Name: identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat
Uploaded: 2021-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Ottawa Üniversitesi'ndeki Flow sitotmetri Çekirdek Tesisleri'ne ve Keenan Biyomedikal Bilimler Araştırma Merkezi (KRC), St Michaels Hospital Unity Health Toronto'ya bu yazıda sunulan akış sitometrisi/FACS protokolünün optimizasyonundaki uzmanlıkları ve rehberliği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Medicine tarafından Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) tarafından JB'ye finanse edildi.

Bu protokolü yürüten müfettişler yerel hayvan etik kurulu/bakım komitesinden izin almalıdır. Tüm hayvan çalışmaları St. Michael's Hospital Unity Health Toronto Hayvan Bakım Komitesi (ACC #918) tarafından onaylandı ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi (CCAC) tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. Akış sitometrisi iletişim kuralının şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Aşağı akış uygulaması FACS ve sonraki hücre kültürü ise, tüm adı...

Sıçan kası için optimize edilmiş, onaylanmış bir SSS izolasyon protokolü, biyolojik veya teknik nedenlerle farede mümkün olmayan yaralanma modellerini incelemek isteyen araştırmacılar için gereklidir. Örneğin, fareler kronik lokal veya uzun süreli denervasyon gibi nörodejeneratif yaralanmaları incelemek için en uygun hayvan modeli değildir. Biyolojik olarak, farelerin kısa ömrü ve hızlı yaşlanması, yaşlanmanın şaşırtıcı faktöründen denervasyon nedeniyle kas sequalae'yi doğru bir şek...

