Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

ברצוננו להודות למתקני הליבה של ציטומטריית הזרימה באוניברסיטת אוטווה ולמרכז המחקר קינן למדעים ביו-רפואיים (KRC), לבית החולים סנט מייקלס בריאות מאוחדת טורונטו על המומחיות וההדרכה שלהם באופטימיזציה של פרוטוקול ציטומטריית הזרימה / FACS המוצג בכתב יד זה. עבודה זו מומנה על ידי רפואה על ידי קרן עיצוב רעיונות חדשים 2018 (MbDNI-2018-01) ל- JB.

חוקרים המבצעים פרוטוקול זה חייבים לקבל אישור מוועדת האתיקה / ועדת הטיפול המקומית שלהם בבעלי חיים. כל עבודות בעלי החיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של בית החולים סנט מייקל בטורונטו (ACC #918) ובוצעו בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים (CCAC). תרשים של פרוטוקול ציט...

פרוטוקול בידוד FAPs מותאם ומאומת לשרירי חולדות חיוני לחוקרים המעוניינים לחקור מודלים לפציעות שאינם אפשריים בעכבר מסיבות ביולוגיות או טכניות. לדוגמה, עכברים אינם מודל בעלי חיים אופטימלי שבו לחקור פגיעות מקומיות כרוניות, או ניווניות כגון denervation לטווח ארוך. מבחינה ביולוגית, תוחלת החיים הקצרה...

