Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer às Instalações do Núcleo de Citometria de Fluxo da Universidade de Ottawa e do Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto por sua expertise e orientação na otimização do protocolo de citometria de fluxo/FACS apresentado neste manuscrito. Este trabalho foi financiado pela Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) para jb.

Os investigadores que conduzem este protocolo devem receber permissão de seu conselho local de ética animal/comitê de cuidados. Todo o trabalho animal foi aprovado pelo St. Michael's Hospital Unity Toronto Animal Care Committee (ACC #918) e foi conduzido de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais (CCAC). Um esquema do protocolo de citometria de fluxo é mostrado na Figura 1. Se a aplicação a jusante for FACS e cultura celular subsequente, t...

Um protocolo de isolamento otimizado e validado de FAPs para músculos de ratos é essencial para pesquisadores que desejam estudar modelos de lesões que não são viáveis no camundongo por razões biológicas ou técnicas. Por exemplo, os camundongos não são um modelo animal ideal para estudar lesões crônicas locais ou neurodegenerativas, como a denervação a longo prazo. Biologicamente, a vida útil curta e o envelhecimento rápido dos camundongos dificultam o delineamento preciso do músculo sequalae devido à ...

As células progenitoras fibro-adipogênicas (FAPs) são uma população de células progenitoras multipotentes residentes no músculo esquelético que desempenham um papel crítico na homeostase muscular, reparação e regeneração, e, por outro lado, também mediam respostas patológicas à lesão muscular. Como o nome sugere, as FAPs foram originalmente identificadas como uma população progenitora com potencial para diferenciar-se em fibroblastos e adipócitos1 e foram supostamente os principais mediadores da infiltração fibro-gordurosa do músculo esquelético em lesões crônicas e doenças. Estudo suplementar revelou que as FAPs são adicionalmente capazes de osteogênese e condrogênese2,3,4. Assim, são mais amplamente notados na literatura como progenitores mesenquimais ou estrogonais3,5,6,7,8. Em lesão muscular esquelética aguda, os FAPs ajudam indiretamente na miogênese regenerativa, proliferando transitoriamente para fornecer um ambiente favorável para células de satélite musculares ativadas e seus progenitores miogênicos a jusante (MPs)contrapartes 1,9,10. Paralelamente à regeneração bem sucedida, os FAPs passam por apoptose, devolvendo seus números aos níveis de linha de base1,9,10,11. Em contraste, na lesão muscular crônica, as FAPs substituem sinais pró-apoptóticos, o que resulta em sua persistência9,10,11 e reparação muscular anormal.
Estudos in vivo que avaliam os mecanismos celulares e moleculares pelos quais as FAPs mediam as respostas musculares utilizaram modelos de animais murinos até o momento1,7,9,10,11,12,13,14. Embora camundongos geneticamente modificados sejam ferramentas poderosas para uso nessas análises, o pequeno tamanho do animal limita a disponibilidade de tecidos para estudo em modelos localizados de lesão a longo prazo onde a atrofia muscular pode ser profunda, como a denervação traumática. Além disso, a medição da força muscular e da função física requer medidas ex vivo ou in situ que requerem a terminação do camundongo, ou métodos in vivo que requerem cirurgia e/ou um anestésico geral para permitir a avaliação do desempenho contratil muscular15,16,17,18,19,20 . Em ratos, existem análises funcionais musculares bem validadas e utilizadas globalmente, além de análises para comportamentos motores mais complexos, como análise de marcha (por exemplo, Índice de Função Ciática, Análise de CatWalk) e são realizadas em animais acordados e em movimentos espontaneamente21,22,23,24 . Isso otimiza, ainda, os princípios de morbidade mínima na experimentação animal e o número de animais de pesquisa utilizados. O rato fornece ao pesquisador das FAPs a flexibilidade adicional de maior volume muscular ferido para análises proteicas e celulares e a capacidade de realizar avaliações seriais de atividades e comportamentos funcionais complexos musculares e dinâmicos, no animal de alerta.
