Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Vorremmo ringraziare le strutture principali della citometria a flusso presso l'Università di Ottawa e il Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto per la loro esperienza e guida nell'ottimizzazione del protocollo di citometria a flusso / FACS presentato in questo manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) a JB.

Gli investigatori che conducono questo protocollo devono ricevere il permesso dal loro comitato etico / comitato di cura degli animali locale. Tutto il lavoro sugli animali è stato approvato dal St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC # 918) ed è stato condotto in conformità con le linee guida stabilite dal Canadian Council on Animal Care (CCAC). Uno schema del protocollo di citometria a flusso è mostrato nella Figura 1. Se l'applicazione a valle è FACS e ...

Un protocollo di isolamento DEI FAP ottimizzato e convalidato per il muscolo di ratto è essenziale per i ricercatori che desiderano studiare modelli di lesioni che non sono fattibili nel topo per motivi biologici o tecnici. Ad esempio, i topi non sono un modello animale ottimale in cui studiare lesioni croniche locali o neurodegenerative come la denervazione a lungo termine. Biologicamente, la breve durata della vita e il rapido invecchiamento dei topi rendono difficile delineare con precisione le sequalae muscolari a c...

Le cellule progenitrici fibro-adipogene (FAP) sono una popolazione di cellule progenitrici multipotenti residenti nel muscolo scheletrico che svolgono un ruolo critico nell'omeostasi muscolare, nella riparazione e nella rigenerazione e, al contrario, mediano anche le risposte patologiche alle lesioni muscolari. Come suggerisce il nome, i FAP sono stati originariamente identificati come una popolazione progenitrice con il potenziale di differenziarsi in fibroblasti e adipociti1 e sono stati pretesi per essere i principali mediatori dell'infiltrazione fibro-grassa del muscolo scheletrico in lesioni croniche e malattie. Ulteriori studi hanno rivelato che i FAP sono inoltre in grado di osteogenesi e condrogenesi2,3,4. Pertanto, sono più ampiamente notati in letteratura come progenitori mesenchimali ostromali 3,5,6,7,8. Nel danno acuto del muscolo scheletrico, i FAP aiutano indirettamente nella miogenesi rigenerativa proliferando transitoriamente per fornire un ambiente favorevole per le cellule satelliti muscolari attivate e le loro controparti progenitrici miogeniche (MP) a valle1,9,10. Parallelamente alla rigenerazione di successo, i FAP subiscono l'apoptosi, riportando il loro numero ai livellibasali1,9,10,11. Al contrario, nelle lesioni muscolari croniche, i FAP sovrascrivono i segnali pro-apoptotici, il che si traduce nella loro persistenza9,10,11 e nella riparazione muscolare anormale.
Studi in vivo che valutano i meccanismi cellulari e molecolari con cui i FAP mediano le risposte muscolari hanno utilizzato modelli animali murini fino ad oggi1,7,9,10,11,12,13,14. Mentre i topi geneticamente modificati sono potenti strumenti da utilizzare in queste analisi, le piccole dimensioni dell'animale limitano la disponibilità di tessuti per lo studio in modelli di lesioni localizzate a lungo termine in cui l'atrofia muscolare può essere profonda, come la denervazione traumatica. Inoltre, la misurazione della forza muscolare e della funzione fisica richiede misurazioni ex vivo o in situ che richiedono la cessazione del topo, o metodi in vivo che richiedono un intervento chirurgico e/o un anestetico generale per consentire la valutazione delle prestazioni contrattili muscolari15,16,17,18,19,20 . Nei ratti, esistono analisi funzionali muscolari ben convalidate e utilizzate a livello globale, oltre alle analisi per comportamenti motori più complessi come l'analisi dell'andatura (ad esempio, indice di funzione sciatica, analisi CatWalk) e vengono eseguite in animali svegli e in movimento spontaneo21,22,23,24 . Ciò ottimizza ulteriormente i principi di morbilità minima nella sperimentazione animale e il numero di animali da ricerca utilizzati. Il ratto fornisce quindi al ricercatore FAPs la flessibilità aggiuntiva di un maggiore volume muscolare ferito per analisi proteiche e cellulari e la capacità di intraprendere valutazioni seriali dell'attività e dei comportamenti funzionali statici e dinamici del complesso muscolare, nell'animale di allerta.
