Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Vi vill tacka Flow cytometri Core Facilities vid University of Ottawa och Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto för deras expertis och vägledning i optimering av flödescytometri/ FACS-protokollet som presenteras i detta manuskript. Detta arbete finansierades av Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) till JB.

Utredare som genomför detta protokoll måste få tillstånd från sin lokala djuretiska styrelse/vårdkommitté. Allt djurarbete godkändes av St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Animal Care Committee (ACC #918) och genomfördes i enlighet med riktlinjerna från Canadian Council on Animal Care (CCAC). Ett schema för flödescytometriprotokollet visas i figur 1. Om nedströmsapplikationen är FACS och efterföljande cellkultur bör alla steg slutföras med rätt aseptisk teknik.
...

Ett optimerat, validerat FAPs isoleringsprotokoll för råttmuskel är viktigt för forskare som vill studera skademodeller som inte är genomförbara i musen av biologiska eller tekniska skäl. Till exempel är möss inte en optimal djurmodell för att studera kroniska lokala eller neurodegenerativa skador som långsiktig denervation. Biologiskt gör mössens korta livslängd och snabba åldrande det svårt att noggrant avgränsa muskelsequalae på grund av denervation från den förvirrande faktorn åldrande. Ur teknis...

Fibro-adipogenic stamceller (FAPs) är en population av bosatta multipotent stamceller i skelettmuskulaturen som spelar en kritisk roll i muskel homeostas, reparation och regenerering, och omvänt också medla patologiskt svar på muskel skada. Som namnet antyder identifierades FAPs ursprungligen som en stampopulation med potential att differentiera sig till fibroblaster och adipocyter1 och påstods vara de viktigaste medlarna för fibro-fet infiltration av skelettmuskulaturen i kronisk skada och sjukdom. Ytterligare studie visade att FAPs dessutom är kapabla till osteogenes och kondrogenes2,3,4. Således noteras de mer allmänt i litteraturen som mesenkymala eller stromala föregångare3,5,6,7,8. Vid akut skelettmuskelskada hjälper FAPs indirekt till regenerativ myogenes genom att tillfälligt föröka sig för att ge en gynnsam miljö för aktiverade muskelsatellitceller och deras nedströms myogena stamceller (MPs) motsvarigheter1,9,10. Parallellt med framgångsrik regenerering genomgår FAPs apoptos och återgår till baslinjenivåerna1,9,10,11. Däremot, i kronisk muskelskada, FAPs åsidosätta pro-apoptotic signaler, vilket resulterar i deras persistens9,10,11 och onormal muskelreparation.
In vivo-studier som utvärderar de cellulära och molekylära mekanismer genom vilka FAPs förmedlar muskelsvar har använt murindjurmodeller hittills1,7,9,10,11,12,13,14. Medan genetiskt konstruerade möss är kraftfulla verktyg för användning i dessa analyser, begränsar djurets lilla storlek vävnadstillgängligheten för studier i långsiktiga lokaliserade skademodeller där muskelatrofi kan vara djupgående, såsom traumatisk denervation. Dessutom kräver mätning av muskelstyrka och fysisk funktion ex vivo- eller in situ-mätningar som kräver att musen avslutas, eller in vivo-metoder som kräver operation och/eller narkos för att möjliggöra utvärdering av