As FAPs foram principalmente identificadas e isoladas de amostras musculares inteiras usando citometria de fluxo e triagem celular ativada por Fluorescência (FACS), respectivamente. Estes são ensaios baseados em laser que são capazes de identificar múltiplas populações celulares específicas com base em características características como tamanho, granularidade e uma combinação específica de superfície celular ou marcadores intracelulares25. Isso é altamente vantajoso no estudo de um sistema de órgãos como o músculo esquelético, pois a homeostase e a regeneração são processos complexos e multifatoriais coordenados por uma infinidade de tipos celulares. Estudo seminal identificou FAPs, bem como MPs, utilizando métodos citométricos de fluxo no músculo esquelético do camundongo1. Eles demonstraram que os FAPs são mesenquimais na natureza, por falta de antígenos superficiais específicos para células de origens endoteliais (CD31), hematopoiéticas (CD45), ou miogênicas (Integrin-α7 [ITGA7]), mas expressaram o marcador de células-tronco mesenquimal Sca-1 (antígeno de células-tronco 1)1 e diferenciado em células fibrogênicas e adipogênicas na cultura. Outros estudos demonstraram o isolamento bem-sucedido de progenitores mesenquimais em músculos com base na expressão de um marcador de células-tronco alternativo, o receptor de fator de crescimento alfa derivado de plaquetas (PDGFRα)2,7,8 e análises posteriores revelaram que estes provavelmente são a mesma população celular que as FAPs3. Os FAPs são agora comumente identificados na citometria de fluxo usando sca-1 ou PDGFRα como um marcador de seleção positivo1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . O uso de PDGFRα é preferencial para o tecido humano, no entanto, como um homólogo humano direto do Murine Sca-1 ainda não foi identificado32. Além disso, outras proteínas de superfície celular têm sido relatadas como marcadores de MPs (por exemplo, VCAM-1), fornecendo uma alternativa potencial ao ITGA7 como um indicador de células de linhagem miogênica durante o isolamentofaps 33.
Enquanto a citometria de fluxo/FACS é uma metodologia poderosa para estudar o papel e o potencial patogênico das FAPs no músculo esquelético1,9,10,11,13,29, é limitada tecnicamente pela especificidade e otimização de seus reagentes necessários. Uma vez que a identificação citométrica do fluxo e o isolamento das FAPs tem sido desenvolvido e conduzido nos modelos de animais de camundongos1,9,10,11,29, isso coloca desafios para os pesquisadores que desejam estudar FAPs em outros organismos modelo. Muitos fatores - como o tamanho ideal do tecido a ser processado, bem como a especificidade e disponibilidade de reagentes e/ou anticorpos - diferem dependendo das espécies utilizadas.
Além das barreiras técnicas para estudar FAPs em um novo modelo animal, eles têm sido em grande parte estudados em um ambiente agudo e tóxico - geralmente através de injeção química intramuscular ou cardiotoxina. A avaliação da dinâmica de longo prazo dos FAPs limita-se principalmente à avaliação na distrofia muscular de Duchenne, utilizando o modelo de camundongo mdx9,10,11, e modelos de lesão muscular combinada, como ruptura maciça do manguito rotador, onde a transposição e denervação do tendão simultâneo é realizada na musculatura do ombro26,27,28 . A resposta dos FAPs ao único insulto da denervação traumática crônica, ocorrência comum em acidentes de trabalho na indústria pesada, agricultura e em traumas de nascimento (lesão por plexo braquial)34,35,36,37 com morbidade significativa, não tem sido tão bem caracterizada, muitas vezes limitada a um período de curto prazo11,38.
Descrevemos um método para identificar e isolar FAPs e MPs de músculo esquelético severamente atroférico e fibroso no rato. Primeiro, a identificação de MPs CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs e CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ utilizando um protocolo de coloração de digestão e citometria de fluxo de tecido é demonstrada e a validação subsequente de nossos achados é realizada através da cultura e coloração imunocitológica de células isoladas do FACS. Usando este método, também relatamos um novo curso de tempo faps em um modelo de lesão de denervação isolada de longo prazo no rato.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