I FAP sono stati identificati e isolati principalmente da campioni di muscoli interi utilizzando rispettivamente la citometria a flusso e lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Si tratta di saggi basati su laser che sono in grado di identificare più popolazioni cellulari specifiche in base a caratteristiche caratteristiche come dimensioni, granularità e una combinazione specifica di superficie cellulare o marcatori intracellulari25. Questo è molto vantaggioso nello studio di un sistema di organi come il muscolo scheletrico, poiché l'omeostasi e la rigenerazione sono processi complessi e multifattoriali coordinati da una pletora di tipi di cellule. Uno studio seminale ha identificato i FAP, così come i MP, utilizzando metodi citometrici a flusso nel muscolo scheletrico del topo1. Hanno dimostrato che i FAP sono di natura mesenchimale, in quanto mancavano di antigeni di superficie specifici per le cellule di origine endoteliale (CD31), ematopoietica (CD45) o miogenica (Integrina-α7 [ITGA7]), ma esprimevano il marcatore delle cellule staminali mesenchimali Sca-1 (antigene delle cellule staminali 1)1 e differenziato in cellule fibrogene e adipogeniche in coltura. Altri studi hanno dimostrato il successo dell'isolamento dei progenitori mesenchimali nel muscolo in base all'espressione di un marcatore alternativo di cellule staminali, il recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα)2,7,8 e ulteriori analisi hanno rivelato che questi probabilmente sono la stessa popolazione cellulare dei FAPs3. I FAP sono ora comunemente identificati nella citometria a flusso utilizzando Sca-1 o PDGFRα come marcatore di selezionepositiva 1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . L'uso di PDGFRα è preferenziale per il tessuto umano tuttavia, in quanto un omologo umano diretto di Sca-1 murino deve ancora essere identificato32. Inoltre, altre proteine di superficie cellulare sono state segnalate come marcatori di MP (ad esempio, VCAM-1), fornendo una potenziale alternativa a ITGA7 come indicatore di cellule di lignaggio miogenico durante l'isolamento dei FAPs33.
Mentre la citometria a flusso / FACS è una potente metodologia per studiare il ruolo e il potenziale patogenetico dei FAP nel muscolo scheletrico1,9,10,11,13,29, è limitato tecnicamente dalla specificità e dall'ottimizzazione dei suoi reagenti richiesti. Poiché l'identificazione citometrica a flusso e l'isolamento dei FAP sono stati sviluppati e condotti in modelli animalimurini1,9,10, 11,29, ciòpone sfide per i ricercatori che desiderano studiare i FAP in altri organismi modello. Molti fattori - come la dimensione ottimale del tessuto da elaborare, nonché la specificità e la disponibilità di reagenti e/o anticorpi - differiscono a seconda della specie utilizzata.
Oltre alle barriere tecniche allo studio dei FAP in un nuovo modello animale, sono state in gran parte studiate in un ambiente acuto e tossico, di solito tramite iniezione chimica intramuscolare o cardiotossina. La valutazione delle dinamiche a lungo termine dei FAP è limitata principalmente alla valutazione nella distrofia muscolare di Duchenne, utilizzando il modello murino mdx9,10,11e modelli di lesioni muscolari combinate come la rottura massiccia della cuffia dei rotatori in cui la traslazione e la denervazione del tendine concomitanti vengono eseguite sulla muscolatura della spalla26,27,28 . La risposta dei FAP al solo insulto della denervazione traumatica cronica, un evento comune negli incidenti sul posto di lavoro nell'industria pesante, nell'agricoltura e nei traumi alla nascita (lesione del plesso brachiale)34,35,36,37 con morbilità significativa, non è stata altrettanto ben caratterizzata, spesso limitata a un breve periodo di tempo11,38.
Descriviamo un metodo per identificare e isolare FAP e MP dal muscolo scheletrico sano e gravemente atrofico e fibrotico nel ratto. In primo luogo, viene dimostrata l'identificazione di MP CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- e CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizzando un protocollo di colorazione della digestione dei tessuti e della citometria a flusso e la successiva convalida dei nostri risultati viene eseguita attraverso la coltura e la colorazione immunocitochimica di cellule isolate da FACS. Usando questo metodo, riportiamo anche un nuovo decorso temporale dei FAP in un modello di lesione da denervazione isolata a lungo termine nel ratto.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

