Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

हम ओटावा विश्वविद्यालय में फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधाओं और बायोमेडिकल साइंसेज के लिए कीनन रिसर्च सेंटर (केआरसी), सेंट माइकल्स हॉस्पिटल यूनिटी हेल्थ टोरंटो को इस पांडुलिपि में प्रस्तुत प्रवाह साइटोमेट्री/एफएस प्रोटोकॉल के अनुकूलन में उनकी विशेषज्ञता और मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । इस काम को मेडिसिन द्वारा डिजाइन न्यू आइडियाज 2018 फंड (MbDNI-2018-01) द्वारा जेबी को वित्त पोषित किया गया था।

इस प्रोटोकॉल का संचालन करने वाले जांचकर्ताओं को अपने स्थानीय पशु नैतिकता बोर्ड/देखभाल समिति से अनुमति प्राप्त करनी चाहिए । सभी पशु काम सेंट माइकल अस्पताल एकता स्वास्थ्य टोरंटो पशु देखभाल समिति (एसीस...

चूहे की मांसपेशियों के लिए एक अनुकूलित, मान्य FAPs अलगाव प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं के लिए आवश्यक है जो चोट मॉडल का अध्ययन करना चाहते हैं जो जीवविज्ञान या तकनीकी कारणों से माउस में व्यवहार्य नहीं हैं। उदाहरण ?...