תאי אב פיברו-אדיפוגניים (FAPs) הם אוכלוסייה של תאי אב רב-תכליתיים בשריר השלד הממלאים תפקיד קריטי בהומאוסטזיס שרירים, תיקון והתחדשות, ומנגד, גם מתווכים תגובות פתולוגיות לפגיעה בשרירים. כפי שהשם מרמז, FAPs זוהו במקור כאוכלוסייה ילידית עם פוטנציאל להבדיל לתוך פיברובלסטים אדיפוציטים1, היו אמורים להיות המתווכים העיקריים של חדירה פיברו-שומני של שריר השלד בפציעה כרונית ומחלות. מחקר נוסף גילה כי FAPs מסוגלים בנוסף אוסטוגנזה וכונדרוגנזה2,3,4. לכן, הם נרשמים באופן רחב יותר בספרות כמו אבות mesenchymal או סטרומי3,5,6,7,8. בפגיעה חריפה בשריר השלד, FAPs בעקיפין לסייע myogenesis התחדשות על ידי התפשטות חולפת כדי לספק סביבה נוחה עבור תאי לווין שריר מופעל שלהם במורד הזרם myogenic אבות (MPs) עמיתיהם1,9,10. במקביל להתחדשות מוצלחת, FAPs עוברים אפופטוזיס, מחזירים את מספרם לרמות בסיסיות1,9,10,11. לעומת זאת, בפציעה כרונית בשריר, FAPs לעקוף אותות פרו-אפופטוטיים, אשר התוצאההיא ההתמדהשלהם 9,10,11 ותיקון שרירים חריג.
במחקרים של vivo המעריכים את המנגנונים התאיים והמולקולריים שבאמצעותם FAPs מתווכים תגובות שרירים השתמשו במודלים של בעלי חיים מורינים עד כה1,7,9,10,11,12,13,14. בעוד עכברים מהונדסים גנטית הם כלים רבי עוצמה לשימוש ניתוחים אלה, הגודל הקטן של החיה מגביל את זמינות הרקמות למחקר במודלים פציעה מקומית לטווח ארוך שבו ניוון שרירים יכול להיות עמוק, כגון denervation טראומטי. יתר על כן, מדידת כוח השריר ותפקוד פיזי דורשת ex vivo או מדידות במקום המחייבות סיום של העכבר, או בשיטות vivo הדורשות ניתוח ו/או הרדמה כללית כדי לאפשר הערכה של ביצועי התכווצותשרירים 15,16,17,18,19,20 . בחולדות, ניתוחים תפקודיים שרירים מאומתים היטב ומנוצלים ברחבי העולם, בנוסף לניתוחים להתנהגויות מוטוריות מורכבות יותר כגון ניתוח הליכה (למשל, מדד תפקודים סיאטיים, ניתוח מסלול) קיימים ומבוצעים בבעלי חיים ערים ונועים באופן ספונטני21,22,23,24 . זה גם מייעל את העקרונות של תחלואה מינימלית בניסויים בבעלי חיים, ומספרי בעלי החיים במחקר בשימוש. החולדה ובכך מספקת לחוקר FAPs את הגמישות הנוספת של נפח שרירים פגוע גדול יותר עבור ניתוחי חלבון ותאים ואת היכולת לבצע הערכות סדרתיות של פעילות והתנהגויות תפקודיות סטטיות ודינמיות מורכבות שרירים, בחיה המתריעה.
FAPs זוהו בעיקר ובודדו מדגימות שרירים שלמות באמצעות ציטומטריית זרימה ומיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) בהתאמה. אלה הם בדיקות מבוססות לייזר המסוגלות לזהות אוכלוסיות תאים ספציפיות מרובות בהתבסס על תכונות אופייניות כגון גודל, פירוט, ושילוב ספציפי של פני תא או סמנים תאיים25. זה יתרון רב במחקר של מערכת איברים כגון שריר השלד, כמו הומאוסטזיס והתחדשות הם תהליכים מורכבים, רב-גורמיים מתואמים על ידי שפע של סוגי תאים. מחקר מכונן זיהה FAPs, כמו גם חברי פרלמנט, באמצעות שיטות ציטומטריות זרימה בשריר השלד של העכבר1. הם הוכיחו כי FAPs הם mesenchymal בטבע, כפי שהם חסרים אנטיגנים פני השטח ספציפי לתאים מן אנדותל (CD31), hematopoietic (CD45), או מיוגניים (Integrin-α7 [ITGA7]) מקורות, אבל ביטא את סמן תא גזע mesenchymal Sca-1 (אנטיגן תא גזע1) 1 מובחן לתאים פיברוגניים אדיפוגניים בתרבות. מחקרים אחרים הדגימו בידוד מוצלח של אבות מזנכימלים בשריר בהתבסס על ביטוי של סמן תאי גזע חלופי, קולטן גורם גדילה נגזר טסיות דם אלפא (PDGFRα)2,7,8 וניתוח נוסף גילה אלה צפויים להיות אותה אוכלוסיית תאים כמו FAPs3. FAPs מזוהים כעת בציטומטריית זרימה באמצעות Sca-1 או PDGFRα כסמן בחירה חיובי1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . השימוש PDGFRα הוא מועדף על רקמה אנושית עם זאת, כמו הומולוג אנושי ישיר של מורין Sca-1 עדיין לא זוהה32. בנוסף, חלבונים אחרים על פני התא דווחו כסמנים של חברי פרלמנט (למשל, VCAM-1), המספקים חלופה פוטנציאלית ל- ITGA7 כאינדיקטור לתאי שושלת מיוגנית במהלך בידוד FAPs33.