Progenitores fibro-adipogênicos (FAPs) são células intersticiciais residentes no músculo esquelético que, juntamente com progenitores miogênicos (MPs), desempenham um papel fundamental na homeostase muscular, lesão e reparo. Os protocolos atuais para identificação e isolamento de FAPs utilizam citometria/fluorescência ativada de triagem celular (FACS) e estudos que avaliam sua função in vivo até o momento foram realizados exclusivamente em camundongos. O maior tamanho inerente do rato permite uma análise mais abrangente das FAPs em modelos de lesão muscular esquelética, especialmente em músculos severamente atroféricos ou quando os pesquisadores requerem massa tecidual substancial para realizar múltiplos ensaios a jusante. O rato também fornece uma seleção maior de ensaios funcionais musculares que não requerem sedação ou sacrifício animal, minimizando assim a morbidade e o uso animal, permitindo avaliações seriais. Os protocolos de citometria/FACS de fluxo otimizados para camundongos são espécies específicas, notadamente restritas pelas características dos anticorpos disponíveis comercialmente. Eles não foram otimizados para separar FAPs de músculos ratos ou altamente fibrosos. Desenvolveu-se um protocolo de citometria/FACS de fluxo para identificação e isolamento de FAPs e MPs de músculo esquelético de rato saudável e denervado, contando com a expressão diferencial dos marcadores de superfície CD31, CD45, Sca-1 e VCAM-1. Como os anticorpos primários específicos do fluxo, validados pela citometria de fluxo, são severamente limitados, a conjugação interna do anticorpo que tem como alvo o Sca-1 foi realizada. Por meio deste protocolo, foi confirmada a conjugação Sca-1 bem sucedida, e a identificação citométrica de fluxo de FAPs e MPs foi validada pela cultura celular e imunossaturação de FAPs e MPs isolados pelo FACS. Finalmente, relatamos um novo curso de tempo faps em um modelo prolongado (14 semanas) de denervação de ratos. Este método fornece aos pesquisadores a capacidade de estudar FAPs em um novo modelo animal.

Identificação de FAPs e MPs via citometria de fluxo usando um novo painel de anticorpos, incluindo Sca-1 e VCAM-1 A estratégia de gating para identificar FAPs no músculo de rato baseia-se nos protocolos de citometria de fluxo no mouse29, que portão em células positivas CD31 (endotelial) e CD45 (hematopoiética) (denominada linhagem [Lin]) e examina o perfil fluorescente do marcador FAPs Sca-1 e MPs marcador ITGA7 da popu...

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Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Este protocolo descreve um método para isolar progenitores fibro-adipogênicos (FAPs) e progenitores miogênicos (MPs) do músculo esquelético de rato. A utilização do rato em modelos de lesão muscular proporciona maior disponibilidade tecidual do músculo atroférico para a análise e um repertório maior de métodos validados para avaliar a força muscular e a marcha em animais em movimento livre.

Identificação, Isolamento e Caracterização de Progenitores Fibro-Adipogênicos (FAPs) e Progenitores Miogênicos (MPs) em Músculo Esquelético no Rato