फाइब्रो-एडिपोजेनिक जनक कोशिकाएं (एफएपी) कंकाल की मांसपेशी में निवासी बहुपेंट जनक कोशिकाओं की आबादी है जो मांसपेशियों के होमोस्टेसिस, मरम्मत और पुनर्जनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, और इसके विपरीत, मांसपेशियों की चोट के लिए पैथोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं में मध्यस्थता भी करती हैं। जैसा कि नाम से पता चलता है, FAPs मूल रूप से फाइब्रोब्लास्ट और adipocytes 1 में अंतर करने की क्षमता के साथ एक जनकआबादी के रूप में पहचाने गए थे और पुरानी चोट और रोग में कंकाल की मांसपेशी के फाइब्रो-फैटी घुसपैठ के प्रमुख मध्यस्थों होने के लिए कथित थे । आगे के अध्ययन से पता चला है कि ̈पस ऑस्टियोजेनेसिस और कोंड्रोजेनेसिस 2,3,4में अतिरिक्त रूप से सक्षम हैं . इस प्रकार , वे साहित्य में अधिक मोटे तौर पर मेसेंचिमल या स्ट्रोमल जनक 3, 5 ,6,7,8के रूप में नतमकीतित हैं । तीव्र कंकाल मांसपेशियों की चोट में, FAPs अप्रत्यक्ष रूप से पुनर्योजी मायोजेनेसिस में सक्रिय मांसपेशियों की उपग्रह कोशिकाओं और उनके डाउनस्ट्रीम मायोजेनिक प्रोजेनिटर (सांसदों) समकक्षों के लिए अनुकूल वातावरण प्रदान करने के लिए क्षणिक रूप से प्रसारित करके1,9,10में सहायता करता है। सफल उत्थान के समानांतर, एफएपी को एपोप्टोसिस से गुजरना पड़ता है, जो उनकी संख्या कोबेसलाइन स्तर1, 9,10, 11तकलौटाताहै। इसके विपरीत, पुरानी मांसपेशियों की चोट में, एफएपी प्रो-एपोटोटिक संकेतों को ओवरराइड करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप उनके हठ9,10,11 और असामान्य मांसपेशियों की मरम्मत होती है।
वीवो अध्ययनों में सेलुलर और आणविक तंत्रों का मूल्यांकन किया गया है जिसके द्वारा एफएपी ने मांसपेशियों की प्रतिक्रियाओं में मध्यस्थता की है , आज तक 1 ,7,9, 10,11,12,13,14तक मुरीन पशु मॉडलकाउपयोग किया है । जबकि आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों इन विश्लेषणों में उपयोग के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं, जानवर के छोटे आकार लंबी अवधि के स्थानीयकृत चोट मॉडल में अध्ययन के लिए ऊतक उपलब्धता सीमा जहां मांसपेशियों शोष गहरा हो सकता है, जैसे दर्दनाक denervation । इसके अलावा, मांसपेशियों की ताकत और शारीरिक कार्य के माप के लिएपूर्व वीवो या सीटू माप की आवश्यकता होती है जो माउस की समाप्ति की आवश्यकता होती है, या वीवो विधियों में, जिन्हें मांसपेशियों के संकुचन प्रदर्शन15, 16,17, 18,19,20 के मूल्यांकन की अनुमति देने के लिए सर्जरी और/या एक सामान्य संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है । . चूहों में, अच्छी तरह से मान्य और विश्व स्तर पर उपयोग किए जाने वाले मांसपेशी कार्यात्मक विश्लेषण, चाल विश्लेषण (जैसे, सियाटिक फंक्शन इंडेक्स, कैटवॉक विश्लेषण) जैसे अधिक जटिल मोटर व्यवहारों के विश्लेषण के अलावा मौजूद हैं और जागने और अनायास चल रहे जानवरों में किए जाते हैं21,22,23, 24 . यह इसके अतिरिक्त पशु प्रयोग में न्यूनतम रुग्णता के सिद्धांतों और उपयोग किए जाने वाले अनुसंधान जानवरों की संख्या को अनुकूलित करता है। चूहा इस प्रकार FAPs अन्वेषक प्रोटीन और सेलुलर विश्लेषण के लिए अधिक से अधिक घायल मांसपेशियों की मात्रा का जोड़ा लचीलापन और चेतावनी जानवर में मांसपेशियों जटिल स्थिर और गतिशील कार्यात्मक गतिविधि और व्यवहार के धारावाहिक आकलन शुरू करने की क्षमता प्रदान करता है ।
एफएपी को मुख्य रूप से क्रमशः प्रवाह साइटोमेट्री और फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) का उपयोग करके पूरे मांसपेशियों के नमूनों से पहचाना गया है और अलग किया गया है। ये लेजर-आधारित परख हैं जो आकार, दानेदारता, और सेल सतह या इंट्रासेलुलर मार्कर25के विशिष्ट संयोजन जैसे विशिष्ट विशेषताओं के आधार पर कई विशिष्ट कोशिका आबादी की पहचान करने में सक्षम हैं। यह कंकाल की मांसपेशी जैसे अंग प्रणाली के अध्ययन में अत्यधिक लाभप्रद है, क्योंकि होमोस्टेसिस और पुनर्जनन जटिल, बहुकारक प्रक्रियाएं हैं जो कोशिका प्रकारों की अधिकता से समन्वित होती हैं। एक