muskelkontraktilprestanda15,16,17,18,19,20 . Hos råttor finns väl validerade och globalt använda muskelfunktionella analyser, förutom analyser för mer komplexa motoriska beteenden som gånganalys (t.ex. ischiasfunktionsindex, CatWalk-analys) och utförs i vakna och spontant rörliga djur21,22,23,24 . Detta optimerar dessutom principerna om minimal sjuklighet i djurförsök och antalet forskningsdjur som används. Råttan ger därmed FAPs utredare den extra flexibiliteten av större skadad muskelvolym för protein- och cellulära analyser och förmågan att genomföra seriella bedömningar av muskelkomplex statisk och dynamisk funktionell aktivitet och beteenden, i varningsdjuret.
FAPs har främst identifierats och isolerats från hela muskelprover med hjälp av flödescytometri respektive fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Dessa är laserbaserade analyser som kan identifiera flera specifika cellpopulationer baserat på karakteristiska egenskaper som storlek, granularitet och en specifik kombination av cellyta eller intracellulära markörer25. Detta är mycket fördelaktigt i studien av ett organsystem som skelettmuskulatur, eftersom homeostas och regenerering är komplexa, multifaktoriella processer samordnade av en mängd celltyper. En viktig studie identifierade FAPs, liksom parlamentsledamöter, med hjälp av flöde cytometriska metoder i mus skelettmuskel1. De visade att FAPs är mesenkymal till sin natur, eftersom de saknade ytan antigener specifika för celler från endotel (CD31), hematopoietic (CD45), eller myogena (Integrin-α7 [ITGA7]) ursprung, men uttryckte den mesenkymala stamcellsmarkör sca-1 (stamcell antigen 1)1 och differentieras till fibrogenic och adipogenic celler i kultur. Andra studier visade framgångsrik isolering av mesenkymala stamceller i muskler baserat på uttrycket av en alternativ stamcellsmarkör, trombocyt-härledd tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRα)2,7,8 och ytterligare analys visade att dessa sannolikt är samma cellpopulation som FAPs3. Faps identifieras nu ofta i flödescytometri med antingen Sca-1 eller PDGFRα som en positiv urvalsmarkör1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . Användningen av PDGFRα är dock företräde för mänsklig vävnad, eftersom en direkt mänsklig homolog av murin Sca-1 ännu inte har identifierats32. Dessutom har andra cellytans proteiner rapporterats som markörer för parlamentsledamöter (t.ex. VCAM-1), vilket ger ett potentiellt alternativ till ITGA7 som en indikator på celler av myogen härstamning under FAPs isolering33.
Medan flöde cytometri / FACS är en kraftfull metod för att studera rollen och patogen potential av FAPs i skelettmuskeln1,9,10,11,13,29, det begränsas tekniskt av specificiteten och optimeringen av dess nödvändiga reagenser. Eftersom flödescytometrisk identifiering och isolering av FAPs har utvecklats och utförts i musdjursmodeller1,9,10,11,29, innebär detta utmaningar för forskare som vill studera FAPs i andra modellorganismer. Många faktorer - såsom optimal vävnadsstorlek som ska bearbetas, liksom reagens och/eller antikroppsitalitet och tillgänglighet - varierar beroende på vilken art som används.