בעוד cytometry זרימה / FACS היא מתודולוגיה רבת עוצמה לחקר התפקיד ואת הפוטנציאל הפתוגניים של FAPs בשריר השלד1,9,10,11,13,29, הוא מוגבל מבחינה טכנית על ידי הספציפיות והאופטימיזציה של ריאגנטים הנדרשים שלה. מאז זיהוי ציטומטרי זרימה ובידוד של FAPs פותח ונערך במודלים של חיות עכבר1,9,10,11,29, זה מציב אתגרים עבור חוקרים המעוניינים לחקור FAPs באורגניזמים מודל אחרים. גורמים רבים - כגון גודל רקמות אופטימלי לעיבוד, כמו גם ריאגנט ו / או ייחודיות נוגדנים וזמינות - שונים בהתאם למין המשמש.
בנוסף למחסומים הטכניים לחקר FAPs במודל בעלי חיים חדשני, הם נחקרו במידה רבה בסביבה חריפה ורעילה - בדרך כלל באמצעות הזרקה כימית תוך שרירית או cardiotoxin. הערכת הדינמיקה ארוכת הטווח של FAPs מוגבלת בעיקר להערכה בניוון השרירים של דושן, באמצעות עכבר mdx מודל9,10,11, ומודלים של פגיעה שרירים משולבת כגון קרע מסיבי בשרוול סיבוב שבו טרנספר גיד בו זמנית ו denervation מבוצע על שריריהכתף 26,27,28 . התגובה של FAPs לעלבון הבלעדי של denervation טראומטי כרוני, תופעה שכיחה בתאונות במקום העבודה בתעשייה כבדה, בחקלאות, ובטראומות לידה (פגיעת מקלעת ברכיאלית)34,35,36,37עםתחלואה משמעותית, לא היה מאופיין היטב, לעתים קרובות מוגבל למסגרת זמן לטווח קצר11,38.
אנו מתארים שיטה לזיהוי ובידוד של FAPs וחברי פרלמנט משריר שלד בריא, כמו גם ניוון וסיברוטי חמור בחולדה. ראשית, זיהוי של CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs ו- CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ חברי פרלמנט באמצעות עיכול רקמות ופרוטוקול הכתמת ציטומטריה של זרימה מוצג ואימות לאחר מכן של הממצאים שלנו מתבצע באמצעות תרבית והכתמה חיסונית של תאים מבודדים FACS. באמצעות שיטה זו, אנו מדווחים גם על קורס זמן חדש של FAPs במודל פגיעה מבודד לטווח ארוך בחולדה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) הם תאים ביניים המתגוררים בשריר השלד, שיחד עם אבות מיוגניים (חברי פרלמנט) ממלאים תפקיד מפתח בהומאוסטזיס שרירים, פציעה ותיקון. הפרוטוקולים הנוכחיים לזיהוי FAPs ובידוד משתמשים בציטומטריה של זרימה/מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנטיות (FACS) ומחקרים המעריכים את תפקודם ב-vivo עד כה בוצעו אך ורק בעכברים. הגודל הטבוע הגדול יותר של החולדה מאפשר ניתוח מקיף יותר של FAPs במודלים לפגיעה בשרירי השלד, במיוחד בשריר ניוון חמור או כאשר החוקרים דורשים מסת רקמה משמעותית כדי לבצע בדיקות מרובות במורד הזרם. החולדה מספקת בנוסף מבחר גדול יותר של בדיקות תפקודיות שרירים שאינן דורשות סדציה או הקרבה של בעלי חיים, ובכך מזעור התחלואה והשימוש בבעלי חיים על ידי הפעלת הערכות סדרתיות. פרוטוקולי ציטומטריית הזרימה/FACS הממוטבים לעכברים הם ספציפיים למינים, במיוחד מוגבלים על ידי המאפיינים של נוגדנים זמינים מסחרית. הם לא עברו אופטימיזציה להפרדת FAPs מעכברוש או שריר סיבי מאוד. פרוטוקול ציטומטריית זרימה /FACS לזיהוי ובידוד של FAPs וחברי פרלמנט משריר השלד של חולדה בריא ופגום פותח, תוך הסתמכות על הביטוי הדיפרנציאלי של סמני פני השטח CD31, CD45, Sca-1 ו- VCAM-1. מכיוון שנוגדנים ראשיים מאומתים בציטומטריה של זרימה מוגבלים מאוד, בוצעה הטיות פנימיות של הנוגדן שמכוון ל-Sca-1. באמצעות פרוטוקול זה, הטיות מוצלחות של Sca-1 אושרו, וזיהוי ציטומטרי של FAPs וחברי פרלמנט אומת על ידי תרבית תאים וחיסון של FAPs וחברי פרלמנט מבודדים FACS. לבסוף, אנו מדווחים על קורס זמן FAPs חדשני במודל גינה ממושכ (14 שבועות) חולדה. שיטה זו מספקת לחוקרים את היכולת לחקור FAPs במודל בעלי חיים חדשני.

