Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Vi vil gerne takke Flow cytometri Core Facilities på University of Ottawa og Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto for deres ekspertise og vejledning i optimering af flow cytometri / FACS protokol præsenteret i dette manuskript. Dette arbejde blev finansieret af Medicine af Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) til JB.

Efterforskere, der gennemfører denne protokol, skal have tilladelse fra deres lokale dyreetiske råd /plejeudvalg. Alt dyrearbejde blev godkendt af St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC # 918) og blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer, der er fastsat af det canadiske råd for dyrepleje (CCAC). Der vises et skema over flowcytometriprotokollen i figur 1. Hvis downstream-applikationen er FACS og efterfølgende cellekultur, skal alle trin udføres...

En optimeret, valideret FAPs isolation protokol for rottemuskel er afgørende for forskere, der ønsker at studere skade modeller, der ikke er muligt i musen af biologiske eller tekniske årsager. For eksempel er mus ikke en optimal dyremodel til at studere kroniske lokale eller neurodegenerative skader som langvarig denervation. Biologisk, den korte levetid og hurtig aldring af mus gør det vanskeligt præcist at afgrænse muskel sequalae på grund af denervation fra den forvirrende faktor aldring. Fra et teknisk synspu...

Fibro-adipogenic stamfader celler (FAPs) er en population af hjemmehørende multipotent stamfader celler i skeletmuskulatur, der spiller en afgørende rolle i muskel homøostase, reparation, og regenerering, og omvendt også mægle patologiske reaktioner på muskelskade. Som navnet antyder, blev FAPs oprindeligt identificeret som en stamfader befolkning med potentiale til at differentiere sig til fibroblaster og adipocytter1 og blev foregav at være de vigtigste mæglere af fibro-fedt infiltration af skeletmuskulatur i kronisk skade og sygdom. Yderligere undersøgelse viste, at FAPs desuden er i stand til osteogenese og chondrogenesis2,3,4. Således er de mere bredt noteret i litteraturen som mesenkymale eller stromale forfædre3,5,6,7,8. I akut skeletmuskulaturskade hjælper FAPs indirekte med regenerativ myogenese ved forbigående at sprede sig for at give et gunstigt miljø for aktiverede muskelsatellitceller og deres downstream myogene stamfader (parlamentsmedlemmer) modstykker1,9,10. Parallelt med vellykket regenerering gennemgår FAP'er apoptose og returnerer deres tal til basisniveau1,9,10,11. I modsætning hertil tilsidesætter FAPs proapptotiske signaler i kronisk muskelskade, hvilket resulterer i deres persistens9,10,11 og unormal muskelreparation.
In vivo-undersøgelser , der evaluerer de cellulære og molekylære mekanismer , hvormed FAPs formidler muskelreaktioner, har udnyttet skumle dyremodeller til dato1,7,9,10,11,12,13,14. Mens genetisk manipulerede mus er kraftfulde værktøjer til brug i disse analyser, begrænser dyrets lille størrelse vævstilgængeligheden til undersøgelse i langsigtede lokaliserede skadesmodeller, hvor muskelatrofi kan være dyb, såsom traumatisk denervation. Desuden kræver måling af muskelstyrke og fysisk funktion ex vivo- eller in situ-målinger, der nødvendiggør afslutning af musen eller in vivo-metoder, der kræver operation og/eller en generel bedøvelse for at muliggøre evaluering af muskelkontraktile præstationer15,16,17,18,19,20 . Hos rotter findes godt validerede og globalt anvendte muskelfunktionelle analyser, ud over analyser for mere komplekse motoriske adfærd som ganganalyse (f.eks. Iskiasfunktionsindeks, CatWalk-analyse) og udføres hos vågne og spontant bevægende dyr21,22,23,24 . Dette optimerer desuden principperne om minimal sygelighed i dyreforsøg og antallet af anvendte forskningsdyr. Rotten giver dermed FAPs investigator den ekstra fleksibilitet af større skadet muskelvolumen til protein- og cellulære analyser og evnen til at foretage serievurderinger af muskelkompleks statisk og dynamisk funktionel aktivitet og adfærd i det opmærksomme dyr.