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Como os FAPs são mediadores da regeneração muscular e da fibrose patológica, nosso protocolo permite a caracterização da dinâmica fap pós lesão muscular e isolamento de FAPs para estudos in vitro ou ex vivo. Até o momento, estudos têm sido realizados exclusivamente em FAPs isolados de camundongos. Nosso protocolo permite o isolamento efetivo das FAPs do rato maior, proporcionando uma disponibilidade de tecido muito maior para ensaios a jusante.O tempo prolongado de processamento de tecidos pode afetar negativamente a viabilidade das FAPs. Se várias amostras estiverem sendo processadas simultaneamente, recomenda-se que dois operadores executem o protocolo em conjunto para maximizar a viabilidade celular isolada. Comece colocando o tecido muscular colhido em um prato de cultura celular estéril de 10 centímetros.Rasgue suavemente e pique o tecido com fórceps e remova o tecido conjuntivo para obter aproximadamente três a quatro milímetros de pedaços cubos. Transfira o tecido minster para um tubo cônico estéril de 50 mililitros contendo seis mililitros de DMEM e 1%penicilina-estreptomicina. Em seguida, ative 365 microliters de solução de colagenase II adicionando 10 microliters de 300 mililitros de solução de cloreto de cálcio.Adicione a solução ativada de colagemnase II ao chorume tecidual para uma concentração final de 250 unidades por mililitro. Incubar os tubos em um agitador por uma hora e a 37 graus Celsius a 240 x g com agitação manual a cada 15 minutos para desalojar tecido aderido ao lado do tubo. Após uma hora de incubação, adicione 100 microliters de colagenase II e 50 microliters de despase à amostra.Em seguida, a pipeta amostra 15 a 20 vezes com uma pipeta sorológica até que a solução seja homogênea. Incubar a amostra novamente por 30 minutos a 37 graus Celsius e 240 x g com agitação manual a cada 15 minutos. Corte lentamente as amostras de solução muscular através de uma seringa de 20 mililitros com uma agulha de calibre 20 para 10 ciclos.Em seguida, coloque um coador de células de 40 mícrons em um tubo cônico estéril de 50 mililitros e molhe-o ao esbofetear cinco mililitros de DMEM suplementados com 10% FBS e 1%penicilina-estreptomicina. Pipeta a amostra um mililitro de cada vez através do coador. Uma vez filtrada toda a amostra, lave o coador celular com DMEM suplementado com 10% de FBS e 1%penicilina-estreptomicina para levar o volume total da amostra a 25 mililitros.Divida o volume amostral igualmente em dois tubos cônicos de 15 mililitros e centrífuga a 15 graus Celsius, 400 x g por 15 minutos. Após a centrifugação, aspire o supernasciente e resuspenda a pelota em um mililitro de tampão de lise RBC à temperatura ambiente por sete minutos. Em seguida, adicione nove mililitros de tampão de lavagem para trazer o volume para 10 mililitros e centrífuga a 15 graus Celsius, 400 x g por 15 minutos.Após a centrifugação, aspire o supernasciente e resuspenja a pelota em um mililitro de tampão de lavagem. Transfira um volume apropriado de células para um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro e misture-o com corante azul trypan. Conte células vivas em um microscópio leve usando um hemótmetro.Para citometria de fluxo, transfira de uma a 2 milhões de células por amostra experimental para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro estéril. Leve o volume da amostra para um mililitro com tampão de lavagem e coloque o tubo no gelo. Configure todos os controles para o experimento.Para controles celulares, alíquota de 500.000 a 1 milhão de células em um mililitro de tampão de lavagem em um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mililitro e colocá-lo no gelo. Se o experimento estiver sendo realizado pela primeira vez, também devem ser incluídas suspensões celulares de uma única mancha. Para configurar controles de contas, adicione cerca de 150.000 contas de compensação positivas a cada tubo de centrífuga de 1,5 mililitro rotulado.Prepare o controle de viabilidade transferindo metade do volume celular do tubo de viabilidade para atualizar o tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro rotulado morto. Incubar o tubo morto a 65 graus Celsius por dois a três minutos, em seguida, colocá-lo no gelo. Após a incubação, devolva as células mortas ao tubo de viabilidade.Centrifugar as suspensões unicelulares, incluindo amostras experimentais e de controle a 500 x g e quatro graus Celsius por cinco minutos, e resuspende as cápsulas de célula em 100 microliters de tampão de lavagem depois de aspirar o supernatante. Adicione anticorpos de acordo com o controle ou condição experimental, e gire suavemente a amostra para