Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

We willen de Flow cytometry Core Facilities aan de Universiteit van Ottawa en het Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto bedanken voor hun expertise en begeleiding bij het optimaliseren van het flowcytometrie / FACS-protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd. Dit werk werd gefinancierd door Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) aan JB.

Onderzoekers die dit protocol uitvoeren, moeten toestemming krijgen van hun lokale commissie voor dierenethiek / zorgcommissie. Al het dierwerk werd goedgekeurd door het St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC # 918) en werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care (CCAC). Een schema van het flowcytometrieprotocol is weergegeven in figuur 1. Als de downstream-toepassing FACS en de daaropvolgende celkweek is, moeten...

Een geoptimaliseerd, gevalideerd FAPs-isolatieprotocol voor rattenspier is essentieel voor onderzoekers die letselmodellen willen bestuderen die om biologische of technische redenen niet haalbaar zijn in de muis. Muizen zijn bijvoorbeeld geen optimaal diermodel om chronische lokale of neurodegeneratieve verwondingen zoals langdurige denervatie te bestuderen. Biologisch gezien maken de korte levensduur en snelle veroudering van muizen het moeilijk om de spiersequalae nauwkeurig af te bakenen als gevolg van denervatie van ...

Fibro-adipogene voorlopercellen (FAP's) zijn een populatie van residente multipotente voorlopercellen in skeletspieren die een cruciale rol spelen bij spierhomeostase, reparatie en regeneratie, en omgekeerd ook pathologische reacties op spierletsel bemiddelen. Zoals de naam al doet vermoeden, werden FAP's oorspronkelijk geïdentificeerd als een voorloperpopulatie met het potentieel om te differentiëren in fibroblasten en adipocyten1 en werden ze verondersteld de belangrijkste mediatoren te zijn van fibro-vette infiltratie van skeletspieren bij chronisch letsel en ziekte. Verder onderzoek toonde aan dat FAPs bovendien in staat zijn tot osteogenese en chondrogenese2,3,4. Zo worden ze in de literatuur breder genoteerd als mesenchymale of stromale voorlopers3,5,6,7,8. Bij acuut skeletspierletsel helpen FAPs indirect bij regeneratieve myogenese door zich tijdelijk te vermenigvuldigen om een gunstige omgeving te bieden voor geactiveerde spiersatellietcellen en hun downstream myogene voorloper (MP's) tegenhangers1,9,10. Parallel aan succesvolle regeneratie ondergaan FAPs apoptose, waarbij hun aantal terugkeert naar basislijnniveaus1,9,10,11. Bij chronisch spierletsel daarentegen overschrijven FAP's pro-apoptotische signalen, wat resulteert in hun persistentie9,10,11 en abnormaal spierherstel.
In vivo studies die de cellulaire en moleculaire mechanismen evalueren waarmee FAPs spierresponsen bemiddelen, hebben tot op heden gebruik gemaakt van muizendiermodellen1,7,9,10,11,12,13,14. Hoewel genetisch gemanipuleerde muizen krachtige hulpmiddelen zijn voor gebruik in deze analyses, beperkt de kleine omvang van het dier de beschikbaarheid van weefsel voor onderzoek in langdurige gelokaliseerde letselmodellen waar spieratrofie diepgaand kan zijn, zoals traumatische denervatie. Bovendien vereist het meten van spierkracht en fysieke functie ex vivo of in situ metingen die beëindiging van de muis vereisen, of in vivo methoden die een operatie en/of een algemene verdoving vereisen om evaluatie van spiercontractiele prestaties mogelijk te maken15,16,17,18,19,20 . Bij ratten bestaan er goed gevalideerde en wereldwijd gebruikte spierfunctieanalyses, naast analyses voor complexer motorisch gedrag zoals loopanalyse (bijv. Ischiasfunctie-index, CatWalk-analyse) en worden uitgevoerd bij wakkere en spontaan bewegende dieren21,22,23,24 . Dit optimaliseert bovendien de principes van minimale morbiditeit in dierproeven en het aantal gebruikte onderzoeksdieren. De rat biedt de FAPs-onderzoeker daardoor de extra flexibiliteit van een groter gewond spiervolume voor eiwit- en cellulaire analyses en de mogelijkheid om seriële beoordelingen uit te voeren van spiercomplex statische en dynamische functionele activiteit en gedrag, in het alerte dier.
