Name: visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing
Uploaded: 2021-01-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

Bu çalışma Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (Proje Kodu no. 2019YFC1709103; no. 2018YFC1707804) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Proje Kodu no. 81774211; no. 81774432; no. 81801561) projesi ile desteklendi.

Bu çalışma Çin Tıp Bilimleri Akademisi Akupunktur ve Moxibustion Enstitüsü Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (referans numarası D2018-09-29-1). Tüm prosedürler Ulusal Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Için Sağlık Enstitüleri Rehberi'ne uygun olarak yapılmıştır (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Bu çalışmada 12 yetişkin Sprague-Dawley erkek sıçanı (ağırlık 220 ± 20 g) kullanılmıştır. Hayvanlar [lisans numarası SCXK (JING) 2017-0005] Ulusal Gıda v...

<ol>
	<li>Kekere, V., Alsayouri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy,+Head+and+Neck,+Dura+Mater.">Anatomy, Head and Neck, Dura Mater.</a> StatPearls. , (2020).</li><li>Shimizu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+origin+of+TRPV1+receptor-containing+nerve+fibers+in+the+dura+mater+of+rat.">Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat.</a> Brain Research. 1173, 84-91 (2007).</li><li>Jacobs, B., Dussor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+contributions+to+migraine:+moving+beyond+vasodilation.">Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation.</a> Neuroscience. 338, 130-144 (2016).</li><li>Dodick, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase-by-phase+review+of+migraine+pathophysiology.">A phase-by-phase review of migraine pathophysiology.</a> Headache. 58, 4-16 (2018).</li><li>Amin, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+pathophysiological+mechanisms+of+migraine+attacks+induced+by+pituitary+adenylate+cyclase-activating+polypeptide-38.">Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38.</a> Brain: A Journal of Neurology. 137, 779-794 (2014).</li><li>Keller, J. T., Marfurt, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidergic+and+serotoninergic+innervation+of+the+rat+dura+mater.">Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).</li><li>Messlinger, K., Hanesch, U., Baumg&#228;rtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innervation+of+the+dura+mater+encephali+of+cat+and+rat:+ultrastructure+and+calcitonin+gene-related+peptide-like+and+substance+P-like+immunoreactivity.">Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity.</a> Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).</li><li>Lennerz, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+receptor-like+receptor+(CLR),+receptor+activity-modifying+protein+1+(RAMP1),+and+calcitonin+gene-related+peptide+(CGRP)+immunoreactivity+in+the+rat+trigeminovascular+system:+differences+between+peripheral+and+central+CGRP+receptor+distribution.">Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution.</a> The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).</li><li>Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+nerve+fibers+storing+CGRP+and+CGRP+receptors+in+the+peripheral+trigeminovascular+system.">Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system.</a> The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).</li><li>Xu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+distribution+of+blood+vessels+and+nerve+fibers+in+the+skin+tissues+of+acupoint+"Taichong"+(LR3)+in+the+rat.">Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat.</a> Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).</li><li>Cui, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expression+of+calcitonin+gene-related+peptide+on+the+neurons+associated+Zusanli+(ST+36)+in+rats.">The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).</li><li>Andres, K. H., von D&#252;ring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+fibres+and+their+terminals+of+the+dura+mater+encephali+of+the+rat.">Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat.</a> Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).</li><li>Leng, C., Chen, L., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+P2X1-6+receptor+expression+in+retrograde+Fluorogold-labeled+DRG+neurons+from+rat+chronic+neuropathic+pain+model.">Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model.</a> Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).</li><li>Huang, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+the+retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold+in+an+animal+optic+nerve+crush+model.">Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model.</a> Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).</li><li>Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+protective+effect+of+local+administration+of+triamcinolone+or+systemic+treatment+with+methylprednisolone+against+damages+caused+by+optic+nerve+crush+in+rats.">Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).</li><li>Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+effects+of+recombinant+human+granulocyte+colony-stimulating+factor+(G-CSF)+in+neurodegeneration+after+optic+nerve+crush+in+rats.">Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats.</a> Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).</li><li>Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+calcitonin+gene-related+peptide+in+peripheral+and+central+pain+mechanisms+including+migraine.">The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine.</a> Pain. 158 (4), 543-559 (2017).</li><li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcitonin+gene-related+peptide:+physiology+and+pathophysiology.">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li><li>Kou, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+neural+circuits+from+peripheral+afferents+to+the+spinal+cord:+possible+implications+for+diabetic+polyneuropathy+in+streptozotocin-induced+type+1+diabetic+rats.">Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).</li><li>Alarcon-Martinez, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+pericytes+express+&#945;-smooth+muscle+actin,+which+requires+prevention+of+filamentous-actin+depolymerization+for+detection.">Capillary pericytes express &#945;-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection.</a> eLife. 7, 34861 (2018).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+sensory+innervation+of+the+rat+superior+sagittal+sinus.">Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus.</a> Neuroscience. 129, 431-437 (2004).</li><li>Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+the+sensory+innervation+of+the+rat+middle+meningeal+artery.">Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery.</a> Brain Research. 1208, 103-110 (2008).</li><li>Schmued, L. C., Fallon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluoro-Gold:+a+new+fluorescent+retrograde+axonal+tracer+with+numerous+unique+properties.">Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties.</a> Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).</li></ol>