garantir a mistura completa. Em seguida, incubar-los no gelo no escuro por 15 minutos.Para compensação, incubar o tubo à temperatura ambiente no escuro por 15 minutos. Leve o volume de cada amostra a um mililitro adicionando 900 microliters de tampão de lavagem à suspensão unicelular, e 900 microliters de PBS para controles de contas de compensação. Centrífugas suspensões unicelulares a 500 x g e quatro graus Celsius por cinco minutos, e controles de contas de compensação a 300 x g e quatro graus Celsius por cinco minutos.Após a centrifugação das amostras, aspire o supernascer e resuspenja a pelota celular em 300 microliters de tampão de lavagem, e controles de contas em 300 microliters de PBS e 150.000 contas de compensação negativa. Mantenha as amostras de células em amostras de gelo e contas à temperatura ambiente sob papel alumínio. Proceda com a aquisição da citometria de fluxo, configurando a estratégia de gating para identificar progenitores fibro-adipogênicos e progenitores miogênicos.Na análise representativa, foi confirmada a conjugação bem sucedida do Anticorpo APC Sca-1 APC com coloração única de contas de compensação e suspensões celulares geradas a partir de músculo gastrocnemius de rato saudável. Cinco concentrações diferentes de Sca-1 APC foram tituladas em suspensões unicelulares, e a concentração ideal de anticorpos foi identificada com base na maior intensidade de fluorescência com coloração mínima de fundo. As identificações citométricas de fluxo de FAPs e MPs em gastrocnemius de ratos foram realizadas utilizando-se a estratégia de gating mostrada aqui.As amostras foram primeiramente fechadas para excluir detritos na contagem de contas. As células foram então fechadas para excluir doublets pelas características de dispersão frontal e dispersão lateral. A viabilidade das células resultantes foi avaliada pela coloração com SYTOX Blue.Os singlets negativos SYTOX Blue foram avaliados para CD31 e CD45 para excluir as frações Lin+. A população de Lin foi avaliada. As células que foram positivas para o Sca-1 foram designadas FAPs, e as células que foram positivas para vcam-1 foram designadas MPs.Com a co-imunosmunhagem imediatamente após a triagem, a população recém-isolada de FAPs apresentou coloração positiva para PDGFRalpha sem contaminação por células positivas Pax7. Por outro lado, a população classificada de PMs manchou positivamente para Pax7 com ausência de células PDGFRalpha-positivas. Os FAPs demonstraram fibroblastos e adipócitos diferenciados no dia 12 em meios de diferenciação adipogênica com expressão de proteína específica do fibroblasto 1 e perilipin 1, respectivamente.A presença de triglicérides neutros e lipídios de adipócitos maduros ficou evidente com a coloração de O Vermelho-Óleo. Além disso, os FAPs demonstraram presença de colágeno tipo I e ausência de miócitos contaminantes. Os PMs cultivados em mídia de diferenciação miogênica no dia 12 mostraram a presença de miótutos maduros e miótubos multinucleados fundidos, e estavam livres de fibroblastos e contaminação por adipócitos.Ao usar essa técnica para isolar células vivas para cultura de longo prazo, os pesquisadores devem garantir o uso da técnica asséptica ao mesmo tempo em que trabalham eficientemente para garantir uma boa viabilidade celular.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adultas e embrionárias Cultura Microexplant Músculo Esquelético e isolamento de células-tronco musculares

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Biologia

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Purificação de Progenitores do músculo esquelético

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Identificação e Análise de Progenitores rato Eritróides usando o CD71/TER119 Assay citometria de fluxo-

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Uma análise quantitativa para expressar Insulin-formadoras de colônias Progenitores

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedimentos para Rat<em&gt; In situ</em&gt; Propriedades contrátil do músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

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Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

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Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Avaliação do cálcio Faíscas intactas fibras musculares esqueléticas

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Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

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Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Isolamento de Progenitores de Megacaiócitos de Rato

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