Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Основные объекты проточной цитометрии в Университете Оттавы и Исследовательский центр биомедицинских наук Кинана (KRC), больницу Сент-Майклс Юнити Хелс Торонто за их опыт и руководство по оптимизации протокола проточной цитометрии / FACS, представленного в этой рукописи. Эта работа была профинансирована Фондом «Медицина от дизайна новых идей 2018» (MbDNI-2018-01) для JB.

Следователи, проводящие этот протокол, должны получить разрешение от своего местного совета по этике животных / комитета по уходу за ними. Все работы с животными были одобрены Комитетом по уходу за животными больницы Святого Михаила Unity Health Toronto (ACC #918) и проводились в соответствии с руко?...

Оптимизированный, проверенный протокол изоляции FAPs для мышц крыс имеет важное значение для исследователей, которые хотят изучить модели травм, которые неосуществимы у мыши по биологическим или техническим причинам. Например, мыши не являются оптимальной животной моделью для изучения...

Фибро-адипогенные клетки-предшественники (FAP) представляют собой популяцию резидентных мультипотентных клеток-предшественников в скелетных мышцах, которые играют решающую роль в гомеостазе мышц, восстановлении и регенерации и, наоборот, также опосредуют патологические реакции на повреждение мышц. Как следует из названия, FAP были первоначально идентифицированы как популяция-прародитель с потенциалом дифференцироваться в фибробласты и адипоциты1 и претендовали на то, чтобы быть ключевыми медиаторами фиброзно-жировой инфильтрации скелетных мышц при хронических травмах и заболеваниях. Дальнейшие исследования показали, что ФАП дополнительно способны к остеогенезу и хондрогенезу2,3,4. Таким образом, они более широко обозначены в литературе как мезенхимальные или стромальные прародители3,5,6,7,8. При остром повреждении скелетных мышц ФАП косвенно помогают в регенеративном миогенезе, временно размножаясь, чтобы обеспечить благоприятную среду для активированных мышечных клеток-сателлитов и их последующих миогенных предшественников(МП) 1,9,10. Параллельно с успешной регенерацией ФАП подвергаются апоптозу, возвращая их количество к исходным уровням1,9,10,11. Напротив, при хронической мышечной травме ФАП перекрывают проапоптотические сигналы, что приводит к их стойкости9,10,11 и аномальному восстановлению мышц.
В исследованиях in vivo, оценивающих клеточные и молекулярные механизмы, с помощью которых FAP опосредуют мышечные реакции, использовались мышиные животные модели на сегодняшний день1,7,9,10,11, 12,13,14. В то время как генетически модифицированные мыши являются мощными инструментами для использования в этих анализах, небольшой размер животного ограничивает доступность тканей для изучения в долгосрочных локализованных моделях травм, где атрофия мышц может быть глубокой, такой как травматическая денервация. Кроме того, измерение мышечной силы и физической функции требует измерений ex vivo или in situ, которые требуют прекращения работы мыши, или методов in vivo, которые требуют хирургического вмешательства и/ или общей анестезии для оценки сократительной производительности мышц15,16,17,18,19,20 . У крыс существуют хорошо проверенные и глобально используемые мышечные функциональные анализы, в дополнение к анализу более сложного двигательного поведения, такого как анализ походки (например, индекс седалищной функции, анализ подиума), которые выполняются у бодрствующих и спонтанно движущихся животных21,22,23,24 . Это дополнительно оптимизирует принципы минимальной заболеваемости в экспериментах на животных и количество используемых исследовательских животных. Таким образом, крыса предоставляет исследователю FAPs дополнительную гибкость большего поврежденного мышечного объема для белкового и клеточного анализа и возможность проводить серийные оценки статической и динамической функциональной активности и поведения мышечного комплекса у бдительного животного.
FAP в основном были идентифицированы и выделены из целых мышечных образцов с использованием проточной цитометрии и флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) соответственно. Это лазерные анализы, которые способны идентифицировать несколько специфических клеточных популяций на основе характерных признаков, таких как размер, гранулярность и конкретная комбинация клеточной поверхности или внутриклеточных маркеров25. Это очень выгодно при изучении системы органов, такой как скелетные мышцы, поскольку гомеостаз и регенерация являются сложными, многофакторными процессами, координируемыми множеством типов клеток. Основополагающее исследование идентифицировало FAP, а также MP, используя методы проточной цитометрии в скелетных мышцах мышей1. Они продемонстрировали, что FAP являются мезенхимальными по своей природе, поскольку в них отсутствовали поверхностные антигены, специфичные для клеток эндотелиального (CD31), кроветворного (CD45) или миогенного (Integrin-α7 [ITGA7]) происхождения, но экспрессировали маркер мезенхимальных стволовых клеток Sca-1 (Stem cell antigen 1)1 и дифференцировали в фиброгенные и адипогенные клетки в культуре. Другие исследования продемонстрировали успешную изоляцию мезенхимальных предшественников в мышцах на основе экспрессии альтернативного маркера стволовых клеток, рецептора фактора роста тромбоцитов альфа (PDGFRα)2,7,8, и дальнейший анализпоказал,что они, вероятно, являются той же клеточной популяцией, что и FAPs3. ФАП в настоящее время обычно идентифицируются в проточной цитометрии с использованием Sca-1 или PDGFRα в качестве положительного маркера отбора1,9,10,11, 12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Однако использование PDGFRα является предпочтительным для тканей человека, поскольку прямой человеческий гомолог мышиного Sca-1 еще не идентифицирован32. Кроме того, сообщалось о других белках клеточной поверхности в качестве маркеров МП (например, VCAM-1), обеспечивая потенциальную альтернативу ITGA7 в качестве индикатора клеток миогенной линии во время выделения FAPs33.
Хотя проточная цитометрия/FACS является мощной методологией изучения роли и патогенного потенциала ФАП в скелетных мышцах1,9,10,11, 13,29,она технически ограничена специфичностью и оптимизацией необходимых ей реагентов. Поскольку проточная цитометрическая идентификация и выделение FAP были разработаны и проведены на мышиных животных моделях1,9,10,11,29,это создает проблемы для исследователей, которые хотят изучать FAP в других модельных организмах. Многие факторы, такие как оптимальный размер обрабатываемой ткани, а также специфичность и доступность реагентов и/или антител, различаются в зависимости от используемого вида.
В дополнение к техническим барьерам для изучения ФАП на новой модели животных, они в значительной степени изучались в острых, токсичных условиях - обычно с помощью внутримышечной химической инъекции или кардиотоксина. Оценка долгосрочной динамики ФАП ограничивается главным образом оценкой мышечной дистрофии Дюшенна с использованием mdx мышиноймодели9,10, 11и моделей комбинированной мышечной травмы, такой как массивный разрыв вращательной манжеты, где одновременная трансекция сухожилия и денервация выполняются на мускулатуре плеча26,27,28 . Реакция ФАПов на единственное оскорбление хронической травматической денервацией, распространенной при несчастных случаях на производстве в тяжелой промышленности, сельском хозяйстве и при родовых травмах (травма плечевого сплетения)34,35,36,37 со значительной заболеваемостью, не была так хорошо охарактеризована, часто ограничена краткосрочными временными рамками11,38.
Мы описываем метод выявления и изоляции ФАПов и депутатов от здоровых, а также сильно атрофических и фиброзных скелетных мышц у крыс. Во-первых, продемонстрирована идентификация CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1-FAPs и CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MPs с использованием протокола окрашивания тканевой сбраживания и проточной цитометрии, а последующая валидация наших результатов осуществляется с помощью культуры и иммуноцитохимического окрашивания клеток, выделенных FACS. Используя этот метод, мы также сообщаем о новом временном курсе FAPs в долгосрочной изолированной модели травмы денервации у крыс.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

