Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

我们要感谢渥太华大学的流式细胞术核心设施和基南生物医学科学研究中心（KRC），多伦多圣迈克尔斯医院Unity Health在优化本手稿中介绍的流式细胞术/ FACS方案方面的专业知识和指导。这项工作由医学设计新想法2018年基金（MbDNI-2018-01）资助给JB。

执行该协议的调查人员必须获得当地动物伦理委员会/护理委员会的许可。所有动物工作均由圣迈克尔医院团结健康多伦多动物护理委员会（ACC #918）批准，并根据加拿大动物护理委员会（CCAC）制定的指导方针进行。流式细胞术方案的示意图如图 1所示。如果下游应用是FACS和随后的细胞培养，则应使用适当的无菌技术完成所有步骤。
1. 肌肉收割
<ol><li>?...

对于希望研究由于生物学或技术原因在小鼠中不可行的损伤模型的研究人员来说，针对大鼠肌肉的优化，经过验证的FAPs分离方案至关重要。例如，小鼠不是研究慢性局部或神经退行性损伤（如长期去神经支配）的最佳动物模型。从生物学上讲，小鼠的短寿命和快速衰老使得由于衰老混杂因素的去神经支配而难以准确描绘肌肉特征。从技术角度来看，由于严重萎缩导致的肌肉质量急剧减少不足以进...

纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中常驻的多能祖细胞群，在肌肉稳态，修复和再生中起关键作用，相反，还介导对肌肉损伤的病理反应。顾名思义，FAPs最初被确定为具有分化成成纤维细胞和脂肪细胞1的潜力的祖细胞群体，并且据称是慢性损伤和疾病中骨骼肌纤维脂肪浸润的关键介质。进一步的研究表明，FAPs还具有成骨和软骨形成2，3，4的能力。因此，它们在文献中被更广泛地标记为间充质或基质祖3，5，6，7，8。在急性骨骼肌损伤中，FAPs通过短暂增殖间接帮助再生肌生成，为激活的肌肉卫星细胞及其下游肌原祖（MPs）对应物1，9，10提供有利的环境。在成功再生的同时，FAPs经历凋亡，使其数量恢复到基线水平1，9，10，11。相反，在慢性肌肉损伤中，FAPs会覆盖促凋亡信号，这导致它们持续存在9，10，11和异常的肌肉修复。
评估FAPs介导肌肉反应的细胞和分子机制的体内研究利用了迄今为止的小鼠动物模型1，7，9，10，11，12，13，14。虽然基因工程小鼠是用于这些分析的强大工具，但动物的小尺寸限制了在长期局部损伤模型中研究的组织可用性，其中肌肉萎缩可能是深刻的，例如创伤性去神经支配。此外，肌肉力量和身体功能的测量需要需要终止小鼠的离体或原位测量，或需要手术和/或全身麻醉的体内方法，以评估肌肉收缩性能15，16，17，18，19，20.在大鼠中，除了对更复杂的运动行为（例如步态分析，例如坐骨神经痛功能指数，CatWalk分析）的分析之外，还存在经过良好验证和全球利用的肌肉功能分析，并在清醒和自发移动的动物中进行21，22，23，24.这还优化了动物实验中最低发病率的原则，以及使用的研究动物的数量。因此，大鼠为FAPs研究者提供了更大的损伤肌肉体积的灵活性，用于蛋白质和细胞分析，并且能够对警觉动物中的肌肉复合物静态和动态功能活动和行为进行连续评估。
FAPs主要分别使用流式细胞术和荧光激活细胞分选（FACS）从全肌肉样品中鉴定和分离。这些是基于激光的测定，能够根据特征特征（例如大小，粒度以及细胞表面或细胞内标记物的特定组合）鉴定多个特定细胞群25。这在骨骼肌等器官系统的研究中非常有利，因为稳态和再生是由大量细胞类型协调的复杂多因素过程。一项开创性的研究确定了FAPs以及MP，在小鼠骨骼肌中使用流式细胞术方法1。他们证明FAPs本质上是间充质的，因为它们缺乏来自内皮（CD31），造血（CD45）或肌源性（整合素-α7 [ITGA7]）起源的细胞特异性的表面抗原，但表达间充质干细胞标志物Sca-1（干细胞抗原1）1并在培养物中分化成纤维化和脂肪生成细胞。其他研究表明，基于替代干细胞标志物，血小板衍生的生长因子受体α（PDGFRα）2，7，8的表达，成功分离肌肉间充质祖细胞，进一步的分析显示这些可能与FAPs3相同。FAPs现在通常在流式细胞术中使用Sca-1或PDGFRα作为阳性选择标记物1，9，10，11，12，13，14，26，27，28，29，30，31.PDGFRα的使用对人体组织是首选的，然而，作为小鼠Sca-1的直接人类同系物尚未被鉴定32。此外，其他细胞表面蛋白已被报道为MP的标志物（例如，VCAM-1），为ITGA7提供了一种潜在的替代方案，作为FAPs分离期间肌源谱系细胞的指标33。
虽然流式细胞术/FACS是研究FAPs在骨骼肌1、9、10、11、13、29中的作用和致病潜力的强大方法，但它在技术上受到其所需试剂的特异性和优化的限制。由于流式细胞术鉴定和分离FAPs已经在小鼠动物模型1、9、10、11、29中得到开发和进行，这给希望在其他模式生物中研究FAPs的研究人员带来了挑战。许多因素 - 例如要处理的最佳组织尺寸，以及试剂和/或抗体特异性和可用性 - 因所用物种而异。
除了在新型动物模型中研究FAPs的技术障碍外，它们在很大程度上是在急性有毒环境中研究的 - 通常通过肌内化学注射或心脏毒素。对FAPs长期动力学的评估主要限于评估杜氏肌营养不良症，使用mdx小鼠模型9，10，11和组合肌肉损伤模型，如巨大的肩袖撕裂，其中同时在肩部肌肉组织上进行肌腱横断和去神经支配26，27，28.FAPs对慢性创伤性去神经支配的唯一侮辱的反应，在重工业，农业和出生创伤（臂丛神经损伤）34，35，36，37中常见的工作场所事故中发生，具有显着的发病率，尚未得到很好的表征，通常仅限于短期时间范围11，38。
我们描述了一种从大鼠的健康以及严重萎缩和纤维化骨骼肌中识别和分离FAPs和MP的方法。首先，使用组织消化和流式细胞术染色方案鉴定CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-FAPs和CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+MPs，并通过对FACS分离的细胞进行培养和免疫细胞化学染色，随后对我们的发现进行验证。使用这种方法，我们还在大鼠的长期孤立去神经支配损伤模型中报告了一种新的FAPs时程。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）是骨骼肌中的常驻间质细胞，与肌原祖细胞（MPs）一起在肌肉稳态，损伤和修复中起关键作用。目前用于FAPs鉴定和分离的方案使用流式细胞术/荧光激活细胞分选（FACS），迄今为止 在体内 评估其功能的研究仅在小鼠中进行。大鼠较大的固有尺寸允许对骨骼肌损伤模型中的FAPs进行更全面的分析，特别是在严重萎缩的肌肉中，或者当研究人员需要大量的组织质量进行多次下游测定时。大鼠还提供了更多不需要动物镇静或牺牲的肌肉功能测定选择，从而通过进行连续评估来最大限度地减少发病率和动物使用。针对小鼠优化的流式细胞术/ FACS方案具有物种特异性，特别是受市售抗体特性的限制。它们尚未针对将FAPs与大鼠或高度纤维化肌肉分离进行优化。基于表面标志物CD31，CD45，Sca-1和VCAM-1的差异表达，开发了一种流式细胞术/ FACS方案，用于从健康和去神经化大鼠骨骼肌中鉴定和分离FAPs和MP。由于大鼠特异性，流式细胞术验证的一抗受到严重限制，因此进行了靶向Sca-1的抗体的内部偶联。使用该协议，确认了成功的Sca-1偶联，并通过细胞培养和FACS分离的FAP和MP的免疫染色来验证FAP和MP的流式细胞术鉴定。最后，我们在延长（14周）大鼠去神经支配模型中报告了一种新的FAPs时间过程。这种方法为研究人员提供了在新型动物模型中研究FAPs的能力。