FAPs zijn voornamelijk geïdentificeerd en geïsoleerd uit hele spiermonsters met behulp van respectievelijk flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Dit zijn op laser gebaseerde testen die in staat zijn om meerdere specifieke celpopulaties te identificeren op basis van karakteristieke kenmerken zoals grootte, granulariteit en een specifieke combinatie van celoppervlak of intracellulaire markers25. Dit is zeer voordelig bij de studie van een orgaansysteem zoals skeletspieren, omdat homeostase en regeneratie complexe, multifactoriële processen zijn die worden gecoördineerd door een overvloed aan celtypen. Een baanbrekende studie identificeerde FAPs, evenals MP's, met behulp van flowcytometrische methoden in de skeletspieren van muizen1. Ze toonden aan dat FAPs mesenchymaal van aard zijn, omdat ze geen oppervlakte-antigenen hadden die specifiek zijn voor cellen van endotheel (CD31), hematopoietische (CD45) of myogene (Integrin-α7 [ITGA7]) oorsprong, maar de mesenchymale stamcelmarker Sca-1 (stamcelantigeen 1) 1 tot expressie brachten en in cultuur werdengedifferentieerd tot fibrogene en adipogene cellen. Andere studies toonden succesvolle isolatie van mesenchymale voorlopercellen in spieren aan op basis van de expressie van een alternatieve stamcelmarker, van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor alfa (PDGFRα)2,7,8 en verdere analyse onthulde dat deze waarschijnlijk dezelfde celpopulatie zijn als FAPs3. FAPs worden nu vaak geïdentificeerd in flowcytometrie met behulp van Sca-1 of PDGFRα als een positieve selectiemarker1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Het gebruik van PDGFRα heeft echter de voorkeur voor menselijk weefsel, omdat een directe menselijke homoloog van murine Sca-1 nog moet worden geïdentificeerd32. Bovendien zijn andere celoppervlakeiwitten gerapporteerd als markers van PARLEMENTSLEDEN (bijv. VCAM-1), wat een potentieel alternatief biedt voor ITGA7 als een indicator van cellen van myogene afstamming tijdens FAPs-isolatie33.
Hoewel flowcytometrie / FACS een krachtige methodologie is voor het bestuderen van de rol en het pathogene potentieel van FAPs in skeletspieren1,9,10,11,13,29,wordt het technisch beperkt door de specificiteit en optimalisatie van de vereiste reagentia. Aangezien flowcytometrische identificatie en isolatie van FAPs is ontwikkeld en uitgevoerd in muisdiermodellen1,9,10,11,29,vormt dit uitdagingen voor onderzoekers die FAPs in andere modelorganismen willen bestuderen. Veel factoren - zoals optimale weefselgrootte die moet worden verwerkt, evenals reagens- en / of antilichaamspecificiteit en beschikbaarheid - verschillen afhankelijk van de gebruikte soort.
Naast de technische barrières voor het bestuderen van FAPs in een nieuw diermodel, zijn ze grotendeels bestudeerd in een acute, toxische omgeving - meestal via intramusculaire chemische injectie of cardiotoxine. Evaluatie van de langetermijndynamiek van FAPs is voornamelijk beperkt tot beoordeling in Duchenne's spierdystrofie, met behulp van het mdx-muismodel9,10,11en modellen van gecombineerd spierletsel zoals massieve rotator cuff-scheur waarbij gelijktijdige peestranssectie en denervatie wordt uitgevoerd op schoudermusculatuur26,27,28 . De reactie van FAPs op de enige belediging van chronische traumatische denervatie, een veel voorkomend verschijnsel bij ongevallen op de werkplek in de zware industrie, landbouw en bij geboortetrauma's (brachiale plexusletsel)34,35,36,37 met aanzienlijke morbiditeit, is niet zo goed gekarakteriseerd, vaak beperkt tot een kortetermijntijdframe11,38.
We beschrijven een methode voor het identificeren en isoleren van FAPs en PARLEMENTSLEDEN van gezonde, maar ook ernstig atrofische en fibrotische skeletspieren bij de rat. Ten eerste wordt identificatie van CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs en CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MP's met behulp van een weefselverterings- en flowcytometriekleuringsprotocol aangetoond en wordt de daaropvolgende validatie van onze bevindingen uitgevoerd door middel van kweek en immunocytochemische kleuring van FACS-geïsoleerde cellen. Met behulp van deze methode rapporteren we ook een nieuw FAPs-tijdsverloop in een langdurig geïsoleerd denervatieletselmodel bij de rat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

