Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Vi vil takke Flow cytometry Core Facilities ved University of Ottawa og Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto for deres ekspertise og veiledning i optimalisering av flow cytometri / FACS-protokollen presentert i dette manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) til JB.

Etterforskere som gjennomfører denne protokollen må få tillatelse fra sitt lokale dyreetiske styre/omsorgsutvalg. Alt dyrearbeid ble godkjent av St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC #918) og ble utført i samsvar med retningslinjene fastsatt av Canadian Council on Animal Care (CCAC). Et skjema for flytcytometriprotokollen vises i figur 1. Hvis nedstrømsapplikasjonen er FACS og påfølgende cellekultur, bør alle trinnene fullføres med riktig aseptisk te...

En optimalisert, validert FAPs isolasjonsprotokoll for rottemuskel er avgjørende for forskere som ønsker å studere skademodeller som ikke er gjennomførbare i musen av biologiske eller tekniske årsaker. For eksempel er mus ikke en optimal dyremodell for å studere kroniske lokale eller nevrodegenerative skader som langvarig denervasjon. Biologisk sett gjør den korte levetiden og rask aldring av mus det vanskelig å nøyaktig avgrense muskelsequalaen på grunn av denervasjon fra den forvirrende faktoren for aldring. ...

Fibro-adipogene stamceller (FAPs) er en populasjon av bosatte multipotente stamceller i skjelettmuskulatur som spiller en kritisk rolle i muskel homeostase, reparasjon og regenerering, og omvendt, også megle patologiske responser på muskelskade. Som navnet antyder, ble FAPs opprinnelig identifisert som en forfedrepopulasjon med potensial til å skille seg ut i fibroblaster og adipocytter1 og ble påstått å være de viktigste mediatorene for fibro-fettinfiltrasjon av skjelettmuskulatur i kronisk skade og sykdom. Videre studie viste at FAPs er i tillegg i stand til osteogenese og kondrogenese2,3,4. Dermed er de mer bredt merket i litteraturen som mesenchymale eller stromale forfedre3,5,6,7,8. Ved akutt skjelettmuskulaturskade hjelper FAPs indirekte til regenerativ myogenese ved forbigående spredning for å gi et gunstig miljø for aktiverte muskelsatellittceller og deres nedstrøms myogene forfedre (MPs) kolleger1,9,10. Parallelt med vellykket regenerering gjennomgår FAPer apoptose, og returnerer tallene sine til baseline nivåer1,9,10,11. I motsetning, i kronisk muskelskade, overstyrer FAPs pro-apoptotiske signaler, noe som resulterer i deres utholdenhet9,10,11 og unormal muskelreparasjon.
In vivo-studier som evaluerer de cellulære og molekylære mekanismene som FAPs formidler muskelresponser har brukt murine dyremodeller til dags dato1,7,9,10,11,12,13,14. Mens genmodifiserte mus er kraftige verktøy for bruk i disse analysene, begrenser den lille størrelsen på dyret vevstilgjengeligheten for studier i langsiktige lokaliserte skademodeller der muskelatrofi kan være dyp, for eksempel traumatisk denervasjon. Videre krever måling av muskelstyrke og fysisk funksjon ex vivo- eller in situ-målinger som nødvendiggjør avslutning av musen, eller in vivo-metoder som krever kirurgi og / eller en generell bedøvelse for å tillate evaluering av muskelkontraktil