Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

نود أن نشكر المرافق الأساسية لقياس التدفق الخلوي في جامعة أوتاوا ومركز كينان للأبحاث للعلوم الطبية الحيوية (KRC) ومستشفى سانت مايكلز يونيتي هيلث تورونتو على خبرتهم وتوجيهاتهم في تحسين بروتوكول قياس التدفق الخلوي / FACS المقدم في هذه المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل صندوق الأدوية من قبل صندوق تصميم الأفكار الجديدة 2018 (MbDNI-2018-01) إلى JB.

يجب أن يحصل المحققون الذين يجرون هذا البروتوكول على إذن من مجلس أخلاقيات الحيوان المحلي / لجنة الرعاية. تمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية من قبل لجنة رعاية الحيوان في مستشفى سانت مايكل يونيتي تورونتو (ACC # 918) وأجريت وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعها المجلس الكندي لرعاية الحيوان (CCAC). ?...

يعد بروتوكول عزل FAPs الأمثل والمعتمد لعضلات الفئران ضروريا للباحثين الذين يرغبون في دراسة نماذج الإصابات غير الممكنة في الماوس لأسباب بيولوجية أو تقنية. على سبيل المثال، الفئران ليست نموذجا حيوانيا أمثل لدراسة الإصابات المحلية المزمنة، أو العصبية مثل إزالة النرجيل على المدى الطويل. بيول...