Bu çalışmada, kraniyal dura materdeki CGRP-immünoreaktif sinir liflerinin dağılımını ve kökenini, CGRP antikoru ve FG nöral izleyici ile immünofluoresans, 3D rekonstrüksiyon ve nöral izleme yaklaşımlarını kullanarak, dural nörovasküler ağı daha iyi anlamak için histolojik ve kimyasal kanıtlar sağlayarak başarıyla gösterdik.
Bilindiği gibi, CGRP migren patogenezinde kritik bir rol oynar4,17. Artan CGRP'nin v...

Kranial dura mater, beyni korumak için en dıştaki menenjit tabakasıdır ve bol miktarda kan damarı ve farklı sinir lifleri içerir1,2. Birçok çalışma, duyarlı kranial dura mater'in anormal vazodilasyon ve innervasyon içeren baş ağrısı oluşumuna yol açan anahtar faktör olabileceğini göstermiştir3,4,5. Bu nedenle, kranial dura materdeki nörovasküler yapı bilgisi, özellikle migren için baş ağrısı patogenezini anlamak için önemlidir.
Dura innervasyonu daha önce konvansiyonel immünhistokimya ile çalışılmış olsa da, kraniyal dura materdeki sinir liflerinin ve kan damarlarının mekansal korelasyonu daha az çalışılmıştır6,7,8,9. Dural nörovasküler yapıyı daha ayrıntılı olarak ortaya çıkarmak için, kalsitonin genle ilişkili peptit (CGRP) ve phalloidin, tüm mount kraniyal dura materdeki dural sinir liflerini ve kan damarlarını immünofluoresan ve floresan histokimya10ile boyamak için belirteçler olarak seçildi. Nörovasküler yapının üç boyutlu (3D) bir görünümünü elde etmek en uygun seçim olabilir. Ek olarak, florogold (FG), CGRP-immünreaktif sinir liflerinin kökenini belirlemek için kraniyal dura materinde orta meningeal arter (MMA) etrafındaki bölgeye uygulandı, trigeminal ganglion (TG) ve servikal (C) dorsal kök gangliyonlarına (DRG) kadar izlenirken, FG etiketli nöronlar immünofluoresans kullanılarak CGRP ile birlikte daha fazla incelendi.
Bu çalışmanın amacı, CGRP-immünreaktif innervasyon ve kökeni için kraniyal dura materdeki nörovasküler yapıyı araştırmak için etkili bir araç sağlamaktı. Şeffaf tam montajlı dura mater'den yararlanarak ve immünofluoresans, retrograd izleme, konfokal teknikler ve 3D rekonstrüksiyonu birleştirerek, kraniyal dura materdeki nörovasküler yapının yeni bir 3D görünümünü sunmayı bekliyorduk. Bu metodolojik yaklaşımlar, farklı baş ağrılarının patogenezini keşfetmek için daha fazla hizmet verebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>Protect from light; RRID: AB_141607</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain stereotaxis instrument</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Dimension</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 1.1</td>
			<td>Software of fluorescent microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorogold (FG)</td>
			<td>Fluorochrome</td>
			<td>52-9400</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent imaging system</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Microm International&#160;GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FV10-ASW 4.2a</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td>Confocal image processing software system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill</td>
			<td>Saeyang Microtech</td>
			<td>Marathon-N7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-CGRP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81887</td>
			<td>RRID: AB_1658411</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin 568</td>
			<td>Molecular&#160;Probes</td>
			<td>A12380</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop and&#160; Illustration</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>CS6</td>
			<td>Photo editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti- Fluorogold</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab153</td>
			<td>RRID: AB_90738</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>National Institutes for Food and Drug Control</td>
			<td>SCXK (JING) 2014-0013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>#4951PLUS-001</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing

Bu çalışmanın amacı immünofluoresans, üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon ve retrograd izleme tekniği kullanılarak kraniyal dura mater'in kalsitonin genle ilişkili peptid (CGRP)-immünoreaktif duyusal sinir liflerinin dağılımını ve kökenini incelemektir. Burada sinir lifleri ve kan damarları sırasıyla CGRP ve floresan phalloidin ile immünofluoresans ve histokrimi teknikleri kullanılarak lekelendi. Dural CGRP-immuoreaktif sinir lifleri ve kan damarlarının mekansal korelasyonu 3D rekonstrüksiyon ile gösterilmiştir. Bu arada, CGRP-immünreaktif sinir liflerinin kökeni, kraniyal dura materdeki orta meningeal arter (MMA) çevresindeki bölgeden trigeminal ganglion (TG) ve servikal (C) sırt kök gangliyonlarına (DRG) florogold (FG) ile nöral izleme tekniği ile saptandı. Ayrıca TG ve DRG'lerdeki FG etiketli nöronların kimyasal özellikleri de çift immünoflüoresans kullanılarak CGRP ile birlikte incelenmiştir. Şeffaf tam montajlı örnek ve 3D rekonstrüksiyondan yararlanarak, CGRP-immünreaktif sinir lifleri ve falloidin etiketli arteriyolların birlikte koştuğu veya 3D görünümde ayrı ayrı bir dural nörovasküler ağ oluşturduğu gösterilmiştir, FG etiketli nöronlar TG'nin oftalmik, maksiller ve mandibular dallarında bulunurken, bazı FG etiketli nöronların CGRP-immünreaktif ekspresyonla sunulduğu izleyici uygulamasının yanına C2-3 DRG'ler ipsilateral bulundu. Bu yaklaşımlarla kraniyal dura materdeki kan damarlarının etrafındaki CGRP-immünreaktif sinir liflerinin dağılım özelliklerinin yanı sıra bu sinir liflerinin kökenini TG ve DRG'lerden gösterdik. Metodoloji açısından bakıldığında, kraniyal dura mater'in fizyolojik veya patolojik durum altındaki karmaşık nörovasküler yapısını anlamak için değerli bir referans sağlayabilir.

Kranial dura mater'in nörovasküler yapısı CGRP ve phalloidin ile immünofluoresan ve floresan histokimyasal boyamadan sonra, CGRP-immünoreaktif sinir lifleri ve phalloidin etiketli dural arteriyüller ve bağ dokuları tüm mount kraniyal dura mater boyunca 3D desende açıkça gösterilmiştir (Şekil 2C,D, E,F). Hem kalın hem de ince CGRP-immünreaktif sinir liflerinin dural arteriyoküllere paralel olarak, damar d...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing at JoVE.co

Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing

Burada, sırasıyla CGRP ve phalloidin ile immünoforezan ve floresan histokmisi kullanarak kraniyal dura materdeki kalsitonin genle ilişkili peptid (CGRP)-immünoreaktif sinir lifleri ve kan damarlarının mekansal korelasyonunu görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz. Ek olarak, bu sinir liflerinin kökeni floresan bir nöral izleyici ile retrograd izlenmiştir.