FAPs er primært blevet identificeret og isoleret fra hele muskelprøver ved hjælp af flowcytometri og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS). Disse er laserbaserede analyser, der er i stand til at identificere flere specifikke cellepopulationer baseret på karakteristiske træk som størrelse, granularitet og en bestemt kombination af celleoverflade eller intracellulære markører25. Dette er meget fordelagtigt i studiet af et organsystem som skeletmuskulatur, da homøostase og regenerering er komplekse, multifaktorielle processer koordineret af en overflod af celletyper. En skelsættende undersøgelse identificeret FAPs, samt parlamentsmedlemmer, ved hjælp af flow cytometriske metoder i musen skeletmuskulatur1. De viste, at FAPs er mesenkymal karakter, da de manglede overfladeantigener, der er specifikke for celler fra endotel (CD31), hæmatopoietisk (CD45) eller myogen (Integrin-α7 [ITGA7]) oprindelse, men udtrykte den mesenkymale stamcellemarkør Sca-1 (Stamcelleantigen 1)1 og differentierede sig til fibrogene og adipogenic celler i kultur. Andre undersøgelser viste vellykket isolering af mesenchymale forfædre i muskler baseret på udtrykket af en alternativ stamcellemarkør, blodplade-afledt vækstfaktor receptor alpha (PDGFRα)2,7,8 og yderligere analyse viste disse sandsynligvis vil være den samme celle befolkning som FAPs3. FAPs er nu almindeligt identificeret i flowcytometri ved hjælp af enten Sca-1 eller PDGFRα som et positivt valgmærke1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Brugen af PDGFRα er præference for humant væv dog, som en direkte menneskelig homolog af murine Sca-1 er endnu ikke identificeret32. Derudover er andre celleoverfladeproteiner blevet rapporteret som markører for parlamentsmedlemmer (f.eks. VCAM-1), hvilket giver et potentielt alternativ til ITGA7 som indikator for celler af myogen afstamning under FAPs isolation33.
Mens flowcytometri/FACS er en kraftfuld metode til at studere FAPs rolle og patogene potentiale i skeletmuskulatur1,9,10,11,13,29, er den teknisk begrænset af specificiteten og optimeringen af de krævede reagenser. Da flowcytometrisk identifikation og isolering af FAPs er blevet udviklet og udført i musedyrmodeller1,9,10,11,29, giver det udfordringer for forskere, der ønsker at studere FAPs i andre modelorganismer. Mange faktorer - såsom optimal vævsstørrelse, der skal behandles, samt reagens og / eller antistof specificitet og tilgængelighed - varierer afhængigt af de anvendte arter.
Ud over de tekniske hindringer for at studere FAPs i en ny dyremodel er de stort set blevet undersøgt i akutte, giftige omgivelser - normalt via intramuskulær kemisk injektion eller kardiotoksin. Evaluering af den langsigtede dynamik i FAPs er begrænset primært til vurdering i Duchenne's muskelsvind, ved hjælp af mdx mus model9,10,11, og modeller af kombination muskel skade såsom massive rotator cuff tåre, hvor samtidig sene transection og denervation udføres på skulder muskulatur26,27,28 . Reaktionen af FAPs til den eneste fornærmelse af kronisk traumatisk denervation, en almindelig forekomst i arbejdsulykker i tung industri, landbrug og i fødselstraumer (brachial plexus skade)34,35,36,37 med betydelig sygelighed, har ikke været så godt karakteriseret, ofte begrænset til en kortsigtet tidsramme11,38.
Vi beskriver en metode til at identificere og isolere FAPs og parlamentsmedlemmer fra sunde såvel som alvorligt attrofiske og fibrotiske skeletmuskulatur i rotten. For det første demonstreres identifikation af CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs og CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ parlamentsmedlemmer ved hjælp af en væv fordøjelse og flow cytometri farvning protokol og efterfølgende validering af vores resultater udføres gennem kultur og immunocytokemisk farvning af FACS-isolerede celler. Ved hjælp af denne metode rapporterer vi også et nyt FAPs-forløb i en langsigtet isoleret denervationsskademodel i rotten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