I progenitori fibro-adipogeni (FAPs) sono cellule interstiziali residenti nel muscolo scheletrico che, insieme ai progenitori miogeni (MP), svolgono un ruolo chiave nell'omeostasi muscolare, nelle lesioni e nella riparazione. Gli attuali protocolli per l'identificazione e l'isolamento dei FAP utilizzano la citometria a flusso/ lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) e gli studi che valutano la loro funzione in vivo fino ad oggi sono stati intrapresi esclusivamente nei topi. La maggiore dimensione intrinseca del ratto consente un'analisi più completa dei FAP nei modelli di lesione del muscolo scheletrico, specialmente nel muscolo gravemente atrofico o quando gli investigatori richiedono una massa tissutale sostanziale per condurre più saggi a valle. Il ratto fornisce inoltre una selezione più ampia di saggi funzionali muscolari che non richiedono sedazione o sacrificio animale, riducendo così al minimo la morbilità e l'uso di animali consentendo valutazioni seriali. I protocolli di citometria a flusso/FACS ottimizzati per i topi sono specifici per specie, in particolare limitati dalle caratteristiche degli anticorpi disponibili in commercio. Non sono stati ottimizzati per separare i FAP dal ratto o dal muscolo altamente fibrotico. È stato sviluppato un protocollo di citometria a flusso/FACS per l'identificazione e l'isolamento di FAP e MP dal muscolo scheletrico di ratto sano e denervato, basandosi sull'espressione differenziale dei marcatori di superficie CD31, CD45, Sca-1 e VCAM-1. Poiché gli anticorpi primari specifici per il ratto, convalidati con citometria a flusso, sono gravemente limitati, è stata eseguita la coniugazione interna dell'anticorpo che prende di mira Sca-1. Utilizzando questo protocollo, è stata confermata la coniugazione Sca-1 di successo e l'identificazione citometrica a flusso di FAP e MP è stata convalidata mediante coltura cellulare e immunocolorazione di FAPs e MP isolati da FACS. Infine, riportiamo un nuovo decorso temporale dei FAP in un modello di denervazione prolungata (14 settimane). Questo metodo fornisce ai ricercatori la possibilità di studiare i FAP in un nuovo modello animale.

Identificazione di FAP e MP tramite citometria a flusso utilizzando un nuovo pannello anticorpale tra cui Sca-1 e VCAM-1 La strategia di gating per l'identificazione dei FAP nel muscolo di ratto si basa sui protocolli di citometria a flusso nel topo29, che gate su cellule cd31 (endoteliali) e CD45 (ematopoietiche) positive (chiamato lignaggio [Lin]) ed esamina il profilo fluorescente del marcatore FAPs Sca-1 e del marcatore MP...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Questo protocollo delinea un metodo per isolare i progenitori fibro-adipogeni (FAP) e i progenitori miogeni (MP) dal muscolo scheletrico del ratto. L'utilizzo del ratto nei modelli di lesione muscolare fornisce una maggiore disponibilità di tessuto dal muscolo atrofico per l'analisi e un repertorio più ampio di metodi convalidati per valutare la forza muscolare e l'andatura negli animali in movimento libero.

Identificazione, isolamento e caratterizzazione di progenitori fibro-adipogeni (FAPs) e progenitori miogeni (MP) nel muscolo scheletrico nel ratto