Förutom de tekniska hindren för att studera FAPs i en ny djurmodell har de till stor del studerats i en akut, giftig miljö - vanligtvis via intramuskulär kemisk injektion eller kardiotoxin. Utvärdering av den långsiktiga dynamiken hos FAPs är främst begränsad till bedömning i Duchennes muskeldystrofi, med hjälp av mdxmusmodell9,10,11, och modeller av kombination muskelskada såsom massiv rotator manschett tår där samtidig sena transection och denervation utförs på axel muskulatur26,27,28 . Faps svar på den enda förolämpningen av kronisk traumatisk denervation, en vanlig förekomst i arbetsplatsolyckor i tung industri, jordbruk och i födelsetrauma (brachial plexusskada)34,35,36,37 med betydande sjuklighet, har inte karakteriserats lika väl, ofta begränsat till en kortvarig tidsram11,38.
Vi beskriver en metod för att identifiera och isolera FAPs och parlamentsledamöter från friska samt allvarligt atrofiska och fibrotic skelettmuskulaturen i råttan. För det första, identifiering av CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- FAPs och CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ MPs med hjälp av en vävnad matsmältning och flöde cytometri färgning protokoll visas och efterföljande validering av våra resultat utförs genom kultur och immunocytochemical färgning av FACS-isolerade celler. Med den här metoden rapporterar vi också en ny FAPs tidskurs i en långsiktig isolerad denervation skada modell i råttan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) är bosatta interstitiella celler i skelettmuskulaturen som, tillsammans med myogena stamceller (MPs), spelar en nyckelroll i muskel homeostas, skada och reparation. Nuvarande protokoll för FAPs identifiering och isolering använder flöde cytometri/fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och studier som utvärderar deras funktion in vivo hittills har genomförts uteslutande på möss. Råttans större inneboende storlek möjliggör en mer omfattande analys av FAPs i skelettmuskelskada modeller, särskilt i allvarligt bestod muskel eller när utredare kräver betydande vävnad massa att genomföra flera nedströms analyser. Råttan ger dessutom ett större urval av muskelfunktionella analyser som inte kräver djursedering eller uppoffring, vilket minimerar sjuklighet och djuranvändning genom att möjliggöra seriella bedömningar. Flödescytometrin/FACS-protokollen optimerade för möss är artspecifika, särskilt begränsade av egenskaperna hos kommersiellt tillgängliga antikroppar. De har inte optimerats för att separera FAPs från råtta eller mycket fibrotic muskel. Ett flöde cytometry/FACS protokoll för identifiering och isolering av FAPs och MPs från både friska och denervated råtta skelettet muskel utvecklades, förlita sig på differentiell uttryck av ytan markörer CD31, CD45, Sca-1 och VCAM-1. Eftersom råttspecifikt flöde cytometri-validerade primära antikroppar är allvarligt begränsade, utfördes intern konjugation av antikroppen som riktade sig mot Sca-1. Med hjälp av detta protokoll bekräftades framgångsrik Sca-1 konjugation, och flöde cytometrisk identifiering av FAPs och parlamentsledamöter validerades av cell kultur och immunstaining av FACS-isolerade FAPs och parlamentsledamöter. Slutligen rapporterar vi en ny FAPs tidskurs i en långvarig (14 veckor) råtta denervation modell. Denna metod ger utredarna möjlighet att studera FAPs i en ny djurmodell.

