Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Wir danken den Flow Cytometry Core Facilities an der University of Ottawa und dem Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto, für ihre Expertise und Anleitung bei der Optimierung des in diesem Manuskript vorgestellten Durchflusszytometrie/FACS-Protokolls. Diese Arbeit wurde vom Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) an JB finanziert.

Ermittler, die dieses Protokoll durchführen, müssen die Erlaubnis ihres örtlichen Tierethikrates / Pflegeausschusses einholen. Alle Tierarbeiten wurden vom St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC #918) genehmigt und in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care (CCAC) durchgeführt. Ein Schema des Durchflusszytometrieprotokolls ist in Abbildung 1 dargestellt. Wenn die nachgeschaltete Anwendung FACS und nachfolgende Zellkultur is...

Ein optimiertes, validiertes FAPs-Isolationsprotokoll für den Rattenmuskel ist für Forscher unerlässlich, die Verletzungsmodelle untersuchen möchten, die bei der Maus aus biologischen oder technischen Gründen nicht durchführbar sind. Zum Beispiel sind Mäuse kein optimales Tiermodell, um chronische lokale oder neurodegenerative Verletzungen wie langfristige Denervierung zu untersuchen. Biologisch machen es die kurze Lebensdauer und die schnelle Alterung von Mäusen schwierig, die Muskelsequenzen aufgrund der Denerv...

Fibro-adipogene Vorläuferzellen (FAPs) sind eine Population von residenten multipotenten Vorläuferzellen in der Skelettmuskulatur, die eine entscheidende Rolle bei der Homöostase, Reparatur und Regeneration von Muskeln spielen und umgekehrt auch pathologische Reaktionen auf Muskelverletzungen vermitteln. Wie der Name schon sagt, wurden FAPs ursprünglich als Vorläuferpopulation mit dem Potenzial identifiziert, sich in Fibroblasten und Adipozyten zu differenzieren1 und galten als die Schlüsselmediatoren der Fibrofettinfiltration der Skelettmuskulatur bei chronischen Verletzungen und Krankheiten. Weitere Studien ergaben, dass FAPs zusätzlich zur Osteogenese und Chondrogenesefähigsind 2,3,4. So werden sie in der Literatur weiter gefasst als mesenchymale oder stromale Vorläufer 3 ,5,6,7,8. Bei akuten Skelettmuskelverletzungen helfen FAPs indirekt bei der regenerativen Myogenese, indem sie sich vorübergehend vermehren, um eine günstige Umgebung für aktivierte Muskelsatellitenzellen und ihre nachgeschalteten myogenen Vorläufer (MPs) -Gegenstücke1,9,10zuschaffen. Parallel zur erfolgreichen Regeneration durchlaufen FAPs eine Apoptose und bringen ihre Anzahl auf die Ausgangswerte1,9,10,11zurück. Im Gegensatz dazu überschreiben FAPs bei chronischen Muskelverletzungen pro-apoptotische Signale, was zu ihrer Persistenz9, 10, 11und abnormaler Muskelreparatur führt.
In vivo-Studien, die die zellulären und molekularen Mechanismen, mit denen FAPs Muskelreaktionen vermitteln, bewerten, haben bis heute murine Tiermodelleverwendet 1,7,9,10,11,12,13,14. Während gentechnisch veränderte Mäuse leistungsfähige Werkzeuge für diese Analysen sind, begrenzt die geringe Größe des Tieres die Gewebeverfügbarkeit für Studien in langfristigen lokalisierten Verletzungsmodellen, in denen Muskelschwund tiefgreifend sein kann, wie z.B. traumatische Denervierung. Darüber hinaus erfordert die Messung der Muskelkraft und der körperlichen Funktion Ex-vivo- oder In-situ-Messungen, die eine Beendigung der Maus erfordern, oder In-vivo-Methoden, die eine Operation und/oder eine Vollnarkose erfordern, um die Beurteilung der kontraktilen Muskelleistung zu ermöglichen15,16,17,18,19,20 . Bei Ratten existieren gut validierte und global genutzte Muskelfunktionsanalysen sowie Analysen für komplexere motorische Verhaltensweisen wie Ganganalysen (z. B. Ischiasfunktionsindex, CatWalk-Analyse) und werden bei wachen und sich spontan bewegenden Tieren durchgeführt21,22,23,24 . Dies optimiert zusätzlich die Prinzipien der minimalen Morbidität im Tierversuch und die Anzahl der verwendeten Versuchstiere. Die Ratte bietet dem FAPs-Forscher dadurch die zusätzliche Flexibilität eines größeren verletzten Muskelvolumens für Protein- und Zellanalysen und die Möglichkeit, serielle Bewertungen der statischen und dynamischen funktionellen Aktivität und des Verhaltens von Muskelkomplexen im Alarmtier durchzuführen.
FAPs wurden in erster Linie identifiziert und aus ganzen Muskelproben mittels Durchflusszytometrie bzw. Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert. Dies sind laserbasierte Assays, die in der Lage sind, mehrere spezifische Zellpopulationen basierend auf charakteristischen Merkmalen wie Größe, Granularität und einer spezifischen Kombination von Zelloberfläche oder intrazellulären Markern zu identifizieren25. Dies ist sehr vorteilhaft bei der Untersuchung eines Organsystems wie der Skelettmuskulatur, da Homöostase und Regeneration komplexe, multifaktorielle Prozesse sind, die von einer Vielzahl von Zelltypen koordiniert werden. Eine bahnbrechende Studie identifizierte SOWOHL FAPs als auch MPs unter Verwendung durchflusszytometrischer Methoden in der Skelettmuskulatur der Maus1. Sie zeigten, dass FAPs mesenchymaler Natur sind, da ihnen Oberflächenantigene fehlten, die für Zellen aus endothelialen (CD31), hämatopoetischen (CD45) oder myogenen (Integrin-α7 [ITGA7]) Ursprüngen spezifisch waren, aber den mesenchymalen Stammzellmarker Sca-1 (Stammzellantigen 1)1 exprimierten und in Kultur in fibrogene und adipogene Zellen differenzierten. Andere Studien zeigten eine erfolgreiche Isolierung von mesenchymalen Vorläuferzellen im Muskel basierend auf der Expression eines alternativen Stammzellmarkers, des aus Thrombozyten abgeleiteten Wachstumsfaktorrezeptors alpha (PDGFRα)2,7,8, und weitere Analysen ergaben, dass es sich wahrscheinlich um die gleiche Zellpopulation wie FAPs3 handelt. FAPs werden jetzt häufig in der Durchflusszytometrie identifiziert, indem entweder Sca-1 oder PDGFRα als positiver Selektionsmarker1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Die Verwendung von PDGFRα ist jedoch für menschliches Gewebe bevorzugt, da ein direkter menschlicher Homolog von murinem Sca-1 noch identifiziert werden muss32. Darüber hinaus wurden andere Zelloberflächenproteine als Marker für MPs (z. B. VCAM-1) berichtet, die eine potenzielle Alternative zu ITGA7 als Indikator für Zellen myogener Abstammung während der FAPs-Isolierung33darstellen.
Während die Durchflusszytometrie / FACS eine leistungsfähige Methodik zur Untersuchung der Rolle und des pathogenen Potenzials von FAPs in der Skelettmuskulatur1,9,10,11,13,29ist sie technisch durch die Spezifität und Optimierung der erforderlichen Reagenzien begrenzt. Da die durchflusszytometrische Identifizierung und Isolierung von FAPs in den Maustiermodellen1,9,10,11,29entwickelt und durchgeführt wurde, stellt dies Forscher, die FAPs in anderen Modellorganismen untersuchen möchten, vor Herausforderungen. Viele Faktoren - wie die optimale zu verarbeitende Gewebegröße sowie die Reagenzien- und/oder Antikörperspezifität und -verfügbarkeit - unterscheiden sich je nach verwendeter Spezies.
Zusätzlich zu den technischen Hindernissen für die Untersuchung von FAPs in einem neuartigen Tiermodell wurden sie weitgehend in einem akuten, toxischen Umfeld untersucht - in der Regel durch intramuskuläre chemische Injektion oder Cardiotoxin. Die Bewertung der langfristigen Dynamik von FAPs beschränkt sich in erster Linie auf die Beurteilung der Duchenne-Muskeldystrophie unter Verwendung des mdx-Mausmodells9,10,11und Modellen von Kombinationsmuskelverletzungen wie massivem Rotatorenmanschettenriss, bei dem gleichzeitige Sehnentransfektion und Denervierung an der Schultermuskulatur durchgeführt wird26,27,28 . Die Reaktion der FAPs auf die alleinige Beleidigung der chronischen traumatischen Denervierung, ein häufiges Auftreten bei Arbeitsunfällen in der Schwerindustrie, der Landwirtschaft und bei Geburtstraumata (Plexus brachialis)34,35,36,37 mit signifikanter Morbidität, wurde nicht so gut charakterisiert, oft auf einen kurzfristigen Zeitrahmen beschränkt11,38.
Wir beschreiben eine Methode zur Identifizierung und Isolierung von FAPs und MPs aus gesunden sowie stark atrophischen und fibrotischen Skelettmuskeln bei der Ratte. Zunächst wird die Identifizierung von CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-FAPs und CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+-MPs unter Verwendung eines Gewebeaufschluss- und Durchflusszytometrie-Färbeprotokolls demonstriert und die anschließende Validierung unserer Ergebnisse erfolgt durch Kultur und immunzytochemische Färbung von FACS-isolierten Zellen. Mit dieser Methode berichten wir auch über einen neuartigen FAPs-Zeitverlauf in einem langfristigen isolierten Denervierungsverletzungsmodell bei der Ratte.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

Fibro-adipogene Vorläufer (FAPs) sind residente interstitielle Zellen in der Skelettmuskulatur, die zusammen mit myogenen Vorläufern (MPs) eine Schlüsselrolle bei der Homöostase, Verletzung und Reparatur von Muskeln spielen. Aktuelle Protokolle zur Identifizierung und Isolierung von FAPs verwenden Durchflusszytometrie/Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) und Studien zur Bewertung ihrer Funktion in vivo wurden bisher ausschließlich an Mäusen durchgeführt. Die größere inhärente Größe der Ratte ermöglicht eine umfassendere Analyse von FAPs in Skelettmuskelverletzungsmodellen, insbesondere bei stark atrophischen Muskeln oder wenn Forscher eine erhebliche Gewebemasse benötigen, um mehrere nachgeschaltete Assays durchzuführen. Die Ratte bietet zusätzlich eine größere Auswahl an Muskelfunktionsassays, die keine Sedierung oder Tötung von Tieren erfordern, wodurch die Morbidität und der Tiereinsatz minimiert werden, indem sie serielle Bewertungen ermöglicht. Die für Mäuse optimierten Durchflusszytometrie/FACS-Protokolle sind speziesspezifisch und insbesondere durch die Eigenschaften kommerziell erhältlicher Antikörper eingeschränkt. Sie wurden nicht für die Trennung von FAPs von Ratten oder stark fibrotischen Muskeln optimiert. Es wurde ein Durchflusszytometrie/FACS-Protokoll zur Identifizierung und Isolierung von FAPs und MPs sowohl aus gesunden als auch aus entferneten Rattenskelettmuskeln entwickelt, das sich auf die differentielle Expression der Oberflächenmarker CD31, CD45, Sca-1 und VCAM-1 stützt. Da rattenspezifische, durchflusszytometrie-validierte primäre Antikörper stark begrenzt sind, wurde eine interne Konjugation des Antikörpers, der auf Sca-1 abzielt, durchgeführt. Mit diesem Protokoll wurde die erfolgreiche Sca-1-Konjugation bestätigt und die durchflusszytometrische Identifizierung von FAPs und MPs durch Zellkultur und Immunfärbung von FACS-isolierten FAPs und MPs validiert. Schließlich berichten wir über einen neuartigen FAPs-Zeitverlauf in einem verlängerten (14 Wochen) Rattendenervierungsmodell. Diese Methode bietet den Forschern die Möglichkeit, FAPs in einem neuartigen Tiermodell zu untersuchen.