ytelse15,16,17,18,19,20 . Hos rotter eksisterer godt validerte og globalt utnyttede muskelfunksjonsanalyser, i tillegg til analyser for mer kompleks motorisk atferd som ganganalyse (f.eks. isjiasfunksjonsindeks, CatWalk-analyse) og utføres hos våkne og spontant bevegelige dyr21,22,23,24 . Dette optimaliserer i tillegg prinsippene for minimal sykelighet i dyreforsøk, og antall forskningsdyr som brukes. Rotten gir dermed FAPs etterforsker den ekstra fleksibiliteten til større skadet muskelvolum for protein- og cellulære analyser og evnen til å foreta serielle vurderinger av muskelkompleks statisk og dynamisk funksjonell aktivitet og atferd, i varslingsdyret.
FAPs har primært blitt identifisert og isolert fra hele muskelprøver ved hjelp av henholdsvis flow cytometri og fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Dette er laserbaserte analyser som kan identifisere flere spesifikke cellepopulasjoner basert på karakteristiske trekk som størrelse, granularitet og en bestemt kombinasjon av celleoverflate eller intracellulære markører25. Dette er svært fordelaktig i studiet av et organsystem som skjelettmuskulatur, da homeostase og regenerering er komplekse, multifaktorielle prosesser koordinert av en mengde celletyper. En seminalstudie identifiserte FAPer, så vel som MPs, ved hjelp av strømningscytometriske metoder i mus skjelettmuskulatur1. De viste at FAPs er mesenchymale i naturen, da de manglet overflateantigener som var spesifikke for celler fra endotel (CD31), hematopoietisk (CD45) eller myogen (Integrin-α7 [ITGA7]) opprinnelse, men uttrykte den mesenchymale stamcellemarkøren Sca-1 (Stamcelleantigen 1)1 og differensiert i fibrogene og adipogene celler i kulturen. Andre studier viste vellykket isolasjon av mesenchymale forfedre i muskel basert på uttrykket av en alternativ stamcellemarkør, blodplate-avledet vekstfaktorreseptor alfa (PDGFRα)2,7,8 og videre analyse viste at disse sannsynligvis vil være samme cellepopulasjon som FAPs3. FAPer identifiseres nå ofte i flytcytometri ved hjelp av enten Sca-1 eller PDGFRα som et positivt utvalgsmerke1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Bruken av PDGFRα er imidlertid fortrinnsrett for humant vev, da en direkte menneskelig homolog av murin Sca-1 ennå ikke er identifisert32. I tillegg er andre celleoverflateproteiner rapportert som markører av MPs (f.eks. VCAM-1), noe som gir et potensielt alternativ til ITGA7 som en indikator på celler med myogen avledning under FAPs isolasjon33.
Mens flow cytometri / FACS er en kraftig metodikk for å studere faps rolle og patogene potensial i skjelettmuskulatur1,9,10,11,13,29, er det begrenset teknisk av spesifisiteten og optimaliseringen av de nødvendige reagensene. Siden strømningscytometrisk identifisering og isolering av FAPs er utviklet og utført i musedyrmodeller1,9,10,11,29, gir dette utfordringer for forskere som ønsker å studere FAPs i andre modellorganismer. Mange faktorer - som optimal vevsstørrelse som skal behandles, samt reagens og / eller antistoff spesifisitet og tilgjengelighet - varierer avhengig av arten som brukes.