Fibro-adipojenik progenitör hücreler (FAP'ler), iskelet kasında kas homeostazında, onarımında ve yenilenmesinde kritik rol oynayan ve tersine kas yaralanmasına patolojik yanıtlara aracılık eden yerleşik çok güçlü progenitör hücrelerin bir popülasyonudur. Adından da anlaşılacağı gibi, FAP'ler başlangıçta fibroblastlara ve adipositlere1'e farklılaşma potansiyeline sahip bir ata popülasyonu olarak tanımlandı ve kronik yaralanma ve hastalıkta iskelet kasının fibro-yağlı infiltrasyonunun anahtar arabulucuları olduğu iddia edildi. Daha fazla çalışma, FAP'lerin ek olarak osteogenez ve kondrogenez2,3,4. Bu nedenle, literatürde mezenkimal veya stromal progenitors 3 ,5,6,7,8olarak daha geniş bir şekilde not edilirler. Akut iskelet kası yaralanmasında, FAP'lar, aktif kas uydu hücreleri ve aşağı akış miyojenik progenitörleri (milletvekilleri) meslektaşları1,9,10için elverişli bir ortam sağlamak için geçici olarak çoğalarak rejeneratif miyogenezde dolaylı olarak yardımcı olur. Başarılı rejenerasyona paralel olarak, FAP'lar apoptoz geçirir ve sayılarını temel düzey 1 ,9,10,11'e döndürür. Buna karşılık, kronik kas yaralanmasında, FAP'ler pro-apoptotik sinyalleri geçersiz kılar, bu dakalıcılıkları 9,10,11 ve anormal kas onarımı ile sonuçlanır.
FAP'lerin kas yanıtlarına aracılık ettiği hücresel ve moleküler mekanizmaları değerlendiren in vivo çalışmalar bugüne kadar 1,7 , 9 ,10,11,12,13,14. Genetik olarak tasarlanmış fareler bu analizlerde kullanılmak üzere güçlü araçlar olsa da, hayvanın küçük boyutu, travmatik denervasyon gibi kas atrofisinin derin olabileceği uzun süreli lokalize yaralanma modellerinde çalışmak için doku kullanılabilirliğini sınırlar. Ayrıca, kas gücü ve fiziksel fonksiyon ölçümü, farenin sonlandırılmasını gerektiren ex vivo veya yerinde ölçümler veya kas kontrtilyon performansının değerlendirilmesine izin vermek için cerrahi ve / veya genel anestezi gerektiren in vivo yöntemler gerektirir15,16,17,18,19,20 . Sıçanlarda, iyi doğrulanmış ve küresel olarak kullanılan kas fonksiyonel analizleri, yürüyüş analizi (örneğin, Siyatik Fonksiyon İndeksi, CatWalk analizi) gibi daha karmaşık motor davranışları için analizlere ek olarak mevcuttur ve uyanık ve kendiliğinden hareket eden hayvanlarda 21 ,22,23,24 . Bu ayrıca hayvan deneylerinde minimum morbidite ilkelerini ve kullanılan araştırma hayvanlarının sayısını optimize eder. Sıçan böylece FAP araştırmacısına protein ve hücresel analizler için daha fazla yaralı kas hacminin ek esnekliğini ve uyarı hayvanında kas kompleksi statik ve dinamik fonksiyonel aktivite ve davranışların seri değerlendirmelerini yapma yeteneğini sağlar.
SSS'ler öncelikle akış sitometrisi ve Floresan ile aktive hücre sıralama (FACS) kullanılarak tüm kas örneklerinden tanımlanmış ve izole edilmiştir. Bunlar, boyut, parçalılık ve hücre yüzeyi veya hücre içi belirteçlerin belirli bir kombinasyonu gibi karakteristik özelliklere göre birden fazla spesifik hücre popülasyonu tanımlayabilen lazer tabanlı tahlillerdir25. Homeostaz ve rejenerasyon çok sayıda hücre tipi tarafından koordine edilen karmaşık, çok yönlü süreçler olduğu için iskelet kası gibi bir organ sisteminin çalışmasında bu oldukça avantajlıdır. Ufuk açıcı bir çalışma, fare iskelet kasında akış sitometrik yöntemlerini kullanarak FAP'ların yanı sıra milletvekillerini tanımladı1. FAP'lerin doğada mezenkimal olduğunu gösterdiler. endotel (CD31), hematopoetik (CD45) veya miyojenik (Integrin-α7 [ITGA7]) kökenlerinden hücrelere özgü yüzey antijenlerinden yoksun oldukları için, ancak mezenkimal kök hücre işaretleyicisi Sca-1 (Kök hücre antijeni 1)1'i ifade ettiler ve kültürde fibrojenik ve adipojenik hücrelere farklılaştılar. Diğer çalışmalar, alternatif bir kök hücre belirteci, trombosit türevi büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRα)2,7,8 ve daha fazla analiz ifadesine dayanarak kastaki mezenkimal progenitörlerin başarılı bir şekilde izole edildiğini göstermiştir. SP'ler artık akış sitometrisinde Sca-1 veya PDGFRα pozitif seçim işaretçisi 1 , 9,10,11,12,13,14,26, 27,28,29,30,31kullanılaraktanımlanır. . PDGFRα kullanımı insan dokusu için tercih edilir, ancak murine Sca-1'in doğrudan bir insan homologu henüz tanımlanmıştır32. Ek olarak, diğer hücre yüzey proteinleri milletvekillerinin belirteçleri olarak bildirilmiştir (örneğin, VCAM-1), SSS izolasyonu sırasında miyojenik soy hücrelerinin bir göstergesi olarak ITGA7'ye potansiyel bir alternatif sağlar33.
Akış sitometrisi/FACS iskelet kası 1 , 9 , 10,11 ,13,29'dakiFAP'lerin rolünü ve patojenik potansiyelini incelemek için güçlü bir metodoloji olsa da, teknik olarak gerekli reaktiflerinin özgüllüğü ve optimizasyonu ile sınırlıdır. Akış sitometrik tanımlaması ve SSP'lerin izolasyonu fare hayvan modelleri 1 , 9,10,11,29'da geliştirildiği ve yürütüldüğünden, bu diğer model organizmalarda SP'leri incelemek isteyen araştırmacılar için zorluklar doğurur. İşlenecek optimal doku büyüklüğü, reaktif ve/veya antikor özgüllüğü ve kullanılabilirliği gibi birçok faktör kullanılan türlere bağlı olarak farklılık gösterir.
Yeni bir hayvan modelinde SSS'lerin incelenmesinin önündeki teknik engellere ek olarak, genellikle kas içi kimyasal enjeksiyon veya kardiyotoksin yoluyla akut, toksik bir ortamda çalışılmıştır. FAP'lerin uzun vadeli dinamiklerinin değerlendirilmesi öncelikle Duchenne'in kas distrofisinde, mdx fare modeli9, 10,11kullanılarak ve omuz kas yapısında eşzamanlı tendon transeksiyonu ve denervasyonun yapıldığı masif rotator manşet yırtığı gibi kombinasyon kas yaralanması modelleri ile sınırlıdır26,27,28 . FAP'lerin, ağır sanayi, tarım ve doğum travmalarında (brakial pleksus yaralanması)34, 35,36,37'de önemli morbidite ile iş yeri kazalarında sık görülen kronik travmatik denervasyonun tek hakaretine yanıtı, genellikle kısa süreli bir zaman dilimi11,38ile sınırlı olarak karakterize edilmiştir.