Фибро-адипогенные предшественники (FAP) являются резидентными интерстициальными клетками в скелетных мышцах, которые вместе с миогенными предшественниками (MP) играют ключевую роль в гомеостазе мышц, травмах и восстановлении. Современные протоколы идентификации и изоляции FAP используют проточную цитометрию / флуоресцентно-активированную сортировку клеток (FACS), а исследования, оценивающие их функцию in vivo, на сегодняшний день были проведены исключительно на мышах. Больший размер, присущий крысе, позволяет проводить более полный анализ FAP в моделях травм скелетных мышц, особенно в сильно атрофированных мышцах или когда исследователям требуется значительная масса тканей для проведения нескольких анализов вниз по течению. Крыса дополнительно предоставляет больший выбор мышечных функциональных анализов, которые не требуют седации или жертвоприношения животных, тем самым сводя к минимуму заболеваемость и использование животными, позволяя проводить серийные оценки. Протоколы проточной цитометрии / FACS, оптимизированные для мышей, являются видоспецифичными, в частности, ограниченными характеристиками коммерчески доступных антител. Они не были оптимизированы для отделения ФАПов от крыс или сильно фиброзных мышц. Был разработан протокол проточной цитометрии /FACS для идентификации и изоляции FAP и MPs как из здоровых, так и из денервированных скелетных мышц крыс, основанный на дифференциальной экспрессии поверхностных маркеров CD31, CD45, Sca-1 и VCAM-1. Поскольку специфические для крыс первичные антитела, подтвержденные проточной цитометрией, сильно ограничены, была выполнена внутренняя конъюгация антитела, нацеленного на Sca-1. С помощью этого протокола была подтверждена успешная конъюгация Sca-1, а проточная цитометрическая идентификация FAP и MP была подтверждена клеточной культурой и иммуноокрашиванием FACS-изолированных FAP и MP. Наконец, мы сообщаем о новом временном курсе FAPs в пролонгированной (14 недель) модели денервации крыс. Этот метод предоставляет исследователям возможность изучать FAP в новой модели животных.