Fibro-adipogene voorlopers (FAP's) zijn residente interstitiële cellen in skeletspieren die, samen met myogene voorlopers (MP's), een sleutelrol spelen bij spierhomeostase, letsel en herstel. De huidige protocollen voor FAPs-identificatie en -isolatie maken gebruik van flowcytometrie / fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) en studies die hun functie in vivo tot nu toe evalueren, zijn uitsluitend bij muizen uitgevoerd. De grotere inherente grootte van de rat maakt een uitgebreidere analyse van FAPs in skeletspierletselmodellen mogelijk, vooral in ernstig atrofische spieren of wanneer onderzoekers aanzienlijke weefselmassa nodig hebben om meerdere downstream-assays uit te voeren. De rat biedt bovendien een grotere selectie van spier functionele assays die geen dierlijke sedatie of opoffering vereisen, waardoor morbiditeit en diergebruik worden geminimaliseerd door seriële beoordelingen mogelijk te maken. De flowcytometrie/FACS-protocollen die voor muizen zijn geoptimaliseerd, zijn soortspecifiek, met name beperkt door de kenmerken van commercieel beschikbare antilichamen. Ze zijn niet geoptimaliseerd voor het scheiden van FAPs van ratten of zeer fibrotische spieren. Een flowcytometrie/FACS-protocol voor de identificatie en isolatie van FAPs en MP's van zowel gezonde als gedenerveerde rattenskeletspieren werd ontwikkeld, afhankelijk van de differentiële expressie van oppervlaktemarkers CD31, CD45, Sca-1 en VCAM-1. Omdat ratspecifieke, flowcytometrie-gevalideerde primaire antilichamen ernstig beperkt zijn, werd interne conjugatie van het antilichaam gericht op Sca-1 uitgevoerd. Met behulp van dit protocol werd succesvolle Sca-1-conjugatie bevestigd en flowcytometrische identificatie van FAPs en MP's werd gevalideerd door celkweek en immunostaining van FACS-geïsoleerde FAPs en MP's. Ten slotte rapporteren we een nieuw FAPs-tijdsverloop in een langdurig (14 weken) rattendenervatiemodel. Deze methode biedt de onderzoekers de mogelijkheid om FAPs te bestuderen in een nieuw diermodel.

Het identificeren van FAPs en MP's via flowcytometrie met behulp van een nieuw antilichaampanel, waaronder Sca-1 en VCAM-1 De gating-strategie voor het identificeren van FAPs in rattenspier is gebaseerd op flowcytometrieprotocollen in de muis29, die poort op CD31 (endotheel) en CD45 (hematopoietische) positieve cellen (de afstamming [Lin] genoemd) en onderzoekt het fluorescerende profiel van FAPs marker Sca-1 en MPs marker ITG...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Dit protocol schetst een methode om Fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en myogene voorlopers (MP's) te isoleren uit de skeletspieren van ratten. Het gebruik van de rat in spierletselmodellen zorgt voor een verhoogde beschikbaarheid van weefsel van atrofische spieren voor de analyse en een groter repertoire van gevalideerde methoden om spierkracht en gang bij vrij bewegende dieren te beoordelen.

Identificatie, isolatie en karakterisering van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en myogene voorlopercellen (MP's) in skeletspieren bij de rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Aangezien FAP's mediatoren zijn van spierregeneratie en pathologische fibrose, maakt ons protocol het mogelijk om de FAP-dynamiek na spierletsel te karakteriseren en FAP's te isoleren voor in vitro of ex vivo studies. Tot op heden zijn studies uitsluitend uitgevoerd op FAPs geïsoleerd van muizen. Ons protocol maakt een effectieve isolatie van FAPs van de grotere rat mogelijk, waardoor er veel meer weefsel beschikbaar is voor downstream-assays.Langdurige weefselverwerkingstijd kan de levensvatbaarheid van FAPs negatief beïnvloeden. Als meerdere monsters tegelijkertijd worden verwerkt, wordt aanbevolen dat twee operators het protocol samen uitvoeren om de levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen te maximaliseren. Begin met het plaatsen van het geoogste spierweefsel in een steriele celkweekschaal van 10 centimeter.Scheur en hak het weefsel voorzichtig met een tang en verwijder bindweefsel om ongeveer drie tot vier millimeter blokjes te verkrijgen. Breng het minsterweefsel over in een steriele conische buis van 50 milliliter met zes milliliter DMEM en 1% penicilline-streptomycine. Activeer vervolgens 365 microliter collagenase II-oplossing door 10 microliter 300-millimolaire calciumchlorideoplossing toe te voegen.Voeg de geactiveerde collagenase II-oplossing toe aan de weefselslib voor een eindconcentratie van 250 eenheden per milliliter. Incubeer de buizen in een shaker gedurende een uur en bij 37 graden Celsius bij 240 x g met handmatig roeren om de 15 minuten om weefsel los te maken dat aan de zijkant van de buis is gehecht. Voeg na een uur incubatie 100 microliter collagenase II en 50 microliter dispase toe aan het monster.Pipetteer vervolgens monsters 15 tot 20 keer met een serologische pipet totdat de oplossing homogeen is. Incubeer het monster opnieuw gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en 240 x g met handmatig roeren om de 15 minuten. Schuif de monsters van de spieroplossing langzaam door een spuit van 20 milliliter met een naald van 20 gauge gedurende 10 cycli.Plaats vervolgens een celzeef van 40 micron op een steriele conische buis van 50 milliliter en maak deze nat door vijf milliliter DMEM te pipetteren, aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine. Pipetteer het monster één milliliter per keer door de zeef. Zodra het hele monster is gefilterd, wast u de celzeef met DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine om het totale monstervolume op 25 milliliter te brengen.Verdeel het monstervolume gelijkmatig in twee conische buisjes van 15 milliliter en centrifugeer bij 15 graden Celsius, 400 x g gedurende 15 minuten. Zuig na centrifugeren het supernatant op en resuspend de pellet gedurende zeven minuten in één milliliter RBC-lysisbuffer bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens negen milliliter wasbuffer toe om het volume op 10 milliliter te brengen en centrifugeer bij 15 graden Celsius, 400 x g gedurende 15 minuten.Zuig na het centrifugeren het supernatant op en resuspend de pellet in een milliliter wasbuffer. Breng een geschikt volume cellen over in een afzonderlijke microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en meng deze met trypanblauwe kleurstof. Tel levende cellen op een lichtmicroscoop met behulp van een hemocytometer.Breng voor flowcytometrie één tot 2 miljoen cellen per experimenteel monster over naar een steriele microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Breng het monstervolume met wasbuffer op één milliliter en plaats de buis op ijs. Stel alle besturingselementen voor het experiment in.Voor celcontroles, aliquot 500,000 tot 1 miljoen cellen in een milliliter wasbuffer in een 1,5-milliliter microcentrifugebuis en plaats deze op ijs. Als het experiment voor de eerste keer wordt uitgevoerd, moeten ook suspensies met één kleur cel worden opgenomen. Om kraalcontroles in te stellen, voegt u ongeveer 150.000 positieve compensatieparels toe aan elke gelabelde centrifugebuis van 1,5 milliliter.Bereid de levensvatbaarheidsregeling voor door de helft van het celvolume van de levensvatbaarheidsbuis over te brengen om de 1,5-milliliter microcentrifugebuis met het label dood te verversen. Incubeer de dode buis bij 65 graden Celsius gedurende twee tot drie minuten en plaats deze vervolgens op ijs. Breng na de incubatie de dode cellen terug naar de levensvatbaarheidsbuis.Centrifugeer de eencellige suspensies, inclusief experimentele en controlemonsters bij 500 x g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten, en resuspend de celkorrels in 100 microliter wasbuffer na het aanzuigen van het supernatant. Voeg antilichamen toe volgens de controle of experimentele toestand en veeg voorzichtig met het monster om een volledige menging te garanderen. Incubeer ze vervolgens gedurende 15 minuten op ijs in het donker.Voor compensatieparels incubeer je de buis bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 minuten. Breng het volume van elk monster op één milliliter door 900 microliter wasbuffer toe te voegen aan de eencellige suspensie en 900 microliter PBS voor compensatieparelcontroles. Centrifugeer eencellige suspensies bij 500 x g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten, en compensatieparelcontroles bij 300 x g en vier graden Celsius gedurende vijf minuten.Na het centrifugeren van de monsters, zuigt u het supernatant op en resuspendeert u de celkorrel in 300 microliter wasbuffer en kraalcontroles in 300 microliter PBS en 150.000 negatieve compensatieparels. Bewaar de celmonsters op ijs en kraalmonsters bij kamertemperatuur onder aluminiumfolie. Ga verder met het verwerven van flowcytometrie door het opzetten van de gating-strategie om fibro-adipogene voorlopers en myogene voorlopers te identificeren.In de representatieve analyse werd een succesvolle conjugatie van het Sca-1 APC-antilichaam met enkele kleuring van compensatieparels en celsuspensies gegenereerd uit gezonde gastrocnemiusspier bij ratten bevestigd. Vijf verschillende concentraties Sca-1 APC werden getitreerd op eencellige suspensies en de optimale concentratie van antilichamen werd geïdentificeerd op basis van de grootste fluorescentie-intensiteit met minimale achtergrondkleuring. Flowcytometrische identificaties van FAPs en MP's bij rattengastrocnemius werden uitgevoerd met behulp van de hier getoonde gating-strategie.Monsters werden eerst omheind om puin uit te sluiten bij het tellen van kralen. Cellen werden vervolgens gated om doubletten uit te sluiten door zowel front scatter als side scatter kenmerken. De levensvatbaarheid van de resulterende cellen werd beoordeeld door kleuring met SYTOX Blue.SYTOX Blue negatieve singlets werden beoordeeld voor CD31 en CD45 om Lin+fracties uit te sluiten. De Lin-populatie werd beoordeeld. Cellen die enkel positief waren voor Sca-1 werden aangeduid als FAP's en cellen die enkel positief waren voor VCAM-1 werden aangewezen als parlementsleden.Met co-immunostaining onmiddellijk na sortering vertoonde de vers geïsoleerde populatie van FAPs positieve kleuring voor PDGFRalpha zonder besmetting door Pax7-positieve cellen. Omgekeerd kleurde de gesorteerde populatie van parlementsleden positief voor Pax7 met een afwezigheid van PDGFRalpha-positieve cellen. FAPs toonden gedifferentieerde fibroblasten en adipocyten op dag 12 in adipogene differentiatiemedia met expressie van respectievelijk fibroblastspecifiek eiwit 1 en perilipin 1.De aanwezigheid van neutrale triglyceriden en lipiden van volwassen adipocyten was duidelijk met Oil Red O-kleuring. Bovendien toonden de FAPs een aanwezigheid van collageen type I en een afwezigheid van contaminerende myocyten. Kamerleden gekweekt in myogene differentiatiemedia op dag 12 vertoonden de aanwezigheid van volwassen myocyten en gefuseerde multinucleaire myotubes en waren vrij van fibroblasten en adipocytenbesmetting.Bij het gebruik van deze techniek om levende cellen te isoleren voor langdurige kweek, moeten onderzoekers ervoor zorgen dat ze aseptische techniek gebruiken en tegelijkertijd efficiënt werken om een goede levensvatbaarheid van de cel te garanderen.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Zuivering van voorlopercellen uit Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Identificatie en analyse van de muis erytroïde voorouders met behulp van de CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Een kwantitatieve test voor insuline-expressie Kolonie-vormende voorouders

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures voor Rat<em&gt; In situ</em&gt; Skeletspier contractiele eigenschappen

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolatie en Primaire Cultuur van Rat levercellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Beoordeling van Calcium Sparks in Intact Skeletal spiervezels

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolatie en karakterisering van exosomen uit skeletspierfibroblasten

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...