Fibro-adipogenic Forfædre (FAPs) er hjemmehørende interstitielle celler i skeletmuskulatur, der sammen med myogene forfædre (parlamentsmedlemmer), spiller en central rolle i muskel homeostase, skade, og reparation. De nuværende protokoller for FAPs-identifikation og isolationsbrugsstrømcytometri/fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og undersøgelser, der evaluerer deres funktion in vivo til dato, er udelukkende blevet udført hos mus. Den større iboende størrelse af rotten giver mulighed for en mere omfattende analyse af FAPs i skeletmuskulatur skade modeller, især i alvorligt atrofisk muskel, eller når efterforskere kræver betydelig vævsmasse til at foretage flere downstream assays. Rotten giver desuden et større udvalg af muskelfunktionelle analyser, der ikke kræver dyresedation eller -offer, hvilket minimerer sygelighed og dyrebrug ved at muliggøre serielle vurderinger. Flowcytometri/FACS-protokollerne, der er optimeret til mus, er artsspecifikke, navnlig begrænset af egenskaberne ved kommercielt tilgængelige antistoffer. De er ikke blevet optimeret til at adskille FAPs fra rotte eller meget fibrotisk muskel. En flowcytometri / FACS protokol til identifikation og isolering af FAPs og parlamentsmedlemmer fra både sunde og denervated rotte skeletmuskulatur blev udviklet, bygger på differentieret udtryk for overflade markører CD31, CD45, Sca-1, og VCAM-1. Da rottespecifikke, flowcytometri validerede primære antistoffer er stærkt begrænsede, blev der udført intern bøjning af antistoffet rettet mod Sca-1. Ved hjælp af denne protokol blev vellykket Sca-1-bøjning bekræftet, og flowcytometrisk identifikation af FAPs og parlamentsmedlemmer blev valideret af cellekultur og immunstainning af FACS-isolerede FAPs og parlamentsmedlemmer. Endelig rapporterer vi en ny FAPs-tidsforløb i en langvarig (14 uger) rottebenenemodel. Denne metode giver efterforskerne mulighed for at studere FAPs i en ny dyremodel.

Identifikation af FAPs og parlamentsmedlemmer via flowcytometri ved hjælp af et nyt antistofpanel, herunder Sca-1 og VCAM-1 Gating-strategien til identifikation af FAPs i rottemuskel er baseret på flowcytometriprotokoller i mus29, som gate på CD31 (endotel) og CD45 (hæmatopoietiske) positive celler (kaldes slægten [Lin]) og undersøger den fluorescerende profil af FAPs-markør Sca-1 og parlamentsmedlemmer markør ITGA7 fr...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Denne protokol skitserer en metode til at isolere Fibro-adipogenic forfædre (FAPs) og myogene forfædre (parlamentsmedlemmer) fra rotte skeletmuskulatur. Udnyttelse af rotten i muskelskade modeller giver øget væv tilgængelighed fra atrofisk muskel til analysen og et større repertoire af validerede metoder til at vurdere muskelstyrke og gangart i frit bevægende dyr.