使用包括 Sca-1 和 VCAM-1 在内的新型抗体组合，通过流式细胞术鉴定 FAP 和MP 用于识别大鼠肌肉中FAPs的门控策略基于小鼠29的流式细胞术方案，其门控CD31（内皮）和CD45（造血）阳性细胞（称为谱系[Lin]），并检查来自谱系阴性（Lin-）群体的FAPs标志物Sca-1和MP标记ITGA7的荧光谱。在缺乏市售的荧光团偶联和流式细胞术验证的大鼠Sca...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

该协议概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法。在肌肉损伤模型中利用大鼠为分析提供了来自萎缩肌的组织可用性的增加，以及用于评估自由移动动物的肌肉力量和步态的更多经过验证的方法。

大鼠骨骼肌中纤维-脂肪源性祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离和表征

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

由于FAPs是肌肉再生和病理性纤维化的介质，我们的方案允许表征肌肉损伤后的FAP动力学，并分离FAPs用于体外或体外研究。迄今为止，研究仅限于从小鼠中分离的FAPs。我们的方案能够从较大的大鼠中有效分离FAPs，为下游测定提供更大的组织可用性。延长的组织处理时间会对FAPs的生存能力产生负面影响。如果同时处理多个样品，建议两个操作员串联执行实验方案，以最大限度地提高分离的细胞活力。首先将收获的肌肉组织置于无菌的10厘米细胞培养皿中。用镊子轻轻撕开并切碎组织，并去除结缔组织，以获得约三到四毫米的立方块。将Minster组织转移到含有6毫升DMEM和1%青霉素 - 链霉素的无菌50毫升锥形管中。接下来，通过加入10微升300毫摩尔氯化钙溶液来激活365微升胶原酶II溶液。将活化的胶原酶II溶液加入组织浆液中，最终浓度为每毫升250单位。将管子在振荡器中孵育一小时，并在37摄氏度下以240×g孵育，每15分钟手动搅拌一次，以移开粘附在管子侧面的组织。孵育一小时后，向样品中加入100微升胶原酶II和50微升脱酶。然后，用血清学移液器移液15至20次，直到溶液均勻。将样品在37摄氏度和240×g下再次孵育30分钟，每15分钟手动搅拌一次。用20号针头将肌肉溶液样品通过20毫升注射器缓慢剪切10个周期。然后，将40微米细胞过滤器放在无菌的50毫升锥形管上，并通过移液五毫升补充10%FBS和1%青霉素链霉素的DMEM来润湿它。通过过滤器一次移取样品一毫升。过滤整个样品后，用补充有10%FBS和1%青霉素 - 链霉素的DMEM洗涤细胞过滤器，以使样品的总体积达到25毫升。将样品体积均匀地分成两个15毫升的锥形管，并在15摄氏度，400×g下离心15分钟。离心后，吸出上清液并将沉淀重悬于室温下的一毫升红细胞裂解缓冲液中七分钟。然后，加入9毫升洗涤缓冲液，使体积达到10毫升，并在15摄氏度，400×g下离心15分钟。离心后，吸出上清液并将沉淀重悬于一毫升洗涤缓冲液中。将适当体积的细胞转移到单独的1.5毫升微量离心管中，并将其与台盼蓝染料混合。使用血细胞计数器在光学显微镜上计数活细胞。对于流式细胞术，将每个实验样品中的1至200万个细胞转移到无菌的1.5毫升微量离心管中。用洗涤缓冲液将样品体积降至一毫升，并将试管放在冰上。设置实验的所有控件。对于细胞对照，在1.5毫升微量离心管中，将500， 000至100万个细胞等分到100万个细胞的1毫升洗涤缓冲液中，并将其放在冰上。如果实验是首次进行，还应包括单染色细胞悬浮液。要设置磁珠控制，请在每个标记的1.5毫升离心管中加入约150， 000个正补偿微珠。通过将一半的细胞体积从活化管转移到刷新标记为死的1.5毫升微量离心管来准备活力控制。将死管在65摄氏度下孵育两到三分钟，然后将其放在冰上。孵育后，将死细胞返回活力管。将单细胞悬浮液（包括实验和对照样品）在500×g和4摄氏度下离心5分钟，并在吸出上清液后将细胞沉淀重悬于100微升洗涤缓冲液中。根据对照或实验条件加入抗体，轻轻轻拂样品，确保完全混合。然后，将它们在黑暗中的冰上孵育15分钟。