मौलिक अध्ययन ने माउस कंकाल की मांसपेशी1में प्रवाह साइटोमेट्रिक विधियों का उपयोग करके FAPs, साथ ही सांसदों की पहचान की। उन्होंने दिखा दिया कि एफएपी प्रकृति में मेसेंचिमल हैं, क्योंकि उनके पास एंडोथेलियल (सीडी 31), हेमेटोपोइटिक (सीडी 45), या मायोजेनिक (इंतेग्रिन-α7 [ITGA7]) मूल से कोशिकाओं के लिए विशिष्ट सतह एंटीजन का अभाव था, लेकिन उन्होंने मेसेंचिमल स्टेम सेल मार्कर एससीए-1 (स्टेम सेल एंटीजन 1)1 को व्यक्त किया और संस्कृति में फाइब्रोजेनिक और एडीपोजनिक में अंतर किया। अन्य अध्ययनों में एक वैकल्पिक स्टेम सेल मार्कर, प्लेटलेट-व्युत्पन्न विकास कारकरिसेप्टर अल्फा (PDGFRα)2,7,8 और आगे के विश्लेषण की अभिव्यक्ति के आधार पर मांसपेशियों में मेसेंचिमल जनकों के सफल अलगाव का प्रदर्शन किया गया, जिससे पता चला कि ये एफएपी 3 के समान सेलआबादीहोने की संभावना है। एफएपी को अब सामान्य रूप सेप्रवाह साइटोमेट्री में पहचाना जाता है, जिसमें स्का-1 या पीडीजीएफआरवाई को सकारात्मक चयन मार्कर1,9,10, 11,12,13,14,26,27,28,29,30, 31के रूप में कियाजाता है। . पीडीजीएफआरα का उपयोग मानव ऊतक के लिए तरजीही है, हालांकि, मुरीन एससीए-1 के प्रत्यक्ष मानव होमोलॉग के रूप में अभी तक32की पहचान की जानी है। इसके अलावा, अन्य सेल सतह प्रोटीन सांसदों के मार्कर के रूप में सूचित किया गया है (जैसे, VCAM-1), FAPs अलगाव३३के दौरान मायोजेनिक वंश की कोशिकाओं के एक संकेतक के रूप में ITGA7 के लिए एक संभावित विकल्प प्रदान करते हैं ।
जबकि फ्लो साइटोमेट्री/एफएएसएस कंकाल की मांसपेशी1, 9, 10, 11, 13,29में एफएपी की भूमिका और रोगजनक क्षमता का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली कार्यप्रणाली है, यह तकनीकी रूप से अपने आवश्यक अभिकर्मकों की विशिष्टता और अनुकूलन द्वारा सीमित है। चूंकि फौहों की प्रवाह साइटोमेट्रिक पहचान और एफएपी के अलगाव को विकसित किया गया है और माउसपशु मॉडल1,9,10, 11,29में आयोजित किया गया है, यह उन शोधकर्ताओं के लिए चुनौतियां बन गया है जो अन्य मॉडल जीवों में एफएपी का अध्ययन करना चाहते हैं। कई कारक-जैसे इष्टतम ऊतक आकार को संसाधित किया जाना है, साथ ही अभिकर् ता और/या एंटीबॉडी विशिष्टता और उपलब्धता-इस्तेमाल की गई प्रजातियों के आधार पर अलग है ।
एक उपन्यास पशु मॉडल में FAPs का अध्ययन करने के लिए तकनीकी बाधाओं के अलावा, वे काफी हद तक एक तीव्र, विषाक्त सेटिंग में अध्ययन किया गया है-आमतौर पर इंट्रामस्क्युलर रासायनिक इंजेक्शन या कार्डियोटॉक्सिन के माध्यम से । FAPs की दीर्घकालिक गतिशीलता का मूल्यांकन मुख्य रूप से ड्यूचेर्न की मस्कुलर डिस्ट्रॉफी में मूल्यांकन तक सीमित है, एमडीएक्स माउस मॉडल9,10, 11,और संयोजन मांसपेशियों की चोट के मॉडल जैसे बड़े पैमाने पर रोटेटर कफ आंसू जहां समवर्ती टेंडन ट्रांसेक्शन और डिनेर्वेशन कंधे पर किया जाता है26,27,28 . क्रोनिक ट्रॉमेटिक डिनेर्वेशन के एकमात्र अपमान के लिए एफओपी की प्रतिक्रिया, भारी उद्योग, कृषि में काम-स्थान दुर्घटनाओं में एक आम घटना, और जन्म के आघात (ब्रैचियल प्लेक्सस चोट)34,35,36,37 महत्वपूर्ण रुग्णता के साथ, के रूप में अच्छी तरह से विशेषता नहीं है, अक्सर एक अल्पकालिक समय सीमा11,38तक सीमित है।
हम चूहे में संभावित और फाइब्रोटिक कंकाल की मांसपेशी को स्वस्थ होने के साथ-साथ गंभीर रूप से एट्रोफिक और फाइब्रोटिक कंकाल मांसपेशी से एफएपी और सांसदों की पहचान करने और अलग करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। सबसे पहले, CD31-/CD45-/Sca-1 +/VCAM-1-FAPs और CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1 + सांसदों की पहचान एक ऊतक पाचन और प्रवाह साइटोमेट्री धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रदर्शन किया जाता है और हमारे निष्कर्षों के बाद सत्यापन संस्कृति और facs-अलग सेल के लक्षण के माध्यम से किया जाता है । इस विधि का उपयोग करके, हम चूहे में दीर्घकालिक पृथक डिनेर्वेशन इंजरी मॉडल में एक उपन्यास एफएपी टाइम-कोर्स की भी रिपोर्ट करते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