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Poiché i FAP sono mediatori della rigenerazione muscolare e della fibrosi patologica, il nostro protocollo consente la caratterizzazione della dinamica FAP post lesione muscolare e l'isolamento dei FAP per studi in vitro o ex vivo. Ad oggi, gli studi sono stati condotti esclusivamente su FAP isolati da topi. Il nostro protocollo consente un efficace isolamento dei FAP dal ratto più grande, fornendo una maggiore disponibilità di tessuto per i test a valle.Il tempo prolungato di elaborazione dei tessuti può avere un impatto negativo sulla vitalità dei FAP. Se più campioni vengono elaborati contemporaneamente, si consiglia a due operatori di eseguire il protocollo in tandem per massimizzare la vitalità delle cellule isolate. Inizia posizionando il tessuto muscolare raccolto in un piatto sterile di coltura cellulare di 10 centimetri.Strappare e tritare delicatamente il tessuto con una pinza e rimuovere il tessuto connettivo per ottenere circa tre o quattro millimetri di pezzi cubetti. Trasferire il tessuto minster in un tubo conico sterile da 50 millilitri contenente sei millilitri di DMEM e l'1% di penicillina-streptomicina. Quindi, attivare 365 microlitri di soluzione di collagenasi II aggiungendo 10 microlitri di soluzione di cloruro di calcio da 300 millimolari.Aggiungere la soluzione di collagenasi II attivata al liquame tissutale per una concentrazione finale di 250 unità per millilitro. Incubare i tubi in uno shaker per un'ora e a 37 gradi Celsius a 240 x g con agitazione manuale ogni 15 minuti per rimuovere il tessuto aderente al lato del tubo. Dopo un'ora di incubazione, aggiungere 100 microlitri di collagenasi II e 50 microlitri di dispasi al campione.Quindi, la pipetta campiona da 15 a 20 volte con una pipetta sierologica fino a quando la soluzione non è omogenea. Incubare nuovamente il campione per 30 minuti a 37 gradi Celsius e 240 x g con agitazione manuale ogni 15 minuti. Tagliare lentamente i campioni di soluzione muscolare attraverso una siringa da 20 millilitri con un ago calibro 20 per 10 cicli.Quindi, posizionare un colino cellulare da 40 micron su un tubo conico sterile da 50 millilitri e bagnarlo pipettando cinque millilitri di DMEM integrati con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina. Pipettare il campione un millilitro alla volta attraverso il colino. Una volta filtrato l'intero campione, lavare il filtro cellulare con DMEM integrato con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina per portare il volume totale del campione a 25 millilitri.Dividere equamente il volume del campione in due tubi conici da 15 millilitri e centrifugare a 15 gradi Celsius, 400 x g per 15 minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospesare il pellet in un millilitro di tampone di lisi RBC a temperatura ambiente per sette minuti. Quindi, aggiungere nove millilitri di tampone di lavaggio per portare il volume a 10 millilitri e centrifugare a 15 gradi Celsius, 400 x g per 15 minuti.Dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e risospesare il pellet in un millilitro di tampone di lavaggio. Trasferire un volume appropriato di cellule in un tubo microcentrifuga separato da 1,5 millilitri e mescolarlo con colorante blu tripano. Conta le cellule vive su un microscopio ottico usando un emocitometro.Per la citometria a flusso, trasferire da uno a 2 milioni di cellule per campione sperimentale in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 millilitri. Portare il volume del campione a un millilitro con tampone di lavaggio e posizionare il tubo sul ghiaccio. Impostare tutti i controlli per l'esperimento.Per i controlli cellulari, aliquote da 500.000 a 1 milione di celle in un millilitro di tampone di lavaggio in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri e metterlo sul ghiaccio. Se l'esperimento viene eseguito per la prima volta, dovrebbero essere incluse anche sospensioni cellulari a colorazione singola. Per impostare i controlli delle perline, aggiungere circa 150.000 perline di compensazione positiva a ciascun tubo centrifugo da 1,5 millilitri etichettato.Preparare il controllo di vitalità trasferendo metà del volume della cella dal tubo di vitalità al tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri etichettato morto. Incubare il tubo morto a 65 gradi Celsius per due o tre minuti, quindi posizionarlo sul ghiaccio. Dopo l'incubazione, restituire le cellule morte al tubo di vitalità.Centrifugare le sospensioni monocellulari, compresi i campioni sperimentali e di controllo a 500 x g e quattro gradi Celsius per cinque minuti, e risospendere i pellet cellulari in 100 microlitri di tampone di lavaggio dopo aver aspirato il surnatante. Aggiungere anticorpi in base alle condizioni di controllo o sperimentali e