Sıçandaki sağlıklı ve ciddi atrofik ve fibrotik iskelet kasından FAP'ları ve milletvekillerini tanımlamak ve izole etmek için bir yöntem tarif ediyoruz. İlk olarak, doku sindirimi ve akış sitometrisi boyama protokolü kullanılarak CD31-/CD45-/VCAM-1- SCAP'ler ve CD31-/CD45-/Sca-1-1+ milletvekillerinin tanımlanması ve daha sonra bulgularımızın doğrulanması, FACS izole edilmiş hücrelerin kültür ve immünositokimyasal lekeleme yoluyla gerçekleştirilir. Bu yöntemi kullanarak, sıçanda uzun süreli izole denervasyon yaralanması modelinde yeni bir FAP zaman kursu da bildiriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well cell culture plate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>130185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm glass coverslips, No.2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>91014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 gauge needle</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>305176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25mL Serological pipette</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>86.1685.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40&#181;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL centrifuge tubes</td>
			<td>FroggaBio</td>
			<td>TB50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Beads&#160;</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Chloride, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>AMC303.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Conjugation Kit, 50-100&#181;g</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquatex Aqueous Mounting Medium</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biolaminin 411 LN</td>
			<td>Biolamina</td>
			<td>LN411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>ALB001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>CCL444.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Plus Absolute Counting Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>C36995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>(+)4.5 g/L D-Glucose 
			(+)L-Glutamine 
			(+)110 mg/L Sodium Pyruvate
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSClean Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSDiva Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSRinse Solution</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>340346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometry Sheath Fluid</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>342003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowJo Software</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Mounting Medium</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit Alexa Fluor 555 secondary antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#39;s F10 Media</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>11550043</td>
			<td>(+) Phenol Red 
			(+) L-Glutamine 
			(-) HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS) (1X)</td>
			<td>Multicell</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Reichert</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Transforming Growth Factor &#946;1 (hTGF-&#946;1)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8915LF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humulin R</td>
			<td>Lilly</td>
			<td>HI0210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Also known as 3-Isobutyl-1-methylxanthine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9516</td>
			<td>Also known as 2-propanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lewis Rat, Female</td>
			<td>Charles River Kingston</td>
			<td>004 (Strain Code)</td>
			<td>200-250 grams used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa X-20 Benchtop Cytometer</td>
			<td>Beckton Dickenson</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP Cell Sorter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD31::FITC Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab33858</td>
			<td>Clone TLD-3A12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD45::FITC Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>202205</td>
			<td>Clone OX-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-CD106::PE Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>200403</td>
			<td>Also known as VCAM-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-MHC Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Also known as MF20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Anti-Pax7 Antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neutral Buffered Formalin, 10 %</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oil Red O</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Conjugation Kit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab102903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td>(-)Calcium Chloride 
			(-)Magnesium Chloride
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Bicarbonate, Reagent Grade</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>PBC401.250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Fibroblast Specific Protein 1 (FSP-1) Antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA5-32347</td>
			<td>FSP-1 also known as S100A4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Integrin-a7 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Laminin Antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Perilipin-1 Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Sca-1 Antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB4336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-Collagen Type I Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab260043</td>
			<td>Also known as Col1a1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Recombinant Anti-PDGFR Alpha Antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab203491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHG0266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Troglitazone</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T2573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>TWN510</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (faps) and myogenic progenitors (mps) in skeletal muscle in the rat