फाइब्रो-एडिपोजेनिक प्रोजेनिटर (एफएपी) कंकाल की मांसपेशी में निवासी मध्यवर्ती कोशिकाएं हैं, जो मायोजेनिक प्रोजेनिटर्स (एमपीएस) के साथ मिलकर मांसपेशियों के होमोस्टेसिस, चोट और मरम्मत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। एफएपी की पहचान और अलगाव उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री/फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई (FACS) के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल और वीवो में आज तक उनके कार्य का मूल्यांकन करने वाले अध्ययन विशेष रूप से चूहों में किए गए हैं । चूहे का बड़ा अंतर्निहित आकार कंकाल मांसपेशियों की चोट मॉडल में FAPs के अधिक व्यापक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, विशेष रूप से गंभीर रूप से एट्रोफिक मांसपेशियों में या जब जांचकर्ताओं को कई डाउनस्ट्रीम परख का संचालन करने के लिए पर्याप्त ऊतक द्रव्यमान की आवश्यकता होती है। चूहा इसके अतिरिक्त मांसपेशियों के कार्यात्मक परख का एक बड़ा चयन प्रदान करता है जिसमें पशु आँख लेने या बलिदान की आवश्यकता नहीं होती है, इस प्रकार सीरियल आकलन को सक्षम करके रुग्णता और पशु उपयोग को कम किया जाता है। चूहों के लिए अनुकूलित प्रवाह साइटोमेट्री/एफएस प्रोटोकॉल विशिष्ट प्रजातियां हैं, विशेष रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी की विशेषताओं द्वारा प्रतिबंधित हैं । उन्हें चूहे या अत्यधिक फाइब्रोटिक मांसपेशियों से FAPs को अलग करने के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है। स्वस्थ और विकृत चूहा कंकाल मांसपेशी दोनों से FAPs और सांसदों की पहचान और अलगाव के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री/FACS प्रोटोकॉल विकसित किया गया था, सतह मार्कर CD31, सीडी 45, एससीए-1, और VCAM-1 की अंतर अभिव्यक्ति पर निर्भर है । चूहे-विशिष्ट के रूप में, प्रवाह साइटोमेट्री-मान्य प्राथमिक एंटीबॉडी गंभीर रूप से सीमित हैं, एससीए-1 को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी के इन-हाउस संविलियन किए गए थे। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, सफल एससीए-1 संयोजिका की पुष्टि की गई थी, और एफएपी और सांसदों की प्रवाह साइटोमेट्रिक पहचान को कोशिका संस्कृति और FACS-पृथक एफएपी और सांसदों के इम्यूनोस्टेटिंग द्वारा मान्य किया गया था। अंत में, हम लंबे समय तक (14 सप्ताह) चूहा डिनेर्वेशन मॉडल में एक उपन्यास एफएपीएस टाइम-कोर्स की रिपोर्ट करते हैं। यह विधि जांचकर्ताओं को एक उपन्यास पशु मॉडल में FAPs का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करती है।