I tillegg til de tekniske barrierene for å studere FAPs i en ny dyremodell, har de i stor grad blitt studert i en akutt, giftig setting - vanligvis via intramuskulær kjemisk injeksjon eller kardiotoksin. Evaluering av FAPs langsiktige dynamikk er hovedsakelig begrenset til vurdering i Duchennes muskeldystrofi, ved hjelp av mdx-musemodellen9,10,11og modeller av kombinasjonsmuskelskade som massiv rotatormansjettrivning der samtidig senetranseksjon og denervasjon utføres på skuldermuskulaturen26,27,28 . Faps respons på den eneste fornærmelsen av kronisk traumatisk denervasjon, en vanlig forekomst i arbeidsstedsulykker i tungindustri, landbruk og i fødselstraumer (brachial plexusskade)34,35,36,37 med betydelig sykelighet, har ikke vært så godt karakterisert, ofte begrenset til en kortsiktig tidsramme11,38.
Vi beskriver en metode for å identifisere og isolere FAPs og MPs fra sunn samt alvorlig atrofisk og fibrotisk skjelettmuskulatur i rotten. Først blir identifisering av CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs og CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MPs ved hjelp av en vevsfordøye- og strømningscytometrifargingsprotokoll demonstrert, og etterfølgende validering av funnene våre utføres gjennom kultur og immunocytokjemisk farging av FACS-isolerte celler. Ved hjelp av denne metoden rapporterer vi også et nytt FAPs-tidskurs i en langsiktig isolert denervasjonsskademodell i rotten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) er bosatt interstitiale celler i skjelettmuskulatur som sammen med myogene forfedre (MPs) spiller en nøkkelrolle i muskel homeostase, skade og reparasjon. Gjeldende protokoller for FAPs identifikasjon og isolasjon bruker strømningscytometri/fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og studier som evaluerer deres funksjon in vivo til dags dato har blitt utført utelukkende hos mus. Den større iboende størrelsen på rotten gir mulighet for en mer omfattende analyse av FAPs i skjelettmuskulaturskademodeller, spesielt i alvorlig atrofisk muskel eller når etterforskere krever betydelig vevsmasse for å gjennomføre flere nedstrømsanalyser. Rotten gir i tillegg et større utvalg av muskelfunksjonelle analyser som ikke krever dyresedasjon eller offer, og dermed minimerer sykelighet og dyrebruk ved å muliggjøre serievurderinger. Strømningscytometri/FACS-protokollene som er optimalisert for mus er artsspesifikke, spesielt begrenset av egenskapene til kommersielt tilgjengelige antistoffer. De har ikke blitt optimalisert for å skille FAPs fra rotte eller svært fibrotisk muskel. En strømningscytometri/FACS-protokoll for identifisering og isolering av FAPer og MPs fra både sunn og denervated rotte skjelettmuskulatur ble utviklet, avhengig av differensialuttrykket til overflatemarkører CD31, CD45, Sca-1 og VCAM-1. Ettersom rottespesifikke, strømningscytometri-validerte primære antistoffer er sterkt begrenset, ble intern konjugering av antistoffet rettet mot Sca-1 utført. Ved hjelp av denne protokollen ble vellykket Sca-1-konjugering bekreftet, og strømningscytometrisk identifikasjon av FAPer og MPs ble validert av cellekultur og immunisering av FACS-isolerte FAPer og MPs. Til slutt rapporterer vi et nytt FAPs-tidskurs i en langvarig (14 uker) rottefornektermodell. Denne metoden gir etterforskerne muligheten til å studere FAPs i en ny dyremodell.