خلايا السلف الليفية الدهنية (FAPs) هي مجموعة من الخلايا السلف المقيمة متعددة القدرات في العضلات الهيكلية التي تلعب دورا حاسما في التوازن العضلي والإصلاح والتجديد ، وعلى العكس من ذلك ، تتوسط أيضا الاستجابات المرضية لإصابة العضلات. وكما يوحي الاسم، تم تحديد FAPs في الأصل كجهاز ذري مع إمكانية التفريق إلى الخلايا الليفية والخلايا الدهنية1 وكان يزعم أنها الوسيط الرئيسي لتسلل العضلات الدهنية الليفية في الإصابات المزمنة والمرض. وكشفت دراسة أخرى أن FAPs هي بالإضافة إلى ذلك قادرة على تكوين العظام وchondrogenesis2,3,4. وهكذا ، فهي أكثر على نطاق واسع في الأدب كما mesenchymal أو السلف سترومال3،5،6،7،8. في إصابة العضلات الهيكل العظمي الحادة, FAPs المساعدات بشكل غير مباشر في تكوين عضلي التجديدية من خلال الانتشار عابر لتوفيربيئةمواتية لخلايا الأقمار الصناعية العضلات المنشطة وسلفهم المصب myogenic (أعضاء البرلمان) نظرائهم 1,9,10. بالتوازي مع التجديد الناجح ، تخضع FAPs لداء الخلايا المبرمج ، مع إعادة أعدادها إلى مستويات خط الأساس1و9و10و11. في المقابل، في إصابة العضلات المزمنة، FAPs تجاوز إشارات الموالية أبوتوبوتيك، مما يؤدي إلى استمرارها9،10،11 وإصلاح العضلات غير طبيعية.
في دراسات الجسم الحي تقييم الآليات الخلوية والجزيئية التي FAPs التوسط استجابات العضلات استخدمت نماذج مورين حتى الآن1،7،9،10،11،12،13،14. في حين أن الفئران المعدلة وراثيا هي أدوات قوية للاستخدام في هذه التحليلات ، فإن صغر حجم الحيوان يحد من توافر الأنسجة للدراسة في نماذج الإصابات المترجمة على المدى الطويل حيث يمكن أن يكون ضمور العضلات عميقا ، مثل الحرمان الرضي. وعلاوة على ذلك، يتطلب قياس قوة العضلات والوظيفة البدنية قياسات الجسم الحي السابق أو في الموقع التي تتطلب إنهاء الماوس، أو في أساليب الجسم الحي التي تتطلب عملية جراحية و / أو مخدر عام للسماح بتقييم أداء العضلات تقلص15،16،17،18،19،20 . في الفئران، والتحقق من صحة جيدا وتستخدم عالميا التحليلات الوظيفية العضلات، بالإضافة إلى تحليلات للسلوكيات الحركية أكثر تعقيدا مثل تحليل مشية (على سبيل المثال، مؤشر وظيفة الوركي، تحليل CatWalk) موجودة ويتم تنفيذها في الحيوانات مستيقظا وتتحرك تلقائيا21،22،23،24 . هذا بالإضافة إلى ذلك يحسن مبادئ الحد الأدنى من المراضة في التجارب على الحيوانات، وأعداد الحيوانات البحثية المستخدمة. وبالتالي يوفر الجرذ المحقق FAPs المرونة المضافة من حجم العضلات المصابة أكبر لتحليل البروتين والخلوية والقدرة على إجراء تقييمات تسلسلية للنشاط الوظيفي الثابت والديناميكية المعقدة العضلات والسلوكيات، في الحيوان التنبيه.
وقد تم تحديد FAPs في المقام الأول وعزلها عن عينات العضلات الكاملة باستخدام قياس التدفق الخلوي وفرز الخلايا المنشطة بالفلورسينس (FACS) على التوالي. هذه هي المقايسات المستندة إلى الليزر التي هي قادرة على تحديد مجموعات خلايا محددة متعددة على أساس ميزات مميزة مثل الحجم، والحبيبة، ومزيج معين من سطح الخلية أو علامات داخل الخلايا25. هذا مفيد للغاية في دراسة نظام الأعضاء مثل العضلات الهيكلية ، حيث أن التوازن والتجديد معقدان ، وعمليات متعددة العوامل ينسقها عدد كبير من أنواع الخلايا. حددت دراسة أساسية FAPs، فضلا عن أعضاء البرلمان، وذلك باستخدام أساليب تدفق القياسات الخلوية في العضلات الهيكل العظمي