scorrere delicatamente il campione per garantire una miscelazione completa. Quindi, incubarli sul ghiaccio al buio per 15 minuti.Per le perle di compensazione, incubare il tubo a temperatura ambiente al buio per 15 minuti. Porta il volume di ciascun campione a un millilitro aggiungendo 900 microlitri di tampone di lavaggio alla sospensione a cella singola e 900 microlitri di PBS per i controlli delle perline di compensazione. Centrifugare sospensioni monocellulari a 500 x g e quattro gradi Celsius per cinque minuti e controlli di perline di compensazione a 300 x g e quattro gradi Celsius per cinque minuti.Dopo la centrifugazione dei campioni, aspirare il surnatante e risospese il pellet cellulare in 300 microlitri di tampone di lavaggio e i controlli del tallone in 300 microlitri di PBS e 150.000 perle di compensazione negativa. Conservare i campioni di cellule su ghiaccio e campioni di perline a temperatura ambiente sotto un foglio di alluminio. Procedere con l'acquisizione della citometria a flusso impostando la strategia di gating per identificare progenitori fibro-adipogeni e progenitori miogeni.Nell'analisi rappresentativa, è stata confermata la coniugazione riuscita dell'anticorpo Sca-1 APC con singola colorazione di perline di compensazione e sospensioni cellulari generate da muscolo gastrocnemio di ratto sano. Cinque diverse concentrazioni di Sca-1 APC sono state titolate su sospensioni monocellulari e la concentrazione ottimale di anticorpi è stata identificata in base alla massima intensità di fluorescenza con colorazione di fondo minima. Le identificazioni citometriche a flusso di FAP e MP nel gastrocnemio di ratto sono state eseguite utilizzando la strategia di gating mostrata qui.I campioni sono stati prima recintati per escludere i detriti nel conteggio delle perle. Le celle sono state quindi chiuse per escludere i doppietti sia dalle caratteristiche di scatter anteriore che da quelle di scatter laterale. La vitalità delle cellule risultanti è stata valutata mediante colorazione con SYTOX Blue.Le singolette SYTOX Blue negative sono state valutate per CD31 e CD45 per escludere le frazioni di Lin+. La popolazione lin è stata valutata. Le cellule che erano single positive per Sca-1 sono state designate FAPs e le cellule che erano single positive per VCAM-1 sono state designate MP.Con la co-immunocolorazione immediatamente dopo la cernita, la popolazione appena isolata di FAPs ha mostrato una colorazione positiva per PDGFRalpha senza contaminazione da parte di cellule Pax7 positive. Al contrario, la popolazione ordinata di parlamentari è risultata positiva per Pax7 con un'assenza di cellule PDGFRalpha-positive. I FAP hanno dimostrato fibroblasti e adipociti differenziati al giorno 12 in mezzi di differenziazione adipogenica con espressione rispettivamente della proteina 1 e della perilipina 1 specifiche dei fibroblasti.La presenza di trigliceridi neutri e lipidi da adipociti maturi era evidente con la colorazione Oil Red O. Inoltre, i FAP hanno dimostrato una presenza di collagene di tipo I e un'assenza di miociti contaminanti. I parlamentari cresciuti in mezzi di differenziazione miogenica il giorno 12 mostravano la presenza di miociti maturi e miotubi multinucleati fusi ed erano privi di fibroblasti e contaminazione degli adipociti.Quando si utilizza questa tecnica per isolare cellule vive per la coltura a lungo termine, i ricercatori devono assicurarsi di utilizzare la tecnica asettica mentre contemporaneamente lavorano in modo efficiente per garantire una buona vitalità cellulare.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulte e embrionali muscolo scheletrico Microexplant Cultura e isolamento di cellule staminali del muscolo scheletrico

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Ricerca

Biologia

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Identificazione e analisi dei mouse progenitori eritroidi utilizzando il CD71/TER119 Flow-citometria Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Un dosaggio quantitativo di insulina che esprimono formante colonia Progenitori

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedure di Rat<em&gt; In situ</em&gt; Proprietà muscolatura scheletrica contrattili

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

L&#39;analisi fenotipica e l&#39;isolamento di murini cellule staminali ematopoietiche e Lineage-committed progenitori

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolamento e la coltura primaria di cellule epatiche di ratto

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolamento e caratterizzazione di esosomi da fibroblasti muscolari scheletrici

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Isolamento dei progenitori dei megacariociti di topo

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...