Fibro-adipojenik Progenitors (FAP'lar), miyojenik progenitörler (milletvekilleri) ile birlikte kas homeostazında, yaralanmada ve onarımda önemli bir rol oynayan iskelet kasında yerleşik interstisyel hücrelerdir. SSS tanımlama ve izolasyon kullanım akış sitometrisi/floresan-aktif hücre sıralama (FACS) için mevcut protokoller ve bugüne kadar in vivo işlevlerini değerlendiren çalışmalar sadece farelerde yapılmıştır. Sıçanın daha büyük doğal boyutu, iskelet kası yaralanma modellerinde, özellikle ciddi atrofik kaslarda veya araştırmacılar birden fazla aşağı akış testi yapmak için önemli doku kütlesine ihtiyaç duyarsa, FAP'lerin daha kapsamlı bir analizini sağlar. Sıçan ayrıca hayvan sedasyonu veya fedakârlık gerektirmeyen daha geniş bir kas fonksiyonel tahlil seçimi sağlar, böylece seri değerlendirmeleri etkinleştirerek morbidite ve hayvan kullanımını en aza indirir. Fareler için optimize edilen akış sitometrisi / FACS protokolleri, özellikle piyasada bulunan antikorların özellikleri ile sınırlı olan türlere özgüdür. SSS'leri sıçan veya yüksek fibrotik kastan ayırmak için optimize edilmediler. CD31, CD45, Sca-1 ve VCAM-1 yüzey belirteçlerinin diferansiyel ekspresyonlarına dayanarak, HEM sağlıklı hem de denervatlı sıçan iskelet kasından FAP'lerin ve milletvekillerinin tanımlanması ve izolasyonu için bir akış sitometrisi / FACS protokolü geliştirilmiştir. Sıçana özgü, akış sitometrisi doğrulanmış primer antikorlar ciddi şekilde sınırlı olduğundan, Sca-1'i hedefleyen antikorun şirket içi konjugasyonu yapıldı. Bu protokol kullanılarak, başarılı Sca-1 konjugasyonu onaylandı ve FAP'lerin ve milletvekillerinin akış sitometrik tanımlaması hücre kültürü ve FACS izole EDILMIŞ SSP'lerin ve milletvekillerinin immünostainasyonu ile doğrulandı. Son olarak, uzun süreli (14 haftalık) bir sıçan denervasyon modelinde yeni bir FAP zaman kursu bildiriyoruz. Bu yöntem, araştırmacılara yeni bir hayvan modelinde SSS inceleme olanağı sağlar.