الماوس1. وأظهروا أن FAPs هي mesenchymal في الطبيعة، لأنها تفتقر إلى مستضدات سطحية خاصة بالخلايا من أصول البطانية (CD31)، والهيماتوبوليتيك (CD45)، أو الميوجينيك (Integrin-α7 [ITGA7])، ولكنها أعربت عن علامة الخلايا الجذعية المتوسطة Sca-1 (مستضد الخلايا الجذعية1) 1 وتباينت في الخلايا الليفية والخلاعية في الثقافة. وأظهرت دراسات أخرى العزلة الناجحة من السلف المتوسطة في العضلات على أساس التعبير عن علامة الخلايا الجذعية البديلة, مستقبلات عامل النمو المستمدة من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRα)2,7,8 وكشف مزيد من التحليل هذه من المرجح أن تكون نفس مجموعة الخلايا كما FAPs3. يتم تحديد FAPs الآن بشكل شائع في قياس التدفق الخلوي باستخدام Sca-1 أو PDGFRα كعلامة اختيارإيجابية 1و9و10و11و12و13و14و26و27و28و29و30و31 . استخدام PDGFRα هو تفضيلي للأنسجة البشرية ومع ذلك، كما هواة الإنسان المباشر من مورين سكا-1 لم يتم تحديد32. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن بروتينات سطح الخلية الأخرى كعلامات لأعضاء البرلمان (على سبيل المثال، VCAM-1)، وتوفير بديل محتمل ل ITGA7 كمؤشر على خلايا النسب الميوجيني خلال عزلة FAPs33.
في حين تدفق قياس الخلايا / FACS هو منهجية قوية لدراسة دور والإمكانات المسببة للأمراض من FAPs في العضلات الهيكل العظمي1،9،10،11،13،29، فإنه يقتصر من الناحية الفنية من خلال خصوصية والتحسين من الكواشف المطلوبة. منذ تحديد تدفق الخلايا والعزلة من ال FAPs وقد وضعت وأجريت في نماذج الماوس1،9،10،11،29، وهذا يطرح تحديات للباحثين الذين يرغبون في دراسة FAPs في الكائنات الحية نموذج آخر. تختلف العديد من العوامل - مثل الحجم الأمثل للأنسجة التي سيتم معالجتها ، وكذلك خصوصية و / أو خصوصية الأجسام المضادة وتوافرها - اعتمادا على الأنواع المستخدمة.
بالإضافة إلى الحواجز التقنية لدراسة FAPs في نموذج حيواني جديد ، فقد تمت دراستها إلى حد كبير في بيئة حادة وسامة - عادة عن طريق الحقن الكيميائي العضلي أو سم القلب. يقتصر تقييم الديناميكيات طويلة الأجل ل FAPs في المقام الأول على التقييم في ضمور العضلات في دوشين ، باستخدام نموذج الماوس mdx9،10،11، ونماذج من إصابة العضلات المركبة مثل تمزق الكفة الدوارة الضخم حيث يتم إجراء تحويل الوتر المتزامن واستئصال النرجيل على عضلات الكتف26،27،28 . استجابة FAPs للإهانة الوحيدة من الحرمان من الصدمة المزمنة ، وهو أمر شائع في حوادث مكان العمل في الصناعة الثقيلة والزراعة ، وفي صدمات الولادة (إصابة الضفيرة العضدية)34،35،36،37 مع اعتلال كبير ، لم تكن مميزة بشكل جيد ، وغالبا ما تقتصر على إطار زمني قصير الأجل11،38.
نحن نصف طريقة لتحديد وعزل FAPs والنواب من العضلات الهيكلية الصحية وكذلك الضمورة والليفية بشدة في الفئران. أولا، يتم إثبات تحديد CD31-/CD45-/SCA-1+/VCAM-1- FAPs وCD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ أعضاء البرلمان باستخدام هضم الأنسجة وتدفق بروتوكول تلطيخ قياس الخلايا ويتم التحقق اللاحق من النتائج التي توصلنا إليها من خلال الثقافة والتلوين الكيميائي المناعي للخلايا المعزولة من FACS. باستخدام هذه الطريقة ، ونحن أيضا تقرير رواية FAPs الوقت بالطبع في نموذج إصابة denervation معزولة على المدى الطويل في الفئران.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