זיהוי FAPs וחברי פרלמנט באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות לוח נוגדנים חדשני כולל Sca-1 ו- VCAM-1 אסטרטגיית הגינג לזיהוי FAPs בשריר החולדה מבוססת על פרוטוקולי ציטומטריית זרימה בעכבר29, אשר שער על CD31 (אנדותל) ו CD45 (hematopoietic) תאים חיוביים (המכונה שושלת ה...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

פרוטוקול זה מתאר שיטה לבודד אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ואבים מיוגניים (MPs) משרירי השלד של חולדה. ניצול החולדה במודלים של פגיעה בשרירים מספק זמינות רקמות מוגברת משריר אטרופי לניתוח ורפרטואר גדול יותר של שיטות מאומתות להערכת כוח השריר וההליכה בבעלי חיים הנעים חופשיים.

זיהוי, בידוד ואפיון של אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) ואבעות מיוגניים (חברי פרלמנט) בשריר השלד בחולדה

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

כמו FAPs הם מתווכים של התחדשות שרירים ופיברוזיס פתולוגי, הפרוטוקול שלנו מאפשר אפיון של דינמיקה FAP לאחר פגיעה בשרירים ובידוד של FAPs למחקרי הפריה ויהו או ex vivo. עד כה, מחקרים בוצעו באופן בלעדי על FAPs מבודד מעכברים. הפרוטוקול שלנו מאפשר בידוד יעיל של FAPs מהעכברוש הגדול יותר, ומספק זמינות רקמות גדולה בהרבה לבדיקות במורד הזרם.זמן עיבוד רקמות ממושך יכול להשפיע לרעה על הכדאיות של FAPs. אם דגימות מרובות מעובדות בו-זמנית, מומלץ ששני אופרטורים יבצעו את הפרוטוקול במקביל כדי למקסם את הכדאיות של תאים מבודדים. התחל על ידי הצבת רקמת השריר שנקטפה בצלחת תרבית תאים סטרילית של 10 ס"מ.קורעים בעדינות ומרכלים את הרקמה במלקחיים ומסירים רקמת חיבור כדי להשיג כשלושה עד ארבעה מילימטרים. מעבירים את רקמת המינסטר לצינור חרוט סטרילי של 50 מיליליטר המכיל שישה מיליליטר של DMEM ו-1%פניצילין-סטרפטומיצין. לאחר מכן, הפעל 365 מיקרוליטרים של תמיסת קולגנאז II על ידי הוספת 10 מיקרוליטרים של תמיסת סידן כלוריד 300 מילימולר.מוסיפים את תמיסת collagenase II מופעלת לריכוז סופי של 250 יחידות למיליליטר. לדגור את הצינורות בשייקר במשך שעה אחת וב 37 מעלות צלזיוס ב 240 x g עם תסיסה ידנית כל 15 דקות כדי לעקור רקמה דבוקה לצד הצינור. לאחר שעה של דגירה, להוסיף 100 microliters של collagenase II ו 50 microliters של dispase לדגימה.לאחר מכן, פיפטה דגימות 15 עד 20 פעמים עם פיפטה סרולוגית עד הפתרון הוא הומוגני. לדגור את המדגם שוב במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 240 x g עם תסיסה ידנית כל 15 דקות. לאט לאט לגזור את דגימות פתרון השריר דרך מזרק 20 מיליליטר עם מחט 20 מד במשך 10 מחזורים.לאחר מכן, מניחים מסננת תאים של 40 מיקרון על צינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר והרטיבו אותו על ידי צנרת חמישה מיליליטר של DMEM בתוספת 10% FBS ו 1%פניצילין-סטרפטומיצין. פיפטה הדגימה מיליליטר אחד בכל פעם דרך מסננת. לאחר המדגם כולו מסונן, לשטוף את מסננת התא עם DMEM בתוספת עם 10%FBS ו 1%פניצילין-סטרפטומיצין להביא את הנפח הכולל של מדגם ל 25 מיליליטר.לפצל את נפח המדגם באופן שווה לשני צינורות חרוט 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב 15 מעלות צלזיוס, 400 x גרם במשך 15 דקות. לאחר צנטריפוגה, לשאוף supernatant ו resuspend הכדור במיליליטר אחד של חוצץ תמוגה RBC בטמפרטורת החדר במשך שבע דקות. לאחר מכן, להוסיף תשעה מיליליטר של חוצץ לשטוף כדי להביא את הנפח ל 10 מיליליטר וצנטריפוגה ב 15 מעלות צלזיוס, 400 x גרם במשך 15 דקות.לאחר צנטריפוגה, לשאוף supernatant ו resuspend הכדור במיליליטר אחד של חוצץ לשטוף. העבר נפח מתאים של תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד של 1.5 מיליליטר וערבוב אותו עם צבע כחול טריפן. לספור תאים חיים על מיקרוסקופ אור באמצעות hemocytometer.עבור ציטומטריית זרימה, העבר אחד עד 2 מיליון תאים לכל דגימה ניסיונית לצינור מיקרוצנטריפוגה סטריליטר 1.5 מיליליטר. מביאים את נפח המדגם למיליליטר אחד עם חוצץ כביסה, ומניחים את הצינור על קרח. הגדר את כל הפקדים לניסוי.עבור פקדי תאים, aliquot 500, 000 עד 1 מיליון תאים במיליליטר אחד של חוצץ לשטוף בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר ולהניח אותו על קרח. אם הניסוי מתבצע בפעם הראשונה, מתלים תאים מוכתמים יחיד צריך להיכלל גם. כדי להגדיר פקדי חרוזים, הוסף כ-150,000 חרוזי פיצוי חיוביים לכל צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר שכותרתו.