对于补偿珠，将管子在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过向单细胞悬浮液中加入900微升洗涤缓冲液和900微升PBS用于补偿微珠对照，将每个样品的体积调至1毫升。将单细胞悬浮液在500 x g和4摄氏度下离心5分钟，补偿珠在300 x g和4摄氏度下离心5分钟。离心样品后，吸出上清液并将细胞沉淀重悬于300微升洗涤缓冲液中，并在300微升PBS和150， 000阴补偿微球中对照。将细胞样品保存在冰上，并在室温下将珠子样品放在铝箔下。通过设置门控策略来鉴定纤维脂肪原祖细胞和肌原祖细胞，继续进行流式细胞术采集。在代表性分析中，证实了Sca-1 APC抗体与健康大鼠腓肠肌产生的补偿珠和细胞悬浮液的单染色的成功偶联。在单细胞悬浮液上滴定五种不同浓度的Sca-1 APC，并根据最大荧光强度和最少的背景染色确定抗体的最佳浓度。使用此处显示的门控策略对大鼠腓肠肌中的FAP和MP进行流式细胞术鉴定。首先对样品进行门控，以排除计数珠中的碎片。然后对细胞进行门控，以通过前散射和侧散射特性排除双倍体。通过用SYTOX蓝染色来评估所得细胞的活力。对SYTOX蓝光阴性单线态进行CD31和CD45评估，以排除Lin+组分。评估了林族人口。Sca-1单阳性的细胞被指定为FAPs，VCAM-1单阳性的细胞被指定为MP。在分选后立即进行联合免疫染色，新鲜分离的FAPs群体显示出PDGFRalpha阳性染色，没有受到Pax7阳性细胞的污染。相反，对Pax7染色的MP群体进行排序，没有PDGFRalpha阳性细胞。FAPs在第12天在脂肪生成分化培养基中显示出分化的成纤维细胞和脂肪细胞，分别表达成纤维细胞特异性蛋白1和perilipin 1。来自成熟脂肪细胞的中性甘油三酯和脂质的存在在油红O染色中很明显。此外，FAPs显示存在I型胶原蛋白和没有污染的肌细胞。第12天在肌原分化培养基中生长的MP显示出成熟肌细胞的存在并融合了多核肌管，并且没有成纤维细胞和脂肪细胞污染。当使用这种技术分离活细胞进行长期培养时，研究人员必须确保使用无菌技术，同时有效地工作，以确保良好的细胞活力。

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

成人和胚胎骨骼的肌肉Microexplant文化和骨骼肌肉干细胞的分离

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

科研

生物学

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

纯化的骨骼肌的先觉者

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

使用CD71/TER119流流式细胞仪检测小鼠红系祖细胞的识别和分析

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

一个定量测定胰岛素表达细胞集落形成先觉

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

对大鼠的过程<em在原位</em骨骼肌收缩性能

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

表型分析和分离小鼠造血干细胞和传承的承诺祖

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

大鼠肝细胞的分离和小学文化

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

钙火花的评估在正常肌肉纤维

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

骨骼肌成纤维细胞外泌体的分离和表征

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

小鼠巨核细胞祖细胞的分离

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...