एससीए-1 और वीसीएएम-1 सहित एक उपन्यास एंटीबॉडी पैनल का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से एफएपी और सांसदों की पहचान करना चूहे की मांसपेशी में FAPs की पहचान करने के लिए गेट?...

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Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

यह प्रोटोकॉल रैट कंकाल की मांसपेशियों से फाइब्रो-एडिपोजेनिक प्रोजेनिटर्स (एफएपी) और मायोजेनिक प्रोजेनिटर्स (एमपीएस) को अलग करने की विधि को रेखांकित करता है। मांसपेशियों की चोट मॉडल में चूहे का उपयोग विश्लेषण के लिए एट्रोफिक मांसपेशी से ऊतक की उपलब्धता में वृद्धि प्रदान करता है और मुक्त चलती जानवरों में मांसपेशियों की ताकत और चाल का आकलन करने के लिए मान्य तरीकों का एक बड़ा प्रदर्शनों की सूची प्रदान करता है।

चूहे में कंकाल मांसपेशी में फाइब्रो-एडिपोजेनिक प्रोजेनिटर्स (एफएपी) और मायोजेनिक प्रोजेनिटर्स (सांसदों) की पहचान, अलगाव और लक्षण वर्णन

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

चूंकि एफएपी मांसपेशियों के उत्थान और पैथोलॉजिकल फाइब्रोसिस के मध्यस्थ हैं, इसलिए हमारा प्रोटोकॉल मांसपेशियों की चोट के बाद एफएपी गतिशीलता के लक्षण वर्णन और इन विट्रो या पूर्व वीवो अध्ययनों के लिए एफएपी के अलगाव की अनुमति देता है। आज तक, चूहों से अलग किए गए FAPs पर विशेष रूप से अध्ययन किए गए हैं। हमारा प्रोटोकॉल बड़े चूहे से FAPs के प्रभावी अलगाव को सक्षम बनाता है, जो डाउनस्ट्रीम परख के लिए बहुत अधिक ऊतक उपलब्धता प्रदान करता है।लंबे समय तक ऊतक प्रसंस्करण समय FAPs व्यवहार्यता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है। यदि एक साथ कई नमूनों पर कार्रवाई की जा रही है, तो यह सिफारिश की जाती है कि दो ऑपरेटर अलग-थलग सेल व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए मिलकर प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करें। एक बाँझ 10 सेंटीमीटर सेल संस्कृति पकवान में काटा मांसपेशी ऊतक रखकर शुरू करते हैं।धीरे-धीरे ऊतक को संदंश के साथ फाड़ें और कीमा करें और लगभग तीन से चार मिलीमीटर क्यूब किए गए टुकड़ों को प्राप्त करने के लिए कनेक्टिव ऊतक को हटा दें। डीएमईएम के छह मिलीलीटर और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त एक बाँझ 50-मिलीलीटर शंकु ट्यूब में मंत्री ऊतक स्थानांतरित करें। इसके बाद, 300-मिलीमोलर कैल्शियम क्लोराइड समाधान के 10 माइक्रोलीटर जोड़कर कोलेजनेस II समाधान के 365 माइक्रोलीटर को सक्रिय करें।प्रति मिलीलीटर 250 इकाइयों की अंतिम एकाग्रता के लिए ऊतक घोल में सक्रिय कोलेजन II समाधान जोड़ें। ट्यूब को एक घंटे के लिए एक शेकर में और 240 x ग्राम पर 37 डिग्री सेल्सियस पर मैनुअल आंदोलन के साथ हर 15 मिनट में ऊतक को उखाड़ फेंकने के लिए ट्यूब के किनारे का पालन किया। एक घंटे की इनक्यूबेशन के बाद, कोलेजन II के 100 माइक्रोलीटर और नमूने में 50 माइक्रोलीटर डिस्पैस जोड़ें।फिर, पिपेट नमूने 15 से 20 बार सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ तब तक जाते हैं जब तक कि समाधान समरूप न हो जाए। नमूना को फिर से 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट और मैनुअल आंदोलन के साथ 240 x ग्राम हर 15 मिनट में इनक्यूबेट करें। धीरे-धीरे 10 चक्रों के लिए 20 गेज सुई के साथ 20 मिलीलीटर सिरिंज के माध्यम से मांसपेशियों के समाधान के नमूनों को कतरनी।फिर, एक बाँझ 50-मिलीलीटर शंकु नली पर 40-माइक्रोन सेल छन्नी रखें और इसे 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक डीएमईएम के पांच मिलीलीटर को पाइपिंग करके गीला करें। छन्नी के माध्यम से एक समय में नमूना एक मिलीलीटर पिपेट करें। एक बार जब पूरा नमूना फ़िल्टर हो जाता है, तो 25 मिलीलीटर के लिए नमूने की कुल मात्रा लाने के लिए 10% एफबीएस और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक डीएमईएम के साथ सेल छन्नी को धोएं।