Sca-1 ve VCAM-1 dahil olmak üzere yeni bir antikor paneli kullanarak akış sitometrisi yoluyla FAP'ları ve milletvekillerini tanımlama Sıçan kasındaKI FAP'ları tanımlamak için gating stratejisi, CD31 (endotel) ve CD45 (hematopoetik) pozitif hücrelere (soy [Lin] olarak adlandırılan) kapı olan fare29'dakiakış sitometri protokollerine dayanır ve Sca-1 ve milletvekillerinin linage-negatif (Lin-) popülasyonundan I...

Watch this Scientific Journal Video about Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat at JoVE.com

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

Bu protokol, Fibro-adipojenik progenitörleri (FAP'ler) ve miyojenik progenitörleri (milletvekilleri) sıçan iskelet kasından izole etmek için bir yöntemi özetlemektedir. Sıçanın kas yaralanması modellerinde kullanılması, analiz için atrofik kastan doku mevcudiyetinin artmasını ve serbest hareket eden hayvanlarda kas gücünü ve yürüyüşlerini değerlendirmek için doğrulanmış yöntemlerden oluşan daha büyük bir repertuar sağlar.

Sıçandaki İskelet Kasında Fibro-Adipojenik Progenitörlerin (FAP' ler) ve Miyojenik Progenitörlerin (Milletvekilleri) Tanımlanması, İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