Identifisere FAPer og MPs via flowcytometri ved hjelp av et nytt antistoffpanel, inkludert Sca-1 og VCAM-1 Gating strategien for å identifisere FAPs i rottemuskelen er basert på strømning cytometri protokoller i musen29, hvilken port på CD31 (endotelial) og CD45 (hematopoietiske) positive celler (kalt avstamning [Lin]) og undersøker fluorescerende profilen til FAPs markør Sca-1 og MPs markør ITGA7 fra linage-negativ (Li...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Denne protokollen skisserer en metode for å isolere Fibro-adipogene forfedre (FAPer) og myogene forfedre (MPs) fra rotte skjelettmuskulatur. Utnyttelse av rotten i muskelskademodeller gir økt vevstilgjengelighet fra atrofisk muskel for analysen og et større repertoar av validerte metoder for å vurdere muskelstyrke og gang i fritt bevegelige dyr.

Identifisering, isolasjon og karakterisering av Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) og Myogenic Progenitors (MPs) i skjelettmuskulaturen i rotten

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Siden FAPer er formidlere av muskelregenerering og patologisk fibrose, tillater vår protokoll karakterisering av FAP-dynamikk etter muskelskade og isolering av FAPs for in vitro- eller ex vivo-studier. Til dags dato har studier blitt utført utelukkende på FAPs isolert fra mus. Vår protokoll muliggjør effektiv isolering av FAPer fra den større rotten, noe som gir mye større vevstilgjengelighet for nedstrømsanalyser.Langvarig vevsbehandlingstid kan påvirke FAPs levedyktighet negativt. Hvis flere prøver behandles samtidig, anbefales det at to operatorer utfører protokollen sammen for å maksimere synligheten til isolerte celler. Begynn med å plassere høstet muskelvev i en steril 10-centimeter cellekulturrett.Riv forsiktig og hakk vevet med tang og fjern bindevev for å oppnå omtrent tre til fire millimeter kubede stykker. Overfør minstervevet til et sterilt konisk rør på 50 milliliter som inneholder seks milliliter DMEM og 1% penicillin-streptomycin. Deretter aktiverer du 365 mikroliter kollagen ii-oppløsning ved å tilsette 10 mikroliter 300 millimolar kalsiumkloridoppløsning.Tilsett den aktiverte kollagen ii-oppløsningen i vevsslammet for en endelig konsentrasjon på 250 enheter per milliliter. Inkuber rørene i en shaker i en time og ved 37 grader Celsius ved 240 x g med manuell agitasjon hvert 15. Etter en time inkubasjon, tilsett 100 mikroliter kollagenalisse II og 50 mikroliter dispase til prøven.Deretter prøver pipette 15 til 20 ganger med en serologisk pipette til løsningen er homogen. Inkuber prøven igjen i 30 minutter ved 37 grader Celsius og 240 x g med manuell agitasjon hvert 15. Skjær sakte muskeloppløsningsprøvene gjennom en 20 milliliter sprøyte med en 20-gauge nål i 10 sykluser.Legg deretter en 40-mikron cellesil på et sterilt 50 milliliter konisk rør og fukt det ved å pipettere fem milliliter DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin. Pipette prøven en milliliter om gangen gjennom silen. Når hele prøven er filtrert, vask cellesilen med DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin for å bringe det totale volumet av prøve til 25 milliliter.Del prøvevolumet likt i to koniske rør på 15 milliliter og sentrifuger ved 15 grader Celsius, 400 x g i 15 minutter. Etter sentrifugering aspirerer du supernatanten og resuspenderer pellet i en milliliter RBC lysisbuffer ved romtemperatur i syv minutter. Tilsett deretter ni milliliter vaskebuffer for å bringe volumet til 10 milliliter og sentrifuger ved 15 grader Celsius, 400 x g i 15 minutter.Etter sentrifugering aspirerer du supernatanten og resuspenderer pellet i en milliliter vaskebuffer. Overfør et passende volum celler til et separat mikrosenterrør på 1,5 milliliter og bland det med trypanblå fargestoff. Tell levende celler på et lysmikroskop ved hjelp av et hemocytometer.For strømningscytometri, overfør en til 2 millioner celler per eksperimentell prøve til et sterilt mikrosenterrør på 1,5 milliliter. Ta prøvevolumet til en milliliter med vaskebuffer, og legg røret på is. Definer alle kontroller for eksperimentet.For cellekontroller, aliquot 500, 000 til 1 million celler i en milliliter vaskebuffer i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør og legg det på is. Hvis eksperimentet utføres for første gang, bør også enfargede cellesuspensjoner inkluderes. For å sette opp perlekontroller, legg til rundt 150 000 positive kompensasjonsperler til hver