP visualiserades av dubbla immunofluorescens. När du försöker detta protokoll, kom ihåg att dissekera ut hjärnskålen dura mater helt och klistra in den på en bild i ett helt monteringsmönster.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic Cerebellar kulturer: apoptotiska utmaningar och Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Investigating the Neural Mechanisms of Aware and Unaware Fear Memory with fMRI

Undersöka Neurala mekanismer Aware och omedveten rädsla minne med fMRI

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Optisk inspelning av suprathreshold neural aktivitet med encelliga och single-spik upplösning

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Viral spåra genetiskt definierad neurala kretsar

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic störning av neural aktivitet med laserbelysning i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Villkorlig Genetisk transsynaptisk Tracing i embryonal Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Tidsberoende ökning av nätverkssvaret till stimulering av neuronala cellkulturer på mikroelektroder

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

Förbättra tillämpningen av hög molekylvikt biotinylerade Dextran Amine för Thalamocortical projektion spåring i råtta

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Samtidiga inspelningar av kortikala lokala fältet potentialer, elektrokardiogram, Elektromyogram och andas rytm från en fritt rörliga råtta

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Detektion av 5-Hydroximetylcytosin i neurala stamceller och hjärnor av möss

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...