Identifiera FAPs och parlamentsledamöter via flödescytometri med hjälp av en ny antikroppspanel inklusive Sca-1 och VCAM-1 Gating-strategin för att identifiera FAPs i råttmuskeln är baserad på flödescytometriprotokoll i musen29, som grind på CD31 (endotel) och CD45 (hematopoetiska) positiva celler (kallas härstamningen [Lin]) och undersöker fluorescerande profilen av FAPs markör Sca-1 och parlamentsledamöter marke...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Detta protokoll skisserar en metod för att isolera Fibro-adipogenic stamceller (FAPs) och myogena stamceller (MPs) från råtta skelettmuskulaturen. Användning av råttan i muskelskada modeller ger ökad vävnad tillgänglighet från bestod muskel för analysen och en större repertoar av validerade metoder för att bedöma muskelstyrka och gång i fria djur.

Identifiering, isolering och karakterisering av fibroadiogena stamceller (FAPs) och myogena stamceller (MPs) i skelettmuskulaturen i råttan

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Eftersom FAPs är medlare av muskel regenerering och patologisk fibros, tillåter vårt protokoll karakterisering av FAP dynamik efter muskelskada och isolering av FAPs för in vitro eller ex vivo studier. Hittills har studier utförts uteslutande på FAPs isolerade från möss. Vårt protokoll möjliggör effektiv isolering av FAPs från den större råttan, vilket ger mycket större vävnad tillgänglighet för nedströms analyser.Långvarig vävnadsbehandlingstid kan påverka FAPs livskraft negativt. Om flera exempel bearbetas samtidigt rekommenderas att två operatorer utför protokollet tillsammans för att maximera den isolerade cellens livskraft. Börja med att placera den skördade muskelvävnaden i en steril 10-centimeters cellodlingsfat.Riv försiktigt och hacka vävnaden med tång och ta bort bindväv för att få cirka tre till fyra millimeters kubiserade bitar. Överför minstervävnaden till ett sterilt koniskt rör på 50 milliliter som innehåller sex milliliter DMEM och 1% penicillin-streptomycin. Aktivera sedan 365 mikroliter av kollagenas II-lösningen genom att tillsätta 10 mikroliter av 300-millimolar kalciumkloridlösning.Tillsätt den aktiverade kollagenas II-lösningen till vävnadsslammet för en slutlig koncentration på 250 enheter per milliliter. Inkubera rören i en shaker i en timme och vid 37 grader Celsius vid 240 x g med manuell omrörning var 15: e minut för att lossa vävnad som fästs vid sidan av röret. Efter en timmes inkubation tillsätt 100 mikroliter kollagenas II och 50 mikroliter dispase till provet.Därefter tar pipetten prover 15 till 20 gånger med en serologisk pipett tills lösningen är homogen. Inkubera provet igen i 30 minuter vid 37 grader Celsius och 240 x g med manuell omrörning var 15: e minut. Klipp långsamt muskellösningsproverna genom en 20-milliliter spruta med en 20-gauge nål i 10 cykler.Placera sedan en 40-mikron cellsil på ett sterilt 50-milliliter koniskt rör och blöt det genom att pipettera fem milliliter DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin. Pipettera provet en milliliter i taget genom silen. När hela provet har filtrerats, tvätta cellsilen med DMEM kompletterad med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin för att få den totala provvolymen till 25 milliliter.Dela upp provvolymen lika i två koniska rör på 15 milliliter och centrifugera vid 15 grader Celsius, 400 x g i 15 minuter. Efter centrifugering, aspirera supernatanten och återanvända pelleten i en milliliter RBC lysbuffert vid rumstemperatur i sju minuter. Tillsätt sedan nio milliliter tvättbuffert för att få volymen till 10 milliliter och centrifugera vid 15 grader Celsius, 400 x g i 15 minuter.Efter centrifugering, aspirera supernatanten och resuspend pelleten i en milliliter tvättbuffert. Överför en lämplig volym celler till ett separat 1,5-milliliter mikrocentrifugerör och blanda det med trypanblå färgämne. Räkna levande celler på ett ljusmikroskop med hjälp av en hemocytometer.För flödescytometri, överför en till 2 miljoner celler per experimentellt prov till ett sterilt 1,5-milliliter mikrocentrifugerör. För provvolymen till en milliliter med tvättbuffert och placera röret på is. Ställ in alla kontroller för experimentet.För cellkontroller, alikvot 500 000 till 1 miljon celler i en milliliter tvättbuffert i ett 1,5-milliliter mikrocentrifugerör och placera det på is. Om experimentet utförs för första gången bör enfärgade cellupphängningar också inkluderas. För att ställa in pärlkontroller, tillsätt cirka 150 000 positiva kompensationspärlor till varje märkt 1,5-milliliter centrifugrör.Förbered bärkraftskontrollen genom att överföra hälften av cellvolymen från bärkraftsröret för att uppdatera 1,5 ml mikrocentrifugerör märkt död. Inkubera det döda röret vid 65 grader Celsius i två till tre minuter och placera det