नमूना मात्रा को समान रूप से दो 15 मिलीलीटर शंकु नलियों और अपकेंद्रित्र में 15 डिग्री सेल्सियस, 15 मिनट के लिए 400 x ग्राम में विभाजित करें। अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और सात मिनट के लिए कमरे के तापमान पर आरबीसी लाइसिस बफर के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से खर्च करें। फिर, 15 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिलीलीटर और अपकेंद्रित्र, 15 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर मात्रा लाने के लिए वॉश बफर के नौ मिलीलीटर जोड़ें।अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और गोली को वॉश बफर के एक मिलीलीटर में फिर से खर्च करें। कोशिकाओं की एक उपयुक्त मात्रा को एक अलग 1.5-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और इसे ट्राइपैन ब्लू डाई के साथ मिलाएं। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके हल्के माइक्रोस्कोप पर लाइव कोशिकाओं को गिनें।प्रवाह साइटोमेट्री के लिए, एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में प्रति प्रायोगिक नमूने में एक से 2 मिलियन कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। नमूना मात्रा को वॉश बफर के साथ एक मिलीलीटर में लाएं, और ट्यूब को बर्फ पर रखें। प्रयोग के लिए सभी नियंत्रण सेट करें।सेल कंट्रोल के लिए, 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में वॉश बफर के एक मिलीलीटर में 500, 000 से 1 मिलियन कोशिकाएं और इसे बर्फ पर रखें। यदि प्रयोग पहली बार किया जा रहा है, तो एकल-सना हुआ सेल निलंबन भी शामिल किया जाना चाहिए। मनका नियंत्रण स्थापित करने के लिए, प्रत्येक लेबल १.५-मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए लगभग १५०, 000 सकारात्मक मुआवजा मोती जोड़ें ।1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब लेबल को ताज़ा करने के लिए व्यवहार्यता ट्यूब से सेल की मात्रा के आधे हिस्से को स्थानांतरित करके व्यवहार्यता नियंत्रण तैयार करें। मृत ट्यूब को दो से तीन मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, फिर इसे बर्फ पर रखें। इनक्यूबेशन के बाद, मृत कोशिकाओं को व्यवहार्यता ट्यूब पर वापस करें।500 x g पर प्रायोगिक और नियंत्रण नमूनों और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस सहित एकल कोशिका निलंबन, अपकेंद्रित्र, और सुपरनैंट एस्प्रिट के बाद वॉश बफर के 100 माइक्रोलीटर में सेल छर्रों को फिर से खर्च करें। नियंत्रण या प्रयोगात्मक स्थिति के अनुसार एंटीबॉडी जोड़ें, और पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए धीरे से नमूना झटका। फिर, उन्हें 15 मिनट के लिए अंधेरे में बर्फ पर इनक्यूबेट करें।मुआवजे के मोतियों के लिए, 15 मिनट के लिए अंधेरे में कमरे के तापमान पर ट्यूब को इनक्यूबेट करें। एकल सेल निलंबन के लिए वॉश बफर के 900 माइक्रोलीटर जोड़कर प्रत्येक नमूने की मात्रा और क्षतिपूर्ति मनका नियंत्रण के लिए पीबीएस के 900 माइक्रोलीटर जोड़कर एक मिलीलीटर में लाएं। ५०० x g पर सेंट्रलाइज सिंगल-सेल सस्पेंशन और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस, और मुआवजा मनका ३०० एक्स जी पर नियंत्रण और पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस ।नमूनों के अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और वॉश बफर के 300 माइक्रोलीटर में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें, और पीबीएस के 300 माइक्रोलीटर और 150, 000 नकारात्मक क्षतिपूर्ति मोतियों में मनका नियंत्रण करें। एल्यूमीनियम पन्नी के तहत कमरे के तापमान पर बर्फ और मनका नमूनों पर सेल नमूने रखें। फाइब्रो-एडिपोजेनिक प्रोजेनिटर्स और मायोजेनिक प्रोजेनिटर्स की पहचान करने के लिए गेटिंग रणनीति स्थापित करके प्रवाह साइटोमेट्री अधिग्रहण के साथ आगे बढ़ें।