Identifikation, isolation og karakterisering af fibro-adipogenic stamfaderer (FAPs) og myogene forfædre (parlamentsmedlemmer) i skeletmuskulatur i rotten

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Da FAPs er mæglere af muskel regenerering og patologisk fibrose, vores protokol giver mulighed for karakterisering af FAP dynamik post muskelskade og isolering af FAPs for in vitro eller ex vivo undersøgelser. Til dato er der udelukkende blevet udført undersøgelser af FAPs isoleret fra mus. Vores protokol muliggør effektiv isolering af FAPs fra den større rotte, hvilket giver meget større væv tilgængelighed for downstream assays.Langvarig vævsbehandlingstid kan have en negativ indvirkning på FAPs levedygtighed. Hvis flere prøver behandles samtidigt, anbefales det, at to operatorer udfører protokollen i tandem for at maksimere den isolerede celle levedygtighed. Begynd med at placere det høstede muskelvæv i en steril 10 centimeter cellekulturskål.Riv forsigtigt og hakkevævet med pince og fjern bindevæv for at opnå ca. tre til fire millimeter kubikstykker. Overfør minstervævet til et sterilt 50-milliliter konisk rør, der indeholder seks milliliter DMEM og 1% penicillin-streptomycin. Derefter aktiveres 365 mikroliter af kollagen II-opløsning ved at tilføje 10 mikroliter af 300 millimolar calciumchloridopløsning.Tilsættes den aktiverede kollagen II opløsning til vævsslammet for en endelig koncentration på 250 enheder pr. milliliter. Inkuber rørene i en shaker i en time og ved 37 grader Celsius ved 240 x g med manuel agitation hvert 15. minut for at løsne væv klæbet til siden af røret. Efter en times inkubation tilsættes 100 mikroliter kollagen II og 50 mikroliter dispase til prøven.Derefter prøver pipetten 15 til 20 gange med en serologisk pipette, indtil opløsningen er homogen. Inkuber prøven igen i 30 minutter ved 37 grader Celsius og 240 x g med manuel omrøring hvert 15. minut. Skær langsomt muskelopløsningsprøverne gennem en 20-milliliter sprøjte med en 20-gauge nål i 10 cyklusser.Derefter placere en 40-mikron celle si på en steril 50-milliliter koniske rør og våd det ved pipetter fem milliliter DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Pipette prøven en milliliter ad gangen gennem si. Når hele prøven er filtreret, vaskes cellesienden med DMEM suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin for at bringe det samlede prøvevolumen op på 25 milliliter.Prøvens volumen opdeles ligeligt i to 15 milliliter koniske rør og centrifuge ved 15 grader Celsius, 400 x g i 15 minutter. Efter centrifugering, aspirere supernatant og genbruge pellet i en milliliter af RBC lysis buffer ved stuetemperatur i syv minutter. Derefter tilsættes ni milliliter vaskebuffer for at bringe volumen til 10 milliliter og centrifuge ved 15 grader Celsius, 400 x g i 15 minutter.Efter centrifugering, aspirere supernatant og genbruge pellet i en milliliter af vask buffer. Overfør et passende volumen af celler til en separat 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør og bland det med trypan blå farvestof. Tæl levende celler på et let mikroskop ved hjælp af et hæmocytometer.For flowcytometri overføres en til 2 millioner celler pr. forsøgsprøve til et sterilt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Bring prøvevolumen til en milliliter med vaskebuffer, og læg røret på is. Konfigurer alle kontrolelementer til eksperimentet.For celle kontrol, aliquot 500, 000 til 1 million celler i en milliliter vask buffer i en 1,5-milliliter mikrocentrifuge rør og placere den på is. Hvis eksperimentet udføres for første gang, bør enkeltfarvede celleaffjedring også medtages. For at oprette perlekontroller skal du tilføje omkring 150.000 positive kompensationsperler til hver mærket 1,5 milliliter centrifugerør.Forbered levedygtighedskontrollen ved at overføre halvdelen af cellevolumenet fra levedygtighedsrøret for at opdatere 1,5 milliliter mikrocentrifugerør mærket dødt. Inkuber det døde rør ved 65 grader Celsius i to til tre minutter, og læg det derefter på is. Efter inkubationen returneres de døde celler til levedygtighedsrøret.Centrifugere