البروبونات الدهنية الليفية (FAPs) هي خلايا الخلالي المقيم في العضلات الهيكلية التي، جنبا إلى جنب مع السلف العضلية (أعضاء البرلمان)، تلعب دورا رئيسيا في التوازن العضلي، والإصابة، وإصلاح. وقد أجريت البروتوكولات الحالية لتحديد ال FAPs وعزل استخدام قياس التدفق الخلوي / تفرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) والدراسات التي تقيم وظيفتها في الجسم الحي حتى الآن حصريا في الفئران. يسمح الحجم المتأصل الأكبر للفئران بإجراء تحليل أكثر شمولا ل FAPs في نماذج إصابات العضلات الهيكلية ، خاصة في العضلات الضمورية الشديدة أو عندما يحتاج المحققون إلى كتلة أنسجة كبيرة لإجراء فحوصات متعددة في المصب. يوفر الجرذ بالإضافة إلى ذلك مجموعة أكبر من المقايسات الوظيفية العضلية التي لا تتطلب التخدير الحيواني أو التضحية ، وبالتالي تقليل المراضة واستخدام الحيوانات من خلال تمكين التقييمات التسلسلية. وبروتوكولات قياس التدفق الخلوي/مركبات الكربون الهيدروفلورية المحسنة للفئران هي أنواع محددة، يحد منها بشكل خاص خصائص الأجسام المضادة المتاحة تجاريا. لم يتم تحسينها لفصل FAPs من الفئران أو العضلات الليفية للغاية. تم تطوير بروتوكول قياس التدفق الخلوي / FACS لتحديد وعزل FAPs و أعضاء البرلمان من كل من العضلات الهيكلية للفئران الصحية وإزالة النرفع ، بالاعتماد على التعبير التفاضلي للعلامات السطحية CD31 و CD45 و Sca-1 و VCAM-1. كما الفئران محددة، تدفق الأجسام المضادة الأولية التحقق من صحة قياس الخلايا محدودة للغاية، تم إجراء اقتران في المنزل من الأجسام المضادة التي تستهدف Sca-1. وباستخدام هذا البروتوكول، تأكد نجاح اقتران Sca-1، وتم التحقق من صحة تحديد التدفق الخلوي ل FAPs و أعضاء البرلمان من خلال زراعة الخلايا والتلطخ المناعي ل FACS المعزولة من أعضاء البرلمان. وأخيرا ، فإننا تقرير رواية FAPs الوقت بالطبع في فترة طويلة (14 أسبوعا) نموذج denervation الفئران. توفر هذه الطريقة للمحققين القدرة على دراسة FAPs في نموذج حيواني جديد.