merket 1,5 milliliter sentrifugerør.Forbered levedyktighetskontrollen ved å overføre halvparten av cellevolumet fra levedyktighetsrøret for å oppdatere 1,5 milliliter mikrosentermikrosenter merket dødt. Inkuber det døde røret ved 65 grader Celsius i to til tre minutter, og legg det deretter på is. Etter inkubasjonen, returner de døde cellene til levedyktighetsrøret.Sentrifuger encellede suspensjoner, inkludert eksperimentelle og kontrollprøver ved 500 x g og fire grader Celsius i fem minutter, og resuspender cellepellets i 100 mikroliter vaskebuffer etter å ha aspirert supernatanten. Tilsett antistoffer i henhold til kontroll eller eksperimentell tilstand, og flikk forsiktig prøven for å sikre fullstendig blanding. Deretter inkuberer du dem på is i mørket i 15 minutter.For kompensasjonsperler, inkuber røret ved romtemperatur i mørket i 15 minutter. Ta volumet av hver prøve til en milliliter ved å legge til 900 mikroliter vaskebuffer til encellet suspensjon, og 900 mikroliter PBS for kompensasjonsperlekontroller. Sentrifuger encellede suspensjoner ved 500 x g og fire grader Celsius i fem minutter, og kompensasjonsperlekontroller ved 300 x g og fire grader Celsius i fem minutter.Etter sentrifugering av prøvene aspirerer du supernatanten og resuspenderer cellepelleten i 300 mikroliter vaskebuffer, og perlekontroller i 300 mikroliter PBS og 150 000 negative kompensasjonsperler. Hold celleprøvene på is- og perleprøver ved romtemperatur under aluminiumsfolie. Fortsett med strømningscytometrioppkjøp ved å sette opp gating-strategien for å identifisere fibro-adipogene forfedre og myogene forfedre.I den representative analysen ble vellykket konjugering av Sca-1 APC-antistoffet med enkel farging av kompensasjonsperler og cellesuspensjoner generert fra sunn rotte gastrocnemius muskel bekreftet. Fem forskjellige konsentrasjoner av Sca-1 APC ble titrert på encellede suspensjoner, og den optimale konsentrasjonen av antistoff ble identifisert basert på størst fluorescensintensitet med minimal bakgrunnsfarging. Flow cytometriske identifikasjoner av FAPs og MPs i rotte gastrocnemius ble utført ved hjelp av gating strategien vist her.Prøver ble først inngjerdet for å utelukke rusk i telling av perler. Celler ble deretter inngjerdet for å utelukke dobler av både frontspredning og sidespredningsegenskaper. Levedyktigheten til resulterende celler ble vurdert ved farging med SYTOX Blue.SYTOX Blå negative singlets ble vurdert for CD31 og CD45 for å utelukke Lin + brøker. Lin-befolkningen ble vurdert. Celler som var enkeltpositive for Sca-1 ble utpekt som FAPer, og celler som var enkle positive for VCAM-1 ble utpekt som MPs.Med samtidig immunisering umiddelbart etter sortering viste den nyisolerte populasjonen av FAPer positiv farging for PDGFRalpha uten forurensning av Pax7 positive celler. Omvendt farget den sorterte populasjonen av MPs positivt for Pax7 med fravær av PDGFRalpha-positive celler. FAPs demonstrerte differensierte fibroblaster og adipocytter på dag 12 i adipogene differensieringsmedier med uttrykk for henholdsvis fibroblastspesifikk protein 1 og perilipin 1.Tilstedeværelsen av nøytrale triglyserider og lipider fra modne adipocytter var tydelig med Oljerød O-farging. I tillegg viste FAPene tilstedeværelse av kollagen type I og fravær av forurensende myocytter. MPs vokst i myogene differensieringsmedier på dag 12 viste tilstedeværelsen av modne myocytter og smeltet sammen multinukleerte myotuber, og var fri for fibroblaster og adipocyttforurensning.Ved bruk av denne teknikken for å isolere levende celler for langsiktig kultur, må forskeren sørge for å bruke aseptisk teknikk samtidig som de jobber effektivt for å sikre god celle levedyktighet.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

En kvantitativ analyse for Insulin-uttrykke Colony-forming stamfedre

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypeanalyser og Isolering av murine hematopoetiske stamceller og Lineage-engasjerte stamfedre

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering og Primær kultur Rat Nedsatt Cells

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Vurdering av kalsium Sparks i Intakt skjelettmuskelfibre

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering og karakterisering av eksosomer fra skjelettmuskulaturfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Isolering av mus Megakaryocyte Forfedre

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...