encellede suspensioner, herunder eksperimentelle og kontrolprøver ved 500 x g og fire grader Celsius i fem minutter, og genanvende cellepillerne i 100 mikroliter af vaskebuffer efter at have aspireret supernatanten. Tilsæt antistoffer i henhold til kontrol eller eksperimentel tilstand, og svirp forsigtigt prøven for at sikre fuldstændig blanding. Inkuber dem derefter på is i mørket i 15 minutter.For kompensation perler, inkubere røret ved stuetemperatur i mørke i 15 minutter. Bring volumenet af hver prøve til en milliliter ved at tilføje 900 mikroliter vaskebuffer til enkeltcelleaffjedringen og 900 mikroliter pbs til kompensation perlekontroller. Centrifuge encellede suspensioner ved 500 x g og fire grader Celsius i fem minutter, og kompensation perle kontrol på 300 x g og fire grader Celsius i fem minutter.Efter centrifugering af prøverne, aspirere supernatant og genbruge celle pellet i 300 mikroliter af vask buffer, og perle kontrol i 300 mikroliter af PBS og 150.000 negativ kompensation perler. Hold celleprøverne på is- og perleprøver ved stuetemperatur under aluminiumsfolie. Fortsæt med flowcytometrierhvervelse ved at oprette gatingstrategien til identifikation af fibro-adipogene forfædre og myogene forfædre.I den repræsentative analyse blev vellykket bøjning af Sca-1 APC Antistof med enkelt farvning af kompensationsperler og celleaffjedring genereret fra sunde rotte gastrocnemius muskel bekræftet. Fem forskellige koncentrationer af Sca-1 APC blev titreret på encellede suspensioner, og den optimale koncentration af antistof blev identificeret baseret på den største fluorescensintensitet med minimal baggrundsfarvning. Flow cytometriske identifikationer af FAPs og parlamentsmedlemmer i rotte gastrocnemius blev udført ved hjælp af gating strategi vist her.Prøver blev først gated at udelukke vragrester i optælling perler. Celler blev derefter gated at udelukke doublets af både front scatter og side scatter egenskaber. Levedygtigheden af resulterende celler blev vurderet ved farvning med SYTOX Blue.SYTOX Blue negative singlets blev vurderet for CD31 og CD45 for at udelukke Lin +brøker. Lin-befolkningen blev vurderet. Celler, der var enkelt positive for Sca-1 blev udpeget FAPs, og celler, der var enkelt positive for VCAM-1 blev udpeget parlamentsmedlemmer.Med co-immunstaining umiddelbart efter sortering, viste den frisk isolerede population af FAPs positiv farvning for PDGFRalpha uden forurening af Pax7 positive celler. Omvendt, den sorterede befolkning af parlamentsmedlemmer farves positiv for Pax7 med fravær af PDGFRalpha-positive celler. FAPs demonstrerede differentierede fibroblaster og adipocytter på dag 12 i adipogenic differentiering medier med udtryk for fibroblast-specifikke protein 1 og perilipin 1, henholdsvis.Tilstedeværelsen af neutrale triglycerider og lipider fra modne adipocytter var tydelig med OlieRød O farvning. Derudover viste FAPs en tilstedeværelse af kollagen type I og en mangel på forurenende myocytter. Parlamentsmedlemmer dyrket i myogene differentiering medier på dag 12 viste tilstedeværelsen af modne myocytter og smeltede multinukleated myotubes, og var fri for fibroblaster og adipocyt forurening.Når forskerne bruger denne teknik til at isolere levende celler til langsigtet kultur, skal de sikre, at de bruger aseptisk teknik, samtidig med at de arbejder effektivt for at sikre god cellelevedygtighed.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

En kvantitativ analyse til Insulin-udtrykkende kolonidannende stamceller

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fænotypisk analyse og isolering af murine hæmatopoietiske stamceller og Lineage-progenitorer

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rotte levercellerne

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Vurdering af Calcium Sparks i intakte Skeletal muskelfibre

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering og karakterisering af exosomer fra skeletmuskelfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Isolering af Mouse Megakaryocyte Forfædre

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...