Sıçan Kraniyal Dura Mater'in Kalsitonin Geni ile İlgili Peptid İmmünoreaktif Innervasyonunun İmmünofluoresans ve Nöral İzleme ile Görselleştirilmesi

The aim of this study was to examine the distribution and origin of the calcitonin gene-related peptide (CGRP)-immunoreactive sensory nerve fibers of the ...

Bu protokol, kraniyal dura mater'in fizyolojik veya patolojik durumdaki karmaşık nörovasküler yapısını anlamak için değişken bir metodolojik referans sağlayabilir. Şeffaf tüm mount dura mater'den yararlanarak, dural CGRP immünreaktif sinir liflerinin ve kan damarlarının spasiyal korelasyonu 3D görünümde gösterilebilir. Bir sıçanı ötenazi yaptıktan sonra, transkardiyal olarak 100 mililitre% 0.9 normal salin ile perfüzyon ve ardından 0.1 molar fosfat tamponunda% 4 paraformaldehitin 250 ila 300 mililitresi ile perfüzyon.Bittiğinde, kafa derisini çıkarın ve beynin dura mater ve dorsal tarafını ortaya çıkarmak için kafatasını açın. Beyin sapı boyunca kranial dura mater'i koku ampulüne bütün bir montaj deseninde parçalara ayırın. Kranial dura mater'i 0,1 molar fosfat tamponunda yaklaşık bir dakika durulayın ve bir engelleme çözeltisinde kuluçkaya yatırın.Dura mater'i bir gecede fare anti-CGRP antikoruna aktarın. Ertesi gün, dura mater'i 0.1 molar fosfat tamponunda üç kez yıkayın. Dura mater'i eşek anti-fare Alexa Fluor 488 ikincil antikor ve 0.1'de phalloidin 568 karışık bir çözeltide kuluçkaya yatırın.Oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca %1 normal eşek serumu ve %0,5 Triton X-100 içeren molar fosfat tamponu. Ardından, dura mater'i 0,1 molar fosfat tamponunda üç kez yıkayın, kenarları kırpın ve mikroskop slaytlarına monte edin. Gözlemden önce% 50 gliserin ile kapak kaymaları koyun.Tüm mount dura mater'i floresan mikroskopla görüntüleyin, ardından konfokal mikroskop kullanarak dura mater'deki CGRP immünoreaktif sinir liflerinin ve phalloidin etiketli kan damarlarının görüntülerini çekin. Farenin kafasını elektrikli bir jiletle tıraş edin, sonra sıçana künt kulak çubukları koyun ve stereotaksik cihaza yerleştirin. Ağız tutucuyu yerleştirin ve gözlere oftalmik merhem uygulayın.%75 etanol kullanarak baş derisinin cerrahi tarafını temizleyin ve kafa derisinin orta çizgisi boyunca bir kesi yapın. Steril pamuk uçlu aplikatörler kullanarak periosteum ve kas dokularını kafatasından açıkça çıkarın. Orta meningeal arterin üzerindeki sol parietal ve temporal kemiklerde yuvarlak uçlu bir çapak matkabı kullanarak küçük bir delik açın.Diş silikat çimentosu ile deliğin etrafına bir banka inşa edin ve orta meningeal arter etrafındaki deliğe 10 mikrolitre mikrosihal ile iki mikrolitre florogold ekleyin. Deliği küçük bir hemostatik sünger parçasıyla kapatın. Deliğe bir parça parafin filmi koyun ve kenarları kemik balmumu ile kapatın.Yarayı steril iplikle dikin. Sıçanları tamamen iyileşene kadar sıcak bir alanda tutun. O zaman fareleri kafeslerine geri götür.Yedi sağkalım gününden sonra, bu sıçanları% 0.9 normal salin ile perfüzyon ve ardından 0.1 molar fosfat tamponunda% 4 paraformaldehit. TG ve servikal bir ila dört DRG'yi parçalara bölün, ardından sagittal yönde bir kriyostat mikrotom sistemi üzerinde 30 mikrometre kalınlığında kesin. Ve bölümleri silane kaplı cam slaytlara monte edin.Bölümleri histokimyasal bir kalemle daire içine edin ve blokaj çözeltisinde 30 dakika kuluçkaya bırakın. Örnekleri tavşan anti-florogold ve fare anti-CGRP antikor çözeltisine aktarın ve bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, bölümleri 0.1 molar fosfat tamponunda üç kez yıkayın.Yıkanmış bölümleri eşek anti-tavşan Alexa Fluor 594 ve eşek anti-fare Alexa Fluor 488 ikincil antikor karışık bir çözelti içinde kuluçkaya. Daha sonra bunları 0,1 molar fosfat tamponunda üç kez yıkayın ve gözlem için% 50 gliserin ile kapak kaymaları uygulayın. Floresan mikroskop kullanarak UV aydınlatması altında TG ve DRG'lerdeki florgöl etiketli nöronların görüntülerini çekin.Daha sonra, TG ve DRG'lerde florogold ve CGRP etiketli nöronların görüntülerini yakalayın. CGRP ve phalloidin ile immünofluoresan ve floresan histokimyasal boyamadan sonra, CGRP immünoreaktif sinir lifleri ve phalloidin etiketli dural arteriyüller ve bağ dokuları tüm mount cranial dura mater boyunca 3D bir desende net bir şekilde görselleştirildi. Hem kalın hem de ince CGRP immünreaktif sinir lifleri, damar duvarı etrafındaki veya kan damarları arasındaki dural arteriyellere paralel olarak çalışır.Orta meningeal arter ve sıçan kranial dura mater bölgesinde florogold uygulamasından yedi gün sonra, florgöl etiketli nöronlar, florgöl etiketli nöronlar, florgöl etiketli nöronlar, florgöllü mikroskopinin UV aydınlatması altında doğrudan gözlenen izleyici uygulamasının ipsilateral tarafında TG ve servikal DRG'lerde tespit edildi. Florogold etiketli nöronlar, oftalmik ve maksiller bölümlerde daha yüksek konsantrasyonlarda ve mandibular bölünmede daha düşük konsantrasyonlarda TG'nin üç dalında da bulundu. Florogold etiketli nöronların bir kısmı da servikal iki ila üç DRG'de gözlendi.Bu çift immünoresans temsili fotoğraflar TG ve DRG'de duyusal nöronları göstermektedir. FG, CGRP ve hem FG hem de CGRP ile etiketlenmiş nöronlar çift immünoresans ile görselleştirildi. Bu protokolü denerken, kranial dura mater'i tamamen parçalamayı ve bütün bir montaj deseninde bir slayta yapıştırma unutmayın.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Investigating the Neural Mechanisms of Aware and Unaware Fear Memory with fMRI