تحديد FAPs والنواب عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام لوحة الأجسام المضادة الجديدة بما في ذلك Sca-1 و VCAM-1 وتستند استراتيجية gating لتحديد FAPs في عضلة الفئران على بروتوكولات قياس التدفق الخلوي في الماوس29، والتي بوابة على CD31 (البطانية) وCD45 (الهيم...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

يحدد هذا البروتوكول طريقة لعزل السلف الليفية الدهنية (FAPs) والذريات العضلية المنشأ (أعضاء البرلمان) من عضلات الهيكل العظمي للفئران. استخدام الفئران في نماذج إصابة العضلات يوفر زيادة توافر الأنسجة من العضلات الضمرة للتحليل وذخيرة أكبر من الأساليب المعتمدة لتقييم قوة العضلات ومشية في الحيوانات الحرة الحركة.

تحديد وعزل وتوصيف السلف الليفية الشحمية (FAPs) والذرى العضلية المنشأ (أعضاء البرلمان) في العضلات الهيكلية في الجرذ

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

كما FAPs هي وسطاء لتجديد العضلات والتليف المرضي، بروتوكولنا يسمح لتوصيف ديناميات FAP آخر إصابة العضلات وعزل FAPs للدراسات في المختبر أو الجسم الحي السابق. وحتى الآن، أجريت دراسات حصرا على ال FAPs المعزولة عن الفئران. بروتوكولنا يتيح العزل الفعال للFAPs من الفئران أكبر، وتوفير توافر الأنسجة أكبر بكثير لالفراعات المصب.يمكن أن يؤثر وقت معالجة الأنسجة المطول سلبا على صلاحية FAPs. إذا تم معالجة عينات متعددة في وقت واحد، فمن المستحسن أن اثنين من المشغلين تنفيذ البروتوكول جنبا إلى جنب لتحقيق أقصى قدر من صلاحية الخلية المعزولة. ابدأ بوضع أنسجة العضلات المحصودة في طبق زراعة خلايا معقم طوله 10 سنتيمترات.المسيل للدموع بلطف و فرم الأنسجة مع ملقط وإزالة النسيج الضام للحصول على ما يقرب من ثلاثة إلى أربعة ملليمتر قطع مكعبات. نقل الأنسجةمنستر إلى أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر تحتوي على ستة ملليلتر من DMEM و 1٪ البنسلين-streptomycin. بعد ذلك، قم بتنشيط 365 ميكرولتر من محلول كولاجيناز II بإضافة 10 ميكرولترات من محلول كلوريد الكالسيوم 300 ملليمولار.أضف محلول الكولاجيناز II المنشط إلى ملاط الأنسجة لتركيز نهائي قدره 250 وحدة لكل ملليلتر. احتضان الأنابيب في شاكر لمدة ساعة واحدة وعلى 37 درجة مئوية في 240 × ز مع الانفعالات اليدوية كل 15 دقيقة لطرد الأنسجة انضمت إلى جانب الأنبوب. بعد ساعة واحدة من الحضانة، أضف 100 ميكرولتر من الكولاجينز الثاني و50 ميكرولتر من التفكيك إلى العينة.ثم، عينات ماصة 15 إلى 20 مرة مع ماصة المصلية حتى الحل هو متجانسة. احتضان العينة مرة أخرى لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 240 × ز مع الانفعالات اليدوية كل 15 دقيقة. قص عينات محلول العضلات ببطء من خلال حقنة 20 ملليلتر مع إبرة قياس 20 لمدة 10 دورات.ثم ضع مصفاة خلايا 40 ميكرون على أنبوب مخروطي معقم 50 ملليلتر ورطب عن طريق أنابيب خمسة ملليلترات من DMEM تكملها 10٪ FBS و 1٪ البنسلين-ستريبتوميسين. ماصة العينة ملليلتر واحد في وقت واحد من خلال مصفاة. بمجرد تصفية العينة بأكملها ، اغسل مصفاة الخلايا مع DMEM المكملة بنسبة 10٪ FBS و 1٪ البنسلين -streptomycin ليصل إجمالي حجم العينة إلى 25 ملليلتر.تقسيم حجم العينة بالتساوي إلى أنبوبين مخروطيين 15 ملليلتر والطرد المركزي في 15 درجة مئوية، 400 × ز لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي، يستنشق الناطق الخارق ويعاد إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من حاجز تحلل RBC في درجة حرارة الغرفة لمدة سبع دقائق. ثم أضف تسعة ملليلترات من مخزن الغسيل المؤقت ليصل الحجم إلى 10 ملليلترات وأجهزة طرد مركزي عند 15 درجة مئوية، 400 × غرام لمدة 15 دقيقة.بعد الطرد المركزي، يستنشق الفائقة وإعادة إنفاق بيليه في ملليلتر واحد من العازلة غسل. نقل حجم مناسب من الخلايا إلى أنبوب طرد دقيق منفصل 1.5 ملليلتر ومزجه مع صبغة زرقاء تريبان. عد الخلايا الحية على المجهر الخفيف باستخدام مقياس الدم.بالنسبة لقياس التدفق الخلوي، قم بنقل 1 إلى 2 مليون خلية لكل عينة تجريبية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق معقم 1.5 ملليلتر. جلب حجم العينة إلى ملليلتر واحد مع عازلة غسل، ووضع الأنبوب على الجليد. إعداد كافة عناصر التحكم للتجربة.لضوابط الخلية، aliquot 500، 000 إلى 1 مليون خلية في ملليلتر واحد من العازلة غسل في أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر ووضعه على الجليد. إذا كان يجري إجراء التجربة للمرة الأولى، ينبغي أيضا أن تدرج تعليق خلية واحدة ملطخة. لإعداد عناصر التحكم في الخرز، أضف حوالي 150,000 حبة تعويض إيجابية إلى كل أنبوب طرد مركزي يحمل علامة 1.5 ملليلتر.قم بإعداد التحكم في قابلية البقاء عن طريق نقل نصف حجم الخلية من أنبوب الجدوى لتحديث أنبوب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر المسمى ميت. احتضان الأنبوب الميت في 65 درجة مئوية لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق، ثم وضعه على الجليد. بعد الحضانة، أعد الخلايا الميتة إلى أنبوب البقاء.الطرد المركزي تعليق خلية واحدة، بما في ذلك عينات تجريبية والتحكم في 500 × ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، وإعادة تعليق الكريات الخلية في 100 ميكرولتر من العازلة غسل بعد أسبيراتينغ supernatant. إضافة الأجسام المضادة وفقا للسيطرة أو حالة تجريبية، ونفض الغبار بلطف العينة لضمان الاختلاط الكامل. ثم، احتضانهم على الجليد في الظلام لمدة 15 دقيقة.للحصول على تعويض الخرز، واحتضان أنبوب في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 15 دقيقة. جلب حجم كل عينة إلى ملليلتر واحد عن طريق إضافة 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت للغسيل إلى تعليق خلية واحدة، و 900 ميكرولتر من PBS للحصول على تعويض عناصر التحكم حبة. أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية واحدة في 500 × ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق، وضوابط حبة التعويض في 300 × ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.بعد الطرد المركزي للعينات، يستنشق الفائقة وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 300 ميكرولتر من العازلة غسل، والخرز الضوابط في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني و 150،000 حبة تعويض سلبي. الحفاظ على عينات الخلية على عينات الثلج والخرز في درجة حرارة الغرفة تحت رقائق الألومنيوم. المضي قدما في اكتساب قياس التدفق الخلوي من خلال وضع استراتيجية gating لتحديد السلف الليفية الدهنية والذرى الميوجينية.في التحليل التمثيلي ، تم تأكيد اقتران ناجح للأجسام المضادة Sca-1 APC مع تلطيخ واحد من حبات التعويض وتعليق الخلايا المتولدة عن عضلة المعدة والأمعاء الجرذ السليمة. تم تبليك خمسة تركيزات مختلفة من Sca-1 APC على تعليق خلية واحدة ، وتم تحديد التركيز الأمثل للأجسام المضادة استنادا إلى أكبر كثافة مضان مع الحد الأدنى من تلطيخ الخلفية. تم إجراء تحديدات التدفق الخلوي ل FAPs و أعضاء البرلمان في gastrocnemius الفئران باستخدام استراتيجية gating هو مبين هنا.تم فتح بوابات العينات لأول مرة لاستبعاد الحطام في عد الخرز. ثم تم بوابات الخلايا لاستبعاد doublets من قبل كل من الخصائص التشتت الأمامية والجانبية المتناثرة. تم تقييم صلاحية الخلايا الناتجة عن طريق التلطيخ مع SYTOX Blue.تم تقييم SYTOX Blue المفردات السالبة لCD31 و CD45 لاستبعاد لين + كسور. تم تقييم سكان لين. تم تعيين الخلايا التي كانت إيجابية واحدة لSca-1 FAPs ، وتم تعيين الخلايا التي كانت إيجابية واحدة لVCAM-1 أعضاء البرلمان.مع وجود نقص المناعة مباشرة بعد الفرز ، أظهر السكان المعزولون حديثا من FAPs تلطيخا إيجابيا ل PDGFRalpha دون أي تلوث من قبل الخلايا الإيجابية Pax7. على العكس من ذلك ، فإن السكان فرزها من أعضاء البرلمان ملطخة إيجابية لP PAX7 مع عدم وجود خلايا PDGFRalpha إيجابية. أظهرت FAPs الخلايا الليفية والخلايا الدهنية المتمايزة في اليوم 12 في وسائط التمايز الدهنية مع التعبير عن البروتين الخاص بالخلايا الليفية 1 وبيريليبين 1 ، على التوالي.كان وجود الدهون الثلاثية والدهون المحايدة من الخلايا الدهنية الناضجة واضحا مع تلطيخ الزيت الأحمر O. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت FAPs وجود الكولاجين من النوع الأول وعدم وجود خلايا الخلايا العضلية الملوثة. أظهر أعضاء البرلمان الذين يزرعون في وسائل الإعلام التمايز العضلي في اليوم 12 وجود الخلايا العضلية الناضجة وانصهرت myotubes متعددة النوى، وكانت واضحة من الخلايا الليفية وتلوث الخلايا الدهنية.عند استخدام هذه التقنية لعزل الخلايا الحية للثقافة على المدى الطويل، يجب على الباحثين التأكد من استخدام تقنية العقيم مع العمل في وقت واحد بكفاءة لضمان بقاء الخلايا الجيدة.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

تحديد وتحليل الأسلاف محمر ماوس باستخدام CD71/TER119 التدفق cytometric الفحص

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

والفحص الكمية للأنسولين ، معربا عن الأسلاف لتشكيل مستعمرة

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

إجراءات الجرذ<em&gt; في الموقع</em&gt; خصائص العضلات الهيكلية مقلص

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

العزلة والثقافة الأساسي في الخلايا الكبدية الجرذ

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

تقييم الكالسيوم سباركس السليمة في ألياف العضلات الهيكلية

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

عزل السلف ميغاكاريوسيت الماوس

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...