FAP'ler kas yenilenmesi ve patolojik fibrozisin aracıları olduğundan, protokolümüz FAP dinamiklerinin kas yaralanması sonrası karakterizasyonuna ve in vitro veya ex vivo çalışmalar için FAP'lerin izolasyonuna izin verir. Bugüne kadar, çalışmalar sadece farelerden izole edilmiş SSP'ler üzerinde gerçeklenmiştir. Protokolümüz, FAP'lerin daha büyük sıçandan etkili bir şekilde izole edilmesini sağlayarak aşağı akış tahlilleri için çok daha fazla doku kullanılabilirliği sağlar.Uzun doku işleme süresi FAP'lerin canlılığını olumsuz yönde etkileyebilir. Birden çok örnek aynı anda işleniyorsa, yalıtılmış hücre canlılığını en üst düzeye çıkarmak için iki işlecin protokolü birlikte gerçekleştirmesi önerilir. Hasat edilen kas dokusunu steril 10 santimetrelik bir hücre kültürü kabına yerleştirerek başlayın.Yaklaşık üç ila dört milimetre küplü parçalar elde etmek için dokuyu hafifçe yırtın ve toparlayıp aşındırın ve bağ dokusunu çıkarın. Minster dokusunu altı mililitre DMEM ve%1 penisilin-streptomisi içeren steril 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Daha sonra, 300 milimoler kalsiyum klorür çözeltisinin 10 mikrolitresi ekleyerek 365 mikrolitre kollajenaz II çözeltisi aktive edin.Mililitre başına 250 birimlik son konsantrasyon için aktif kollajenaz II çözeltisini doku bulamacına ekleyin. Tüpleri bir saat boyunca bir çalkalayıcıda ve 240 x g'da 37 santigrat derecede, tüpün yanına yapışmış dokuyu yerinden çıkarmak için her 15 dakikada bir manuel ajitasyonla kuluçkaya yatırın. Bir saatlik inkübasyondan sonra, numuneye 100 mikrolitre kollajenaz II ve 50 mikrolitre dispaz ekleyin.Daha sonra pipet, çözelti homojen olana kadar serolojik pipet ile 15 ila 20 kez numuneler. Numuneyi 37 santigrat derecede 30 dakika ve her 15 dakikada bir manuel ajitasyonla 240 x g tekrar kuluçkaya yatırın. Kas çözeltisi örneklerini 10 döngü boyunca 20 kalibrelik bir iğne ile 20 mililitrelik bir şırıngadan yavaşça yamyun.Daha sonra steril 50 mililitrelik konik bir tüpe 40 mikron hücreli bir süzgeç yerleştirin ve %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş beş mililitre DMEM pipetleme ile ıslatın. Pipet örneği süzgeçten birer mililitre. Numunenin tamamı filtrelendikten sonra, toplam numune hacmini 25 mililitreye çıkarmak için hücre süzgecini %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM ile yıkayın.Numune hacmini eşit olarak iki 15 mililitrelik konik tüpe bölün ve 15 santigrat derecede santrifüj, 15 dakika boyunca 400 x g. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin ve peletin oda sıcaklığında yedi dakika boyunca bir mililitre RBC liziz tamponunda yeniden depolayın. Ardından, hacmi 10 mililitreye ve santrifüjü 15 santigrat derecede, 15 dakika boyunca 400 x g'a getirmek için dokuz mililitre yıkama tamponu ekleyin.Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı aspire edin ve peletin bir mililitre yıkama tamponunda yeniden dirildi. Uygun miktarda hücreyi ayrı bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve trippan mavi boya ile karıştırın. Hemositometre kullanarak canlı hücreleri hafif bir mikroskopta sayın.Akış sitometrisi için, deneysel numune başına bir ila 2 milyon hücreyi steril 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Numune hacmini yıkama tamponu ile bir mililitreye getirin ve tüpü buza yerleştirin. Deneme için tüm denetimleri ayarlayın.Hücre kontrolleri için, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde bir mililitre yıkama tamponunda aliquot 500,000 ila 1 milyon hücre ve buza yerleştirin. Deney ilk kez yapılıyorsa, tek lekeli hücre süspansiyonları da dahil edilmelidir. Boncuk kontrolleri kurmak için, etiketli her 1,5 mililitre santrifüj tüpüne yaklaşık 150.000 pozitif kompanzasyon boncuk ekleyin.Ölü etiketli 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpünü yenilemek için hücre hacminin yarısını canlılık tüpünden aktararak canlılık kontrolünü hazırlayın. Ölü tüpü 65 santigrat derecede iki ila üç dakika kuluçkaya yatırın, sonra buza yerleştirin. Kuluçkadan sonra, ölü hücreleri canlılık tüpüne geri verin.500 x g ve dört santigrat derecedeki deneysel ve kontrol örnekleri de dahil olmak üzere tek hücreli süspansiyonları beş dakika boyunca santrifüjleyin ve üst kısmı arzu ettikten sonra hücre topaklarını 100 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden canlandırın. Kontrol veya deneysel duruma göre antikorlar ekleyin ve tam karıştırma sağlamak için numuneyi hafifçe hareket ettirin. Sonra, onları 15 dakika boyunca karanlıkta buzda kuluçkaya yatırın.Telafi boncukları için, tüpü oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika kuluçkaya bırakın. Tek hücreli süspansiyona 900 mikrolitre yıkama tamponu ve kompanzasyon boncuk kontrolleri için 900 mikrolitre PBS ekleyerek her numunenin hacmini bir mililitreye getirin. Beş dakika boyunca 500 x g ve dört santigrat derecede tek hücreli süspansiyonları santrifüjleyin ve beş dakika boyunca 300 x g ve dört santigrat derecede boncuk kontrollerini telafi edin.Numunelerin santrifüjlenmesinden sonra, süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 300 mikrolitre yıkama tamponunda ve boncuk kontrollerini 300 mikrolitre PBS ve 150.000 negatif kompanzasyon boncukunda yeniden diriltin. Hücre örneklerini buz ve boncuk örneklerini oda sıcaklığında alüminyum folyo altında tutun. Fibro-adipojenik progenitörleri ve miyojenik progenitörleri tanımlamak için gating stratejisini belirleyerek akış sitometrisi alımına devam edin.Temsili analizde, Sca-1 APC Antikorunun sağlıklı sıçan gastrocnemius kasından üretilen kompanzasyon boncuklarının ve hücre süspansiyonlarının tek lekelenmesi ile başarılı bir şekilde konjugasyonu doğrulandı. Tek hücreli süspansiyonlarda beş farklı Sca-1 APC konsantrasyonu titratlandı ve en az arka plan boyama ile en büyük floresan yoğunluğuna dayanarak en uygun antikor konsantrasyonu belirlendi. Sıçan gastrocnemius'taki FAP'ların ve milletvekillerinin akış sitometrik tanımlamaları burada gösterilen gating stratejisi kullanılarak gerçekleştirildi.Örnekler ilk olarak boncuk saymadaki kalıntıları dışlamak için kapılandı. Hücreler daha sonra hem ön dağılım hem de yan dağılım özelliklerine göre çiftleri dışlamak için kapılıydı. Elde edilen hücrelerin canlılığı SYTOX Blue ile boyanarak değerlendirildi.SYTOX Mavi negatif singlet'lar LIN+fraksiyonları hariç tutmak için CD31 ve CD45 için değerlendirildi. Lin popülasyonu değerlendirildi. Sca-1 için tek pozitif olan hücreler FAP'ler, VCAM-1 için tek pozitif olan hücreler ise milletvekilleri olarak belirlendi.Sıralamadan hemen sonra birlikte immünostaining ile, yeni izole edilmiş SSS popülasyonu, Pax7 pozitif hücreleri tarafından kontaminasyon olmadan PDGFRalpha için pozitif boyama gösterdi. Tersine, sıralanmış milletvekili nüfusu, PDGFRalpha pozitif hücrelerinin yokluğuyla Pax7 için pozitif olarak lekelendi. FAP'lar sırasıyla fibroblast spesifik protein 1 ve perilipin 1 ekspresyasyonu ile adipojenik farklılaşma medyasında 12. günde farklılaşmış fibroblastlar ve adipositler göstermiştir.Olgun adipositlerden nötr trigliseritlerin ve lipitlerin varlığı Oil Red O lekeleme ile belirgindi. Ek olarak, FAP'lar kollajen tip I'in varlığını ve kirletici miyositlerin yokluğunu gösterdi. 12. günde miyojenik farklılaşma medyasında yetişen milletvekilleri olgun miyositlerin ve kaynaşmış çok renkli miyotüplerin varlığını gösterdiler ve fibroblastlar ve adiposit kontaminasyonundan kurtuldular.Bu tekniği uzun süreli kültür için canlı hücreleri izole etmek için kullanırken, araştırmacılar iyi hücre canlılığını sağlamak için aynı anda verimli bir şekilde çalışırken aseptik tekniğin kullanılmasını sağlamalıdır.

Research

JoVE Journal

Biology

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

CD71/TER119 Flow-sitometrik Testi kullanarak Fare eritro-id progenitörlerin Tanımlama ve Analiz

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

İnsülin ifade Koloni oluşturan atalarıdır için Kantitatif Testi

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Rat Prosedürleri<em&gt; In situ</em&gt; İskelet Kası Kontraktil Özellikleri

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Sıçan Karaciğer Hücreleri İzolasyon ve İlköğretim Kültür

Primary hepatocyte culture is a valuable tool that has been extensively used in basic research of liver function, disease, pathophysiology, pharmacology ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Fare Megakaryosit Progenitors İzolasyonu

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...