FMRI ile Aware ve habersiz Korku Bellek Nöral Mekanizmalar araştırılması

Pavlovian fear conditioning is often used in combination with functional magnetic resonance imaging (fMRI) in humans to investigate the neural substrates ...

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Tek hücreli ve tek başak çözünürlüğe sahip supratreshold nöral aktivitenin Optik kaydı

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Yarı sağlam Lazer Aydınlatma ile Sinir Faaliyet optogenetic Pertürbasyon<em&gt; Drosophila</emMotion&gt; Larva

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Mikro Elektrod Dizilerinde Nöronal Hücre Kültürlerinin Uyarılmasına Ağ Yanıtına Zamana Bağlı Artış

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

Yüksek molekül ağırlıklı Biotinylated Dextran Amin uygulama içinde sıçan izleme Thalamocortical projeksiyon için geliştirmek

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Simultaneous Recordings of Cortical Local Field Potentials, Electrocardiogram, Electromyogram, and Breathing Rhythm from a Freely Moving Rat

Kortikal yerel alan potansiyelleri, Elektrokardiyogram, Electromyogram ve ritim serbestçe hareket bir sıçan gelen nefes eşzamanlı kayıt

Monitoring the physiological dynamics of the brain and peripheral tissues is necessary for addressing a number of questions about how the brain controls ...

The Detection of 5-Hydroxymethylcytosine in Neural Stem Cells and Brains of Mice

Farelerin Nöral Kök Hücreleri ve Beyinlerinde 5-Hidroksimetilsitozozin Insaptama

Multiple&#160;DNA modifications have been identified in the mammalian genome. Of that, 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine-mediated epigenetic ...