sedan på is. Efter inkubationen, återför de döda cellerna till livskraftsröret.Centrifugera encellsupphängningarna, inklusive experimentella prover och kontrollprover vid 500 x g och fyra grader Celsius i fem minuter, och återanvänd cellpelletsen i 100 mikroliter tvättbuffert efter att ha aspirerat supernatanten. Tillsätt antikroppar enligt kontroll- eller experimentellt tillstånd och snärta försiktigt provet för att säkerställa fullständig blandning. Inkubera dem sedan på is i mörkret i 15 minuter.För kompensationspärlor, inkubera röret vid rumstemperatur i mörkret i 15 minuter. Föra upp volymen på varje prov till en milliliter genom att tillsätta 900 mikroliter tvättbuffert till encellsupphängningen och 900 mikroliter PBS för kompensationspärlakontroller. Centrifugera encellsfjädringar vid 500 x g och fyra grader Celsius i fem minuter, och kompensationspärla kontroller vid 300 x g och fyra grader Celsius i fem minuter.Efter centrifugering av proverna, aspirera supernatanten och återanvända cellpelleten i 300 mikroliter tvättbuffert och pärlkontroller i 300 mikroliter PBS och 150 000 negativa kompensationspärlor. Förvara cellproverna på is och pärlprover vid rumstemperatur under aluminiumfolie. Fortsätt med flödescytometriförvärv genom att inrätta gatingstrategin för att identifiera fibro-adipogenic stamceller och myogena föregångare.I den representativa analysen bekräftades framgångsrik konjugation av Sca-1 APC-antikroppen med enkel färgning av kompensationspärlor och cell suspensioner som genererats från friska råtta gastrocnemius muskeln. Fem olika koncentrationer av Sca-1 APC titrerades på encelliga suspensioner, och den optimala koncentrationen av antikroppar identifierades baserat på största fluorescens intensitet med minimal bakgrund färgning. Flöde cytometrisk identifieringar av FAPs och parlamentsledamöter i råtta gastrocnemius utfördes med hjälp av gating strategi visas här.Prover var först gated att utesluta skräp i räkna pärlor. Celler gated sedan för att utesluta dubbningar av både främre spridning och sida spridning egenskaper. Livskraften hos resulterande celler bedömdes genom färgning med SYTOX Blue.SYTOX Blå negativa singlar bedömdes för CD31 och CD45 för att utesluta Lin +fraktioner. Linpopulationen bedömdes. Celler som var enstaka positiva för Sca-1 betecknades FAPs, och celler som var enstaka positiva för VCAM-1 utsågs till parlamentsledamöter.Med co-immunostaining omedelbart efter sortering, visade den nyisolerade populationen av FAPs positiva färgning för PDGFRalpha med ingen förorening av Pax7 positiva celler. Omvänt, den sorterade befolkningen av parlamentsledamöter färgade positivt för Pax7 med en avsaknad av PDGFRalpha-positiva celler. FAPs visat differentierade fibroblaster och adipocyter dag 12 i adipogenic differentiering media med uttryck av fibroblast-specifika protein 1 respektive perilipin 1.Förekomsten av neutrala triglycerider och lipider från mogna adipocyter var uppenbart med olja röd O färgning. Dessutom visade FAPs en förekomst av kollagen typ I och en avsaknad av förorenande myocyter. Parlamentsledamöter odlade i myogena differentiering media på dag 12 visade förekomsten av mogna myocyter och smälta multinukleära myotubes, och var fria från fibroblaster och adipocyt kontaminering.När forskarna använder denna teknik för att isolera levande celler för långsiktig kultur måste de se till att använda aseptisk teknik samtidigt som de arbetar effektivt för att säkerställa god cell livskraft.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulta och embryonala skelettmuskler Microexplant Kultur och Isolering av skelettet muskelceller Stem

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Rening av stamceller från skelettmuskulatur

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

Kartläggning och analys av mus erytroida stamceller med CD71/TER119 Flow-cytometrisk analys

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

En kvantitativ analys av insulin som uttrycker kolonibildande stamfäder

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Förfaranden för råtta<em&gt; In situ</em&gt; Skelettmuskulaturen Kontraktila egenskaper

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypisk analys och isoleringen av murina hematopoietiska stamceller och Linjen-bundna stamfäder

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Isolering och Primär kultur av celler Rat Hepatiska

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

I Intakta Skeletal Muscle Fibers Bedömning av Kalcium Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Isolering och karakterisering av exosomer från skelettmuskulaturfibroblaster

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Isolering av mus megakaryocyt progenitorer

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...