प्रतिनिधि विश्लेषण में, स्वस्थ चूहा गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशियों से उत्पन्न क्षतिपूर्ति मोतियों और सेल निलंबन के एकल धुंधला के साथ एससीए-1 एपीसी एंटीबॉडी के सफल संजीदशन की पुष्टि की गई। एससीए-1 एपीसी की पांच अलग-अलग सांद्रता एकल-कोशिका निलंबन पर टिटैप की गई थी, और एंटीबॉडी की इष्टतम एकाग्रता को न्यूनतम पृष्ठभूमि धुंधला के साथ सबसे बड़ी फ्लोरेसेंस तीव्रता के आधार पर पहचाना गया था। यहां दिखाए गए गेटिंग रणनीति का उपयोग करके चूहे गैस्ट्रोकनेमियस में एफएपी और सांसदों की फ्लो साइटोमेट्रिक पहचान का प्रदर्शन किया गया।मोतियों की गिनती में मलबे को बाहर करने के लिए पहले नमूने लिए गए थे । कोशिकाओं को तब सामने स्कैटर और साइड स्कैटर विशेषताओं दोनों द्वारा डबल्स को बाहर करने के लिए गेट किया गया था। परिणामस्वरूप कोशिकाओं की व्यवहार्यता SYTOX ब्लू के साथ धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया था ।SYTOX ब्लू नकारात्मक सिंगल्स का आकलन CD31 और CD45 के लिए लिन + अंशों को बाहर करने के लिए किया गया था । लिन-आबादी का आकलन किया गया । एससीए-1 के लिए एकल सकारात्मक कोशिकाओं को नामित किया गया था, और वीसीएएम-1 के लिए एकल सकारात्मक कोशिकाओं को नामित किया गया था।छंटाई के तुरंत बाद सह-इम्यूनोदाता के साथ, FAPs की हौसले से अलग आबादी Pax7 सकारात्मक कोशिकाओं द्वारा कोई संदूषण के साथ PDGFRalpha के लिए सकारात्मक धुंधला प्रदर्शित किया । इसके विपरीत, सांसदों की छंटाई आबादी PDGFRalpha-सकारात्मक कोशिकाओं की अनुपस्थिति के साथ Pax7 के लिए सकारात्मक दाग । एफएपी ने क्रमशः फाइब्रोब्लास्ट-विशिष्ट प्रोटीन 1 और पेरिलिपिन 1 की अभिव्यक्ति के साथ एडिपोजेनिक विभेदन मीडिया में दिन 12 में विभेदित फाइब्रोब्लास्ट और एडिपोसाइट्स का प्रदर्शन किया।परिपक्व एडिपोसाइट्स से तटस्थ ट्राइग्लिसराइड्स और लिपिड की उपस्थिति तेल लाल ओ धुंधला के साथ स्पष्ट थी। इसके अतिरिक्त, एफएपी ने कोलेजन प्रकार की उपस्थिति और मायोसाइट्स को दूषित करने की अनुपस्थिति का प्रदर्शन किया। 12 दिन में मायोजेनिक विभेदन मीडिया में उगाए गए सांसदों ने परिपक्व मायोसाइट्स और फ्यूज्ड मल्टीन्यूक्लिटेड मायोट्यूब की उपस्थिति प्रदर्शित की, और फाइब्रोब्लास्ट और एडिपोसाइट संदूषण से स्पष्ट थे।दीर्घकालिक संस्कृति के लिए जीवित कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस तकनीक का उपयोग करते समय, शोधकर्ताओं को अच्छी कोशिका व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए कुशलतापूर्वक काम करते हुए एसेप्टिक तकनीक का उपयोग करना सुनिश्चित करना चाहिए।

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

वयस्क और भ्रूण के कंकाल की मांसपेशी Microexplant संस्कृति और कंकाल की मांसपेशी स्टेम सेल के अलगाव

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

कंकाल की मांसपेशी से progenitors के शोधन

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

पहचान और माउस Erythroid progenitors के विश्लेषण CD71/TER119 परख फ्लो - cytometric का उपयोग

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

इंसुलिन व्यक्त कालोनी बनाने progenitors के लिए एक मात्रात्मक परख

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

चूहा के लिए प्रक्रिया<em&gt; स्वस्थानी में</em&gt; कंकाल की मांसपेशी सिकुड़ा गुण

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

प्ररूपी और murine hematopoietic स्टेम सेल और वंश प्रतिबद्ध progenitors के विश्लेषण से अलगाव

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

अलगाव और चूहा यकृत कोशिकाओं की प्राथमिक संस्कृति

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

कैल्शियम का आकलन बरकरार कंकाल की मांसपेशी फाइबर में स्पार्क्स

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

कंकाल की मांसपेशी फाइब्रोब्लास्ट से एक्सोसोम का अलगाव और लक्षण वर्णन

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

माउस मेगाकार्योसाइट प्रोजेनिटर्स का अलगाव

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...