Идентификация FAP и MP с помощью проточной цитометрии с использованием новой панели антител, включая Sca-1 и VCAM-1 Стратегия определения ФАПов в мышцах крыс основана на протоколах проточной цитометрии у мыши29,которая распространяется на CD31...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Этот протокол описывает метод выделения фибро-адипогенных предшественников (FAP) и миогенных предшественников (MP) из скелетных мышц крыс. Использование крысы в моделях мышечных травм обеспечивает повышенную доступность тканей из атрофических мышц для анализа и более широкий репертуар проверенных методов для оценки мышечной силы и походки у свободно движущихся животных.

Идентификация, выделение и характеристика фибро-адипогенных предшественников (ФАП) и миогенных прародителей (МП) в скелетных мышцах крыс

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Поскольку FAP являются медиаторами регенерации мышц и патологического фиброза, наш протокол позволяет характеризовать динамику FAP после повреждения мышц и выделять FAP для исследований in vitro или ex vivo. На сегодняшний день исследования проводились исключительно на ФАПах, выделенных у мышей. Наш протокол позволяет эффективно изолировать FAP от более крупной крысы, обеспечивая гораздо большую доступность тканей для последующих анализов.Длительное время обработки тканей может негативно повлиять на жизнеспособность ФАПов. Если одновременно обрабатывается несколько образцов, рекомендуется, чтобы два оператора выполняли протокол в тандеме, чтобы максимизировать жизнеспособность изолированной клетки. Начните с помещения собранной мышечной ткани в стерильную 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток.Аккуратно порвите и измельчите ткань щипцами и удалите соединительную ткань, чтобы получить примерно три-четыре миллиметровых кубических кусочка. Переложите минстерную ткань в стерильную 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую шесть миллилитров ДМЭМ и 1% пенициллина-стрептомицина. Далее активируют 365 микролитров раствора коллагеназы II путем добавления 10 микролитров 300-миллимолярного раствора хлорида кальция.Добавьте активированный раствор коллагеназы II в тканевую суспензию для окончательной концентрации 250 единиц на миллилитр. Инкубируют пробирки в шейкере в течение одного часа и при температуре 37 градусов Цельсия при 240 х г с ручным перемешиванием каждые 15 минут для смещения ткани, прилипшей к боковой стороне трубки. После одного часа инкубации добавьте в образец 100 микролитров коллагеназы II и 50 микролитров диспазы.Затем пипетка отбирается от 15 до 20 раз серологической пипеткой до тех пор, пока раствор не станет однородным. Снова инкубируйте образец в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия и 240 х г при ручном перемешивании каждые 15 минут. Медленно срезайте образцы мышечного раствора через 20-миллилитровый шприц с иглой 20-го калибра в течение 10 циклов.Затем поместите 40-микронный клеточный ситечко на стерильную 50-миллилитровую коническую трубку и смочите ее, пипетируя пять миллилитров DMEM, дополненных 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином. Пипетка образца по одному миллилитру за раз через ситечко. После того, как весь образец отфильтрован, промыть клеточный ситечко DMEM, дополненным 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицином, чтобы довести общий объем образца до 25 миллилитров.Разделите объем образца поровну на две 15-миллилитровые конические трубки и центрифугу при 15 градусах Цельсия, 400 х г в течение 15 минут. После центрифугирования аспирируют супернатант и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре буфера лизиса эритроцитов при комнатной температуре в течение семи минут. Затем добавьте девять миллилитров промывочного буфера, чтобы довести объем до 10 миллилитров и центрифугу при 15 градусах Цельсия, 400 х г в течение 15 минут.После центрифугирования аспирируют супернатант и повторно суспендируют гранулу в одном миллилитре промывочного буфера. Переложите соответствующий объем клеток в отдельную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку и смешайте ее с красителем трипан-синего цвета. Подсчитывайте живые клетки на световом микроскопе с помощью гемоцитометра.Для проточной цитометрии перенесите от одной до 2 миллионов клеток на экспериментальный образец в стерильную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Доведите объем образца до одного миллилитра с помощью промывочного буфера и поместите трубку на лед. Настройте все элементы управления для эксперимента.Для клеточного контроля аликвотирует от 500 000 до 1 миллиона клеток в одном миллилитре промывочного буфера в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке и поместите его на лед. Если эксперимент проводится впервые, следует также включить одноокрашенные клеточные суспензии. Чтобы настроить элементы управления шариками, добавьте около 150 000 шариков с положительной компенсацией к каждой маркированной 1,5-миллилитровой центрифужной трубке.