הכן את בקרת הכדאיות על ידי העברת מחצית מנפח התא מצינור הכדאיות לרענון צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר שכותרתו מתה. לדגור על הצינור המת ב 65 מעלות צלזיוס במשך שתיים עד שלוש דקות, ולאחר מכן למקם אותו על קרח. לאחר הדגירה, להחזיר את התאים המתים לצינור הכדאיות.צנטריפוגה ההשעיות של תא יחיד, כולל דגימות ניסיוניות ושליטה ב 500 x g ו 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, ו resuspend כדורי התא ב 100 microliters של חוצץ לשטוף לאחר שאיפה supernatant. הוסיפו נוגדנים בהתאם לבקרה או למצב ניסיוני, והעבירו בעדינות את הדגימה כדי להבטיח ערבוב מלא. לאחר מכן, לדגור אותם על קרח בחושך במשך 15 דקות.עבור חרוזי פיצוי, לדגור על הצינור בטמפרטורת החדר בחושך במשך 15 דקות. הבא את הנפח של כל דגימה למיליליטר אחד על-ידי הוספת 900 מיקרוליטרים של חוצץ כביסה למתלה של תא בודד, ו-900 מיקרוליטרים של PBS לבקרות חרוזים לפיצוי. צנטריפוגה מתלים חד-תאיים ב 500 x g ו 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות, וחרוז פיצוי שולט ב 300 x g וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.לאחר צנטריפוגה של הדגימות, לשאוף supernatant ול resuspend גלולה התא ב 300 microliters של חוצץ לשטוף, ובקרות חרוזים ב 300 microliters של PBS ו 150, 000 חרוזי פיצוי שליליים. שמור את דגימות התא על דגימות קרח וחרוזים בטמפרטורת החדר תחת רדיד אלומיניום. המשך ברכישת ציטומטריית זרימה על ידי הגדרת אסטרטגיית הגינג לזהות אבות פיברו-אדיפוגניים ואבים מיוגניים.בניתוח הייצוגי, הטיות מוצלחות של נוגדן Sca-1 APC עם כתם יחיד של חרוזי פיצויים השעיות תאים שנוצרו משריר גסטרוקנמיוס חולדה בריא אושר. חמישה ריכוזים שונים של נגמ"ש Sca-1 היו titrated על מתלים חד תא, ואת הריכוז האופטימלי של נוגדן זוהה בהתבסס על עוצמת הפלואורסצנטיות הגדולה ביותר עם כתמי רקע מינימליים. זיהויים ציטומטריים זרימה של FAPs וחברי פרלמנט בגסטרוקנימוס חולדה בוצע באמצעות אסטרטגיית הג'טינג המוצגת כאן.דגימות היו מגודרות לראשונה כדי לא לכלול פסולת בספירת חרוזים. לאחר מכן, התאים היו מגודרים כדי לא לכלול מכפילים הן לפיזור הקדמי והן לפיזור הצדדי. הכדאיות של תאים וכתוצאה מכך הוערך על ידי כתמים עם כחול SYTOX.סינגלים שליליים כחולים של SYTOX הוערכו עבור CD31 ו- CD45 כדי לא לכלול שברי Lin+ . אוכלוסיית לין נבדקה. תאים שהיו חיוביים יחיד עבור Sca-1 היו FAPs מיועדים, ותאים שהיו חיוביים יחיד עבור VCAM-1 היו חברי פרלמנט מיועדים.עם חיסון משותף מיד לאחר המיון, האוכלוסייה המבודדת טרייה של FAPs הציגה כתמים חיוביים עבור PDGFRalpha ללא זיהום על ידי תאים חיוביים Pax7. לעומת זאת, האוכלוסייה ממוינת של חברי פרלמנט מוכתמת חיובית עבור Pax7 עם היעדר תאים חיוביים PDGFRalpha. FAPs הדגימו פיברובלסטים מודבחנים ו adipocytes ביום 12 במדיה בידול אדיפוגני עם ביטוי של חלבון ספציפי פיברובלסט 1 ו perilipin 1, בהתאמה.נוכחותם של טריגליצרידים ניטרליים ושומנים מאדיפוציטים בוגרים ניכרה עם כתמי O אדום שמן. בנוסף, FAPs הפגינו נוכחות של סוג קולגן I והיעדר מיוציטים מזהמים. חברי פרלמנט שגדלו במדיה הבידול myogenic ביום 12 הציגו את נוכחותם של מיוציטים בוגרים ו myotubes רב גרעיני, והיו ברורים של פיברובלסטים וזיהום אדיפוציטים.בעת שימוש בטכניקה זו כדי לבודד תאים חיים לתרבות ארוכת טווח, החוקרים חייבים להבטיח להשתמש בטכניקה אספטית ובו זמנית לעבוד ביעילות כדי להבטיח כדאיות תאים טובה.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Assay כמותי עבור אינסולין להביע המושבה יוצרי אבות

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

נהלים לעכברוש<em&gt; באתר</em&gt; מאפייני התכווצות שרירי שלד

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

בידוד תרבות ראשונית של תאים בכבד עכברוש

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

בידוד ואפיון אקסוזומים מפיברובלסטים של שרירי השלד

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

בידוד אבות מקרוציטים עכבר

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...