Identifizierung von FAPs und MPs mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung eines neuartigen Antikörperpanels einschließlich Sca-1 und VCAM-1 Die Gating-Strategie zur Identifizierung von FAPs im Rattenmuskel basiert auf Durchflusszytometrie-Protokollen in der Maus29, die auf CD31 (Endothel) und CD45 (hämatopoetische) positive Zellen (die sogenannte Abstammung [Lin]) gelangen und das fluoreszierende Profil des FAPs-Marker...

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Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) aus dem Skelettmuskel der Ratte. Die Verwendung der Ratte in Muskelverletzungsmodellen bietet eine erhöhte Gewebeverfügbarkeit von atrophischen Muskeln für die Analyse und ein größeres Repertoire an validierten Methoden zur Beurteilung von Muskelkraft und Gang bei frei beweglichen Tieren.

Identifizierung, Isolierung und Charakterisierung von fibro-adipogenen Vorläufern (FAPs) und myogenen Vorläufern (MPs) in der Skelettmuskulatur der Ratte

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Da FAPs Mediatoren der Muskelregeneration und pathologischen Fibrose sind, ermöglicht unser Protokoll die Charakterisierung der FAP-Dynamik nach einer Muskelverletzung und die Isolierung von FAPs für In-vitro- oder Ex-vivo-Studien. Bisher wurden Studien ausschließlich an FAPs durchgeführt, die aus Mäusen isoliert wurden. Unser Protokoll ermöglicht eine effektive Isolierung von FAPs von der größeren Ratte und bietet eine viel größere Gewebeverfügbarkeit für nachgelagerte Assays.Eine längere Gewebeverarbeitungszeit kann sich negativ auf die Lebensfähigkeit von FAPs auswirken. Wenn mehrere Proben gleichzeitig verarbeitet werden, wird empfohlen, dass zwei Bediener das Protokoll zusammen ausführen, um die Lebensfähigkeit isolierter Zellen zu maximieren. Beginnen Sie damit, das entnommene Muskelgewebe in eine sterile 10 Zentimeter große Zellkulturschale zu legen.Reißen und zerkleinern Sie das Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette und entfernen Sie das Bindegewebe, um etwa drei bis vier Millimeter gewürfelte Stücke zu erhalten. Übertragen Sie das Münstergewebe in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das sechs Milliliter DMEM und 1% Penicillin-Streptomycin enthält. Als nächstes aktivieren Sie 365 Mikroliter Kollagenase-II-Lösung, indem Sie 10 Mikroliter 300-Millimol-Calciumchloridlösung hinzufügen.Die aktivierte Kollagenase-II-Lösung wird der Gewebeschlämme für eine Endkonzentration von 250 Einheiten pro Milliliter zugegeben. Inkubieren Sie die Röhrchen in einem Shaker für eine Stunde und bei 37 Grad Celsius bei 240 x g mit manueller Bewegung alle 15 Minuten, um das an der Seite des Röhrchens haftende Gewebe zu entfernen. Nach einer Stunde Inkubation 100 Mikroliter Kollagenase II und 50 Mikroliter Dispase in die Probe geben.Anschließend werden die Proben 15 bis 20 Mal mit einer serologischen Pipette pipettiert, bis die Lösung homogen ist. Inkubieren Sie die Probe erneut für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius und 240 x g mit manueller Bewegung alle 15 Minuten. Scheren Sie die Muskellösungsproben langsam durch eine 20-Milliliter-Spritze mit einer 20-Gauge-Nadel für 10 Zyklen.Legen Sie dann ein 40-Mikron-Zellsieb auf ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen und befeuchten Sie es, indem Sie fünf Milliliter DMEM pipettieren, ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin. Die Probe einen Milliliter nach dem anderen durch das Sieb pipettieren. Sobald die gesamte Probe filtriert ist, waschen Sie das Zellsieb mit DMEM, ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin, um das Gesamtvolumen der Probe auf 25 Milliliter zu bringen.Teilen Sie das Probenvolumen gleichmäßig in zwei konische 15-Milliliter-Röhrchen auf und zentrifugieren Sie bei 15 Grad Celsius, 400 x g für 15 Minuten. Nach der Zentrifugation den Überstand absaugen und das Pellet in einem Milliliter RBC-Lysepuffer bei Raumtemperatur sieben Minuten lang resuspenieren. Dann fügen Sie neun Milliliter Waschpuffer hinzu, um das Volumen auf 10 Milliliter zu bringen, und zentrifugieren Sie bei 15 Grad Celsius, 400 x g für 15 Minuten.Nach der Zentrifugation den Überstand absaugen und das Pellet in einem Milliliter Waschpuffer resuspen. Übertragen Sie ein geeignetes Zellvolumen in ein separates 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie es mit trypanblauem Farbstoff. Zählen Sie lebende Zellen auf einem Lichtmikroskop mit einem Hämozytometer.Für die Durchflusszytometrie werden ein bis 2 Millionen Zellen pro Versuchsprobe in ein steriles 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Das Probenvolumen mit Waschpuffer auf einen Milliliter bringen und das Röhrchen auf Eis legen. Richten Sie alle Steuerelemente für das Experiment ein.Für Zellkontrollen aliquot 500.000 bis 1 Million Zellen in einem Milliliter Waschpuffer in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und auf Eis legen. Wenn das Experiment zum ersten Mal durchgeführt wird, sollten auch einzelgefärbte Zellsuspensionen enthalten sein. Um Perlensteuerungen einzurichten, fügen Sie jedem beschrifteten 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen etwa 150.000 positive Kompensationsperlen hinzu.Bereiten Sie die Lebensfähigkeitskontrolle vor, indem Sie die Hälfte des Zellvolumens aus dem Lebensfähigkeitsröhrchen übertragen, um das als tot markierte 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aufzufrischen. Inkubieren Sie das tote Rohr bei 65 Grad Celsius für zwei bis drei Minuten und legen Sie es dann auf Eis. Nach der Inkubation die toten Zellen in das Lebensfähigkeitsrohr zurückbringen.Die Einzelzellsuspensionen inklusive Versuchs- und Kontrollproben bei 500 x g und vier Grad Celsius fünf Minuten lang zentrifugieren und die Zellpellets nach dem Ansaugen des Überstandes in 100 Mikroliter Waschpuffer resuspenieren. Fügen Sie Antikörper entsprechend der Kontroll- oder Versuchsbedingungen hinzu und streichen Sie die Probe vorsichtig, um ein vollständiges Mischen zu gewährleisten. Dann inkubieren Sie sie 15 Minuten lang im Dunkeln auf Eis.Zum Ausgleich der Kügelchen das Röhrchen bei Raumtemperatur im Dunkeln 15 Minuten lang inkubieren. Bringen Sie das Volumen jeder Probe auf einen Milliliter, indem Sie der Einzelzellensuspension 900 Mikroliter Waschpuffer und 900 Mikroliter PBS für die Kompensationsperlenkontrolle hinzufügen. Zentrifugieren Sie Einzelzellsuspensionen bei 500 x g und vier Grad Celsius für fünf Minuten und Kompensationsperlenkontrollen bei 300 x g und vier Grad Celsius für fünf Minuten.Nach der Zentrifugation der Proben den Überstand absaugen und das Zellpellet in 300 Mikrolitern Waschpuffer und Perlenkontrollen in 300 Mikroliter PBS und 150.000 negativen Kompensationsperlen resuspendieren. Bewahren Sie die Zellproben auf Eis und Perlenproben bei Raumtemperatur unter Aluminiumfolie auf. Fahren Sie mit dem Erwerb der Durchflusszytometrie fort, indem Sie die Gating-Strategie zur Identifizierung von fibro-adipogenen Vorläufern und myogenen Vorläufern einrichten.In der repräsentativen Analyse wurde die erfolgreiche Konjugation des Sca-1 APC-Antikörpers mit Einzelfärbung von Kompensationsperlen und Zellsuspensionen, die aus einem gesunden Ratten-Gastrocnemius-Muskel erzeugt wurden, bestätigt. Fünf verschiedene Konzentrationen von Sca-1 APC wurden auf Einzelzellsuspensionen titriert, und die optimale Konzentration des Antikörpers wurde basierend auf der größten Fluoreszenzintensität mit minimaler Hintergrundfärbung identifiziert. Durchflusszytometrische Identifizierungen von FAPs und MPs in Ratten-Gastrocnemius wurden unter Verwendung der hier gezeigten Gating-Strategie durchgeführt.Die Proben wurden zuerst eingegrenzt, um Ablagerungen beim Zählen von Perlen auszuschließen. Die Zellen wurden dann gated, um Dubletten sowohl durch Frontstreuung als auch durch Seitenstreuung auszuschließen. Die Lebensfähigkeit der resultierenden Zellen wurde durch Färbung mit SYTOX Blue beurteilt.SYTOX Blue negative Singulette wurden für CD31 und CD45 bewertet, um Lin+-Fraktionen auszuschließen. Die Lin-Population wurde bewertet. Zellen, die für Sca-1 einzeln positiv waren, wurden als FAPs und Zellen, die für VCAM-1 einzeln positiv waren, als MPs bezeichnet.Mit Co-Immunfärbung unmittelbar nach der Sortierung zeigte die frisch isolierte Population von FAPs eine positive Färbung für PDGFRalpha ohne Kontamination durch Pax7-positive Zellen. Umgekehrt gefärbte die sortierte Population von ABGEORDNETEN positiv auf Pax7 mit einem Fehlen von PDGFRalpha-positiven Zellen. FAPs zeigten differenzierte Fibroblasten und Adipozyten an Tag 12 in adipogenen Differenzierungsmedien mit Expression von Fibroblasten-spezifischem Protein 1 bzw. Perilipin 1.Das Vorhandensein von neutralen Triglyceriden und Lipiden aus reifen Adipozyten war bei der Oil Red O-Färbung offensichtlich. Darüber hinaus zeigten die FAPs ein Vorhandensein von Kollagen Typ I und das Fehlen von kontaminierenden Myozyten. MPs, die am Tag 12 in myogenen Differenzierungsmedien gezüchtet wurden, zeigten das Vorhandensein von reifen Myozyten und fusionierten mehrkernigen Myotuben und waren frei von Fibroblasten und Adipozytenkontamination.Bei der Verwendung dieser Technik zur Isolierung lebender Zellen für die Langzeitkultur müssen die Forscher sicherstellen, dass sie aseptische Techniken anwenden und gleichzeitig effizient arbeiten, um eine gute Zelllebensfähigkeit zu gewährleisten.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Forschung

Biologie

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Identifikation und Analyse von Maus Erythroid Vorläufern mit dem CD71/TER119 Durchflusszytometrische Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

A Quantitative Assay für Insulin-exprimierenden Koloniebildende Vorläufern

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Verfahren für die Ratte<em&gt; In situ</em&gt; Skeletal Muscle kontraktilen Eigenschaften

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolierung und Primärkultur von Ratten Leberzellen

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolierung und Charakterisierung von Exosomen aus Skelettmuskelfibroblasten

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Isolierung von Maus-Megakaryozyten-Vorläufern

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...