Подготовьте контроль жизнеспособности, перенеся половину объема ячейки из трубки жизнеспособности в обновленную 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, помеченную как мертвая. Высиживают мертвую трубку при 65 градусах Цельсия в течение двух-трех минут, затем кладут ее на лед. После инкубации верните мертвые клетки в трубку жизнеспособности.Центрифугируйте одноэлементные суспензии, включая экспериментальные и контрольные образцы при 500 х г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, и повторно суспендируйте гранулы клеток в 100 микролитрах промывочного буфера после аспирации супернатанта. Добавьте антитела в соответствии с контрольными или экспериментальными условиями и осторожно проведите по образцу, чтобы обеспечить полное перемешивание. Затем высиживают их на льду в темноте в течение 15 минут.Для компенсации бусины высиживают трубку при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут. Доведите объем каждого образца до одного миллилитра, добавив 900 микролитров промывочного буфера к одноэлементной суспензии и 900 микролитров PBS для управления компенсационным шариком. Центрифуга одноэлементных суспензий при 500 х г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, а компенсационные шарики контролируют при 300 х г и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.После центрифугирования образцов аспирируют супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу в 300 микролитрах буфера промывки, а контроль шариков в 300 микролитрах PBS и 150 000 бусин с отрицательной компенсацией. Храните образцы клеток на льду и образцах шариков при комнатной температуре под алюминиевой фольгой. Приступайте к приобретению проточной цитометрии, устанавливая стратегию гатинга для выявления фибро-адипогенных предшественников и миогенных предшественников.В репрезентативном анализе была подтверждена успешная конъюгация антитела Sca-1 APC с однократным окрашиванием компенсационных шариков и клеточных суспензий, полученных из здоровой икроножной мышцы крысы. Пять различных концентраций Sca-1 APC были титрованы на одноклеточных суспензиях, и оптимальная концентрация антител была идентифицирована на основе наибольшей интенсивности флуоресценции с минимальным фоновым окрашиванием. Проточная цитометрическая идентификация ФАПов и МП у икроножной мышцы крыс была выполнена с использованием стратегии гатинга, показанной здесь.Образцы были сначала закрыты, чтобы исключить мусор в счетных бусинах. Затем ячейки были закрыты, чтобы исключить дублеты как по характеристикам переднего рассеяния, так и по характеристикам бокового рассеяния. Жизнеспособность полученных клеток оценивали окрашиванием SYTOX Blue.Отрицательные синглеты SYTOX Blue оценивались на CD31 и CD45 для исключения фракций Lin+. Оценивалась линьская популяция. Ячейки, которые были единственными положительными для Sca-1, были обозначены FAP, а ячейки, которые были единственными положительными для VCAM-1, были назначены депутатами.При коиммуноранении сразу после сортировки свежеизолированная популяция ФАП показала положительное окрашивание pdgfRalpha без загрязнения положительными клетками Pax7. И наоборот, отсортированная популяция депутатов окрашена положительно для Pax7 с отсутствием PDGFRalpha-положительных клеток. ФАПы продемонстрировали дифференцированные фибробласты и адипоциты на 12-й день в адипогенных дифференцировочных средах с экспрессией фибробласт-специфического белка 1 и перилипина 1 соответственно.Присутствие нейтральных триглицеридов и липидов из зрелых адипоцитов было очевидно при окрашивании Oil Red O. Кроме того, FAPs продемонстрировали наличие коллагена типа I и отсутствие загрязняющих миоцитов. МП, выращенные в миогенных дифференцировочных средах на 12-й день, демонстрировали наличие зрелых миоцитов и слитых многоядерных миотрубок и были свободны от фибробластов и загрязнения адипоцитами.При использовании этого метода для выделения живых клеток для долгосрочной культуры исследователи должны обеспечить использование асептической техники, одновременно эффективно работая для обеспечения хорошей жизнеспособности клеток.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Взрослые и эмбриональные скелетных мышц Microexplant культуры и выделение скелетных мышц стволовых клеток

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Очистка прародителей из скелетных мышц

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Идентификация и анализ Мышь прародителей эритроидных использованием CD71/TER119 Flow-цитометрии Пробирной

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

Количественный анализ на инсулиноподобный выражения колониеобразующих прародителей

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Процедуры для Крысы<em&gt; На месте</em&gt; Скелетных мышц сократительные свойства

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Выделение и первичной культуре клеток крысы Печеночная

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Оценка кальция Sparks в малонарушенных скелетных мышечных волокон

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Выделение и характеристика экзосом фибробластов скелетных мышц